Name: 마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-07T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 조직에서 gentleMACS Dissociator를 이용한 단일 세현탁액 제작 방법을. 세포 생존율과 표면 항원을 보존하여 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

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무균 조건 하에서 해결하려면, 그것은 층류 후드의 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 1. 자료 <ul><li> 신경 조직 분리 키트 (P) (구성 : 솔루션 1,2, 3, 4, 스토리지 버퍼) </li><li> 사전 분리 필터 </li><li> (선택 사항) Myelin 제거 비즈 </li><li> 베타 - 메르 캅 토 에탄올 </li><li> gentleMACS Dissociator </li><li> C 튜브 </li><li> MACSmix 튜브의 회전 </li><li> HBSS (W / O) </li><li> HBSS (W) </li></ul><ol><li> 이전 프로토콜을 시작하려면 다음 솔루션을 준비 : <ol><li> 이가의 양이온없이 행크스 '버퍼 소금 솔루션 칼슘 2 + 또는 MG 2 + (HBSS (W / O) </li><li> HBSS, 표준, 즉 칼슘 2 +와 MG 2 + (HBSS (W) </li></ol></li><li> 이후 애플 리케이션에 대한 관심의 항원 에피토프에 따라 중 Papain 기반의 신경 조직 분리 키트 (P) 또는 트립신 기반의 신경 조직 분리 키트 (T)를 사용합니다. </li><li> 신경 조직 분리 키트에서 다음 솔루션을 준비 : <ol><li> 해결 방법 2 : 0.067 mm까지 베타 메르 캅 토 에탄올을 추가 </li><li> 솔루션 4 : 0.7 ML 저장소 버퍼 (키트에서 제공)에 분말을 용해, 부드럽게 (소용돌이하지 않음) 믹스 </li><li> 효소 배합 1 : C 튜브와 10-15 분 부화에 피펫 1.9 ML 솔루션이 50 μl 솔루션 1 (키트에서 모두) 37 ° C. 이것은 뇌 조직을 떼어 놓다 400 밀리그램하기에 충분합니다. </li></ol></li></ol> 2. 신경 조직을 Dissociating <ol><li> 1 ML HBSS (W / O)이있는 튜브의 뇌 조직을 달다 </li><li> preheated 효소 혼합 1 1,950 μL를 포함하는 C 튜브에 마우스 머리를 전송합니다. (참고 :이 프로토콜은 ≤ 400 밀리그램에 대한 기록이지만, 솔루션 볼륨 C 튜브마다 뇌 조직의 1600 MG 최대 수용 확장할 수 있습니다) </li><li> gentleMACS의 Dissociator에 C 튜브를 삽입하고 프로그램 "m_brain_01"를 실행합니다. </li><li> 37 15 분에 대한 회전 (MACSmix 튜브의 회전을 사용하여 4 RPM)를 품어 ° C. </li><li> gentleMACS의 Dissociator에 C 튜브를 삽입하고 프로그램 "m_brain_02"를 실행합니다. </li><li> 분리 단계 동안 부드럽게 솔루션 솔루션 3 사 10 μl 20 μl를 혼합하여 조직의 400 밀리그램 당 효소 혼합이 30 μl를 준비합니다. </li><li> 심장 - 봉인 캡을 통해 C 튜브에 효소 혼합 2 추가하고 vortexing없이 부드럽게 섞는다. </li><li> 37 C 튜브 10 분에 대한 회전 ° 배양기에서 C를 품어. </li><li> gentleMACS의 Dissociator에 C 튜브를 삽입하고 프로그램 "m_brain_03"를 실행합니다. </li><li> 37 C 튜브 10 분에 대한 회전 ° 배양기에서 C를 품어. </li><li> 튜브의 하단에있는 샘플을 수집하기 위해 간단히 원심 분리기. </li></ol> 3. 여과법 <ol><li> 관심의 세포 통로를 허용하도록 필터 큰만큼을 선택합니다. 예를 들어, Purkinje 세포는 30 μm의 필터를 통과하기에는 너무 큰 있지만, Prominin - 1 + 세포는 것입니다. </li><li> 세포를 제거하는 suitable1000 μl 피펫을 사용 심장 - 봉인 캡을 통해 C 튜브를 형성하고 15 ML 수집 관의 사전 분리 필터를 적용해야합니다. (참고 : 큰 샘플 크기는 50 ML 수집 관을 사용하는 경우). </li><li> HBSS (W) 10 ML과 필터를 씻으십시오. </li><li> RT 10 분 300 XG에서 필터링된 세포를 원심 분리기. </li><li> 후속 응용 프로그램에 대한 중간 또는 선택의 버퍼에 supernatent을 Resuspend. </li><li> myelin의 파편을 제거하려면, Myelin 제거 비즈를 사용합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 숫자 1-3를 참조하십시오 <img src="/files/ftp_upload/1267/Fig_1.png" alt="그림 1"> 그림. gentleMACS의 Dissociator 1 뇌 분리는 흐름 cytometric 분석이 보여주는 것처럼, 97% 가능한 세포의 결과. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig2.png" alt="그림 2"> 그림. neurosphere 형성 2 라이트 현미경 사진은 자기 세포 정렬 후 맥의 재배 7 일 후 안티 Prominin - 1 MicroBeads를 사용하여 ® NeuroMedium는 맥에서 보충 B27 플러스와 함께 보충. 세포는 신경 조직 분리 키트 (P)를 사용 CD1 마우스 뇌 (P3)에서 준비되었다. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig4.jpg" alt="무화과 3.5"> 그림. 단일 셀 suspensions 3 Myelin의 파편이 상당히 세포 절연 impairs 및 Myelin 제거 비즈로 myelin 파편의 제거 효율 전지 분판을 증가시킵니다. 안티 Prominin - 1 MicroBeads을 사용하여 Mac에서 분리 들어, P22 마우스 두뇌 신경 조직 분리 키트 (P)를 사용하여 dissociated되었습니다. 단일 세포 현탁액의 세포가 직접 분리에 사용되었다, 또는 Myelin 제거 비즈를 사용하여 고갈을 myelin에 제출했다. , myelin 제거없이 함께 시료의 분리를 비교하면 순수 이전 myelin 제거와 함께 샘플 높다는 것을 설명합니다.

