gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비
2009년 7월 2일
특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.
이 비디오 프로토콜에서는 폐 조직 해리 후 gentle max를 사용하여 성체 마우스 폐 조직을 해리하는 방법을 볼 수 있습니다. 콜라겐분해효소 d 및 DNA가 있는 경우 70미크론 세포 스트레이너 원심분리기를 사용하여 단일 세포 현탁액을 여과하고 추가 응용 분야를 위해 현탁합니다. 안녕하세요, 저는 독일 Mil Biotech의 Melanie Mlu입니다.
오늘은 GenX 해리를 사용하여 쥐의 폐 조직에서 단세포 현탁액을 준비하기 위한 재현 가능하고 자동화된 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 백혈구 또는 내피 세포의 준비를 위한 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 자, 시작하겠습니다.
프로토콜을 시작하기 전에 몇 가지 표준 솔루션을 준비하고 준비해야 합니다. 먼저 Hebes 버퍼가 필요합니다. 둘째, 밀리리터당 100mg의 효소와 헤베스 완충액을 함유한 콜라겐분해효소 D 용액을 포함한다.
셋째, 20, 밀리리터 dase 1 당 000 단위를 포함하는 dase 1 솔루션. 마지막으로 두 가지 일반적인 버퍼링 솔루션이 있습니다. pH 7.2에서 일반적인 PBS 버퍼와 AutoMax 헹굼 용액 및 BSA 원액에서 파생된 PEB 버퍼.
우리는 6-7주 된 암컷 생검 마우스에서 유래한 절개된 폐로 프로토콜을 시작합니다. 폐에 심장과 흉선, 원심성 및 구심성 혈관, 기관 및 결합 조직과 같은 인접 기관이 없는지 확인하십시오. 적혈구를 제거하기 위해 PBS가 함유된 페트리 접시에 조직을 헹굽니다.
일반적으로 이 나이의 쥐 폐의 무게는 110에서 150mg 사이입니다. 나이가 많은 동물이나 다른 쥐 균주의 폐를 연결할 계획이라면 조직과 완충액의 무게를 측정하십시오. 튜브 1개당 최대 450mg의 조직을 해리할 수 있습니다.
폐 조직을 4.9ml의 heis 완충액이 들어 있는 부드러운 최대 C 튜브로 옮깁니다. 100마이크로리터의 콜라겐분해효소 D 용액을 최종 농도인 밀리리터당 2mg을 폐 조직과 완충액에 추가합니다. 이제 10 마이크로 리터가 다릅니다.
150mg 이상의 조직을 위한 하나의 솔루션. 20 마이크로 리터 dase 하나의 솔루션을 추가합니다. C 튜브가 단단히 닫혀 있는지 확인하고 부드러운 최대 디스에 거꾸로 놓습니다.
조직이 로터와 고정자 사이에 있는지 확인하십시오. 폐 프로그램을 선택하고 프로그램이 종료되면 시작 버튼을 눌러 실행하십시오. 기기에서 C 튜브를 제거하고 샘플을 30분 동안 배양합니다.
배양 중 섭씨 37도의 인큐베이터에서 튜브는 max mix tube rotator를 사용하여 회전하거나 5분마다 수동으로 돌려야 합니다. 배양 후 C 튜브를 gentle max Associator로 되돌리고 두 번째 폐 프로그램을 실행합니다.프로그램이 실행되는 동안 캡을 70마이크로미터 메쉬 세포 여과기로 교체하여 여과된 세포를 수집하기 위한 50ml 튜브를 준비합니다. 해리된 프로그램이 종료되면 튜브의 시료 분포에 따라 시료를 집중시키기 위해 튜브를 잠시 원심분리할 수 있습니다.
해리된 세포는 C 튜브의 격막 밀봉 캡을 통해 피펫팅하여 튜브에서 제거할 수 있습니다. 적절한 1000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 세포 현탁액을 세포 여과기에 적용하여 더 큰 입자 또는 응집체를 제거합니다. 용액이 배출되면 5ml의 실온과 hees 버퍼를 추가하여 여과된 세포를 펠릿화하여 셀 스트레이너를 세척합니다.
50ml 튜브를 300GS에서 10분 동안 원심분리합니다. 이제 상등액을 흡인하고 세포 펠릿을 원하는 부피의 실온에 재현탁시킵니다. PEB 버퍼.
상층액을 기울이지 마십시오. 이제 다운스트림 애플리케이션으로 진행할 수 있습니다. 이 절차를 사용하여 마우스 폐 조직을 해리하면 생존 가능한 백혈구 및 내피 세포의 비율이 높아집니다.
유래된 단세포 현탁액을 CD 45 PE를 CD1 46 FITC 또는 CD 31 FITC로 염색하고 유세포 분석으로 분석했습니다. 이 플롯은 CD 11 C 마이크로비드, 미니맥스 분리기 및 2개의 MS 컬럼을 사용한 수지상 세포의 농축을 보여줍니다. 그래. 방금 gentle mix dissociation 및 C tube를 사용하여 표준화된 방식으로 마우스 폐 조직에서 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여드렸습니다.
이 방법은 효율적이고 gen 조직 해리를 허용합니다. 이 절차를 수행할 때 폐를 적절하게 절개하고 절제 직후 조직을 처리하는 것이 중요합니다. 그런 다음 준비된 단일 세포 현탁액을 추가 실험에 사용할 수 있습니다.
예를 들어, 세포의 자기 표지, 그리고 백혈구 또는 내피 세포의 분리. 좋아요, 그게 다입니다. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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개요
본 비디오 프로토콜은 gentleMACS dissociator를 사용하여 성체 마우스 폐 조직을 해리하는 방법을 보여줍니다. 이 절차는 후속 응용 연구를 위해 생존력이 있고 배양이 가능한 다량의 세포를 얻을 수 있도록 설계되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 해리 기술
- 단일 세포 현탁액 준비
- 마우스 폐 조직 분석
배경
- 조직에서 세포를 분리하려면 특정 파라미터가 필요합니다.