<ol><li>Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+defines+differences+between+region-specific+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).</li>
<li>Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglia-derived+retinoic+acid+is+a+key+factor+in+glia-induced+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis.</a> FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).</li>
<li>Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNF-family+receptor+DR3+is+essential+for+diverse+T+cell-mediated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases.</a> Immunity. 29, 79-89 (2008).</li>
<li>Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
</ol>

Miltenyi Biotec 저자 GmbH를, 독일의 직원입니다.

gentleMACS Dissociator는 닫힌 시스템에서 신경 조직에서 단일 셀 suspensions의 표준 준비를 용이하게합니다. 신경 조직 분리 키트는 immunostainings 및 immunomagnetic 세포 분리 1-5와 같은 추가 응용 프로그램에 필요한 항원 epitopes을 보존하기 위해 최적화되었습니다. 이 프로토콜에서는 97% 가능한 세포에 항복, gentleMACS Dissociator과 신경 조직 분리 키트 (P)를 사용하여 마우스 두뇌의 부드러운 효소 분해를 보여줍니다. 5x10 6 호스트 조직의 연령에 따라 1x10 7 세포 사이에 신경 조직 수익률 100 MG. 대상 Prominin - 1 + 세포는 안티 Prominin - 1 MicroBeads를 사용하여 절연하고 이후 문화로 이동했다. 프로토콜은 쥐&gt; P7에서 파생된 신경 조직과 함께 작업할 때 Myelin 제거 비즈의 추가 사용 훨씬 더 효과적으로 표시됩니다.

<table><tbody><tr><td>C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; 시작 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; 튜브 회전기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-090-753</td><td>&lt;제시된 텍스트가 없으므로 번역할 내용이 없습니다. 번역이 필요한 소스 텍스트를 제공해 주시기 바랍니다.&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>신경 조직 해리 키트 (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-092-628</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>분리 전 필터</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-092-333</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-092-335</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Myelin Removal Beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-094-544</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Art 1000 리치 파이펫 팁 </td><td>분자 생물학 제품</td><td>주문 번호 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;멸균 상태에서 작업하기 위해 모든 단계를 라미나 플로우 후드(laminar flow hood) 내에서 수행하는 것을 권장합니다.

1. 재료
신경 조직 해리 키트 (Neural Tissue Dissociation Kit) (P) (구성품: 용액 1, 2, 3, 4, 보존 완충액)
분리 전 필터 (Pre-Separation Filters) (선택 사항)
미엘린 제거 비즈 (Myelin Removal Beads)
gentleMACS Dissociator
C 튜브
MACSmix 튜브 회전기 (Tube Rotator)
HBSS (w/o)
HBSS (w)

프로토콜을 시작하기 전 다음 용액들을 준비하십시오:
2가 양이온 $\text{Ca}^{2+}$ 또는 $\text{Mg}^{2+}$가 포함되지 않은 Hanks’ Buffered Salt Solution (HBSS (w/o))
표준 HBSS, 즉 $\text{Ca}^{2+}$ 및 $\text{Mg}^{2+}$가 포함된 것 (HBSS (w))

후속 응용 단계에서 관심 있는 항원 에피토프에 따라 파파인(Papain) 기반 신경 조직 해리 키트(P) 또는 트립신(Trypsin) 기반 신경 조직 해리 키트(T) 중 하나를 사용하십시오.
신경 조직 해리 키트로 다음 용액들을 준비하십시오:
용액 2: $\beta$-mercaptoethanol을 $0.067\text{ mM}$ 농도로 첨가합니다.
용액 4: 분말을 $0.7\text{ mL}$의 보존 완충액(키트에 제공됨)에 녹이고 부드럽게 혼합합니다(볼텍싱 금지).
효소 혼합액(Enzyme Mix) 1: C 튜브에 용액 2 $1.9\text{ mL}$와 용액 1 $50\text{ \mu L}$(모두 키트 제공품)를 넣고 $37\text{ °C}$에서 $10\sim15$분 동안 배양합니다. 이 양은 뇌 조직 $400\text{ mg}$을 해리하기에 충분합니다.