- gentleMACS 분리기는 최적화된 프로토콜을 제공합니다.
- 분리 과정에는 Collagenase D와 DNase가 사용됩니다.
- 필터링된 세포 현탁액을 준비하여 후속 응용 단계에 사용합니다.
연구 목적
- 단일 세포 현탁액을 준비하는 재현 가능한 방법을 입증하기 위함입니다.
- 백혈구 및 혈관 내피세포 연구를 용이하게 하기 위함입니다.
- 해당 분야의 연구자들에게 실용적인 프로토콜을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 조직 교반을 위한 gentleMACS dissociator 사용.
- 해리 과정 중 collagenase D 및 DNase 적용.
- 70 micron 셀 스트레이너를 통한 세포 현탁액 여과.
- 추후 응용을 위한 세포 원심분리 및 현탁.
주요 결과
- 마우스 폐 조직의 성공적인 단일 세포 현탁액 분리.
- 높은 수의 생존 가능한 배양 세포 확보.
- 프로토콜의 재현성 및 효율성 입증.
- 후속 응용 분석에 적합한 시료 준비.
결론
- gentleMACS 해리기는 폐 조직 해리에 효과적입니다.
- 이 방법은 다양한 조직 유형에 적용할 수 있습니다.
- 폐 조직을 연구하는 연구자들에게 가치 있는 도구를 제공합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
표준화된 조직 해리는 면역학 및 혈관 생물학 연구에서 매우 중요한 전처 단계로, 후속 분석을 위한 일차 세포 현탁액을 재현성 있게 준비할 수 있게 해줍니다. gentleMACS Dissociator는 마우스 폐 조직으로부터 생존율이 높은 단일 세포 현탁액을 생성하기 위한 자동화되고 완만하며 확장 가능한 방법을 제공하여, 유세포 분석, 세포 분류 및 분자 프로파일링을 위한 일관된 입력값을 지원합니다. 이러한 기능은 실험 간 세포 수득률과 생존율의 변동성을 줄임으로써 표적 검증 연구의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 표적 가설 검증을 위해 폐 조직 내 백혈구 및 혈관 내피 세포 집단의 조사를 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 조직 처리 과정에서의 수동 변동성을 줄여, 실험실 간 및 시점 간 재현성을 향상시킵니다.
- 예측적 가치: 유세포 분석 및 소팅을 위한 일관된 세포 입력을 지원하여, 표현형 스크리닝 결과에 대한 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 항체 염색 및 유세포 분석 기반 분석에 적합한, 찌꺼기가 없는 여과된 현탁액을 생성합니다.
- 운용적 가치: 표준화된 효소 소화 및 기계적 해리를 통해 세포 수득량의 배치 간 일관성을 보장합니다.
- 분석 준비도: 자기 라벨링 및 세포 분리와 같은 후속 응용 단계와 호환되는 현탁액을 생성합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: 폐 조직 내 면역 및 혈관 세포 동태를 연구하기 위한 질병 관련 시스템을 제공합니다.
- 전임상 모델 지원: 마우스 폐에서 일차 세포를 분리하여 치료 표적의 기전적 리스크를 완화할 수 있게 합니다.
- 리스크 조정 기반의 진전: 신뢰할 수 있는 세포 준비 과정은 전임상 워크플로우에서 일관된 바이오마커 분석과 기능 검증을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
gentleMACS Dissociator는 조직 채취와 세포 분석 사이의 표준화된 시료 준비 단계로서 연구 워크플로우에 적용되며, ex vivo 조직에서 분석 가능한 단일 세포로의 안정적인 전환을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 경로 분석을 위해 폐에 상주하는 면역 및 기질 세포의 가설 기반 분리를 지원합니다.
- 스크리닝: 면역 조절제의 고함량 또는 유세포 분석 기반 표현형 스크리닝을 위해 재현 가능한 세포 현탁액을 제공합니다.
- 분석: 실험 조건 비교를 위해 정량적 유세포 분석 판독값(예: CD45+, CD31+)을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 표준화된 준비 과정을 통해 마우스 폐 모델을 인간 관련 면역 및 내피 세포 연구와 연결합니다.
- 기업적 재사용: 기기에 사전 프로그래밍된 폐 프로토콜을 통해 폐 염증, 섬유화 또는 감염을 연구하는 여러 프로젝트에서 재사용이 가능합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 백혈구와 혈관 내피세포의 높은 생존율 및 순도는 후속 응용 단계에서의 데이터 품질을 향상시킵니다.
- 운용적 가치: 자동화를 통해 조직 해리 과정에서 소요되는 수작업 시간과 사용자 간의 변동성을 줄일 수 있습니다.
- 전략적 가치: 일관된 세포 수득률 및 생존율 지표를 바탕으로 진행 여부(go/no-go)를 결정할 수 있게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 검증을 위한 신뢰할 수 있는 일차 세포 입력을 제공함으로써, 리스크가 조정된 타겟 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 무균 조직 박리 및 효소 처리 교육이 필요합니다.
- 폐 특이적 프로그램과 C 튜브가 포함된 gentleMACS Dissociator의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 사용자 간 효소 농도(Collagenase D, DNase) 및 완충액 조건의 표준화가 필요합니다.
- 조직 밀도에 영향을 주는 마우스 계통, 연령 또는 질환 모델에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 효소적 해리가 가능한 조직으로 제한되며, 섬유성 또는 석회화된 샘플의 경우 기계적 방법이 필요할 수 있습니다.