2. 신경 조직 해리
$1\text{ mL}$의 HBSS (w/o)가 들어 있는 튜브에서 뇌 조직의 무게를 잽니다.
마우스 뇌를 미리 가열된 효소 혼합액 1 $1950\text{ \mu L}$가 담긴 C 튜브로 옮깁니다. (참고: 이 프로토콜은 $400\text{ mg}$ 이하를 기준으로 작성되었으나, C 튜브당 최대 $1600\text{ mg}$의 뇌 조직을 처리할 수 있도록 용액 부피를 조절할 수 있습니다.)
C 튜브를 gentleMACS Dissociator에 넣고 “m_brain_01” 프로그램을 실행합니다.
MACSmix 튜브 회전기를 사용하여 $37\text{ °C}$에서 $15$분 동안 회전 배양($4\text{ rpm}$)합니다.
C 튜브를 gentleMACS Dissociator에 넣고 “m_brain_02” 프로그램을 실행합니다.
해리 단계 동안, 용액 3 $20\text{ \mu L}$와 용액 4 $10\text{ \mu L}$를 부드럽게 혼합하여 조직 $400\text{ mg}$당 $30\text{ \mu L}$의 효소 혼합액 2를 준비합니다.
셉텀 밀폐 캡(septum-sealed cap)을 통해 효소 혼합액 2를 C 튜브에 넣고 볼텍싱 없이 부드럽게 혼합합니다.
인큐베이터 내에서 $37\text{ °C}$로 $10$분 동안 회전 배양합니다.
C 튜브를 gentleMACS Dissociator에 넣고 “m_brain_03” 프로그램을 실행합니다.
인큐베이터 내에서 $37\text{ °C}$로 $10$분 동안 회전 배양합니다.
짧게 원심분리하여 샘플을 튜브 바닥에 모읍니다.

3. 여과
관심 세포가 통과할 수 있을 만큼 충분히 큰 필터를 선택하십시오. 예를 들어, 푸르키네 세포(Purkinje cells)는 너무 커서 $30\text{ \mu m}$ 필터를 통과할 수 없으나, Prominin-1+ 세포는 통과합니다.
적절한 $1000\text{ \mu L}$ 피펫을 사용하여 셉텀 밀폐 캡을 통해 C 튜브에서 세포를 제거하고, 이를 $15\text{ mL}$ 수집 튜브 위의 분리 전 필터에 적용합니다. (참고: 샘플 크기가 더 큰 경우 $50\text{ mL}$ 수집 튜브를 사용하십시오.)
$10\text{ mL}$의 HBSS (w)로 필터를 세척합니다.
여과된 세포를 실온(RT)에서 $300\text{ x g}$로 $10$분 동안 원심분리합니다.
상층액을 후속 응용 단계에 사용할 적절한 배지 또는 완충액에 다시 현탁합니다.
미엘린 잔해를 제거하려면 미엘린 제거 비즈를 사용하십시오.

4. 대표 결과: 그림 1-3 참조
그림 1. 유세포 분석 결과, gentleMACS Dissociator를 이용한 뇌 해리 시 세포 생존율이 $97\%$로 나타났습니다.
그림 2. MACS Supplement B27 PLUS가 첨가된 MACS® NeuroMedium에서 $7$일간 배양 후, Anti-Prominin-1 MicroBeads를 이용한 자기 세포 분리를 통해 형성된 뉴로스피어(neurosphere)의 광학 현미경 사진입니다. 세포는 신경 조직 해리 키트(P)를 사용하여 CD1 마우스 뇌(P3)에서 준비되었습니다.
그림 3. 단일 세포 현탁액 내의 미엘린 잔해는 세포 분리를 상당히 저해하며, 미엘린 제거 비즈로 미엘린 잔해를 제거하면 세포 분리 효율이 증가합니다. Anti-Prominin-1 MicroBeads를 이용한 MACS 분리를 위해, 신경 조직 해리 키트(P)를 사용하여 P22 마우스 뇌를 해리했습니다. 단일 세포 현탁액의 세포를 직접 분리에 사용하거나 미엘린 제거 비즈를 사용하여 미엘린 결핍 처리를 하였습니다. 미엘린 제거 전후의 샘플을 비교한 결과, 이전에 미엘린을 제거한 샘플의 순도가 더 높음을 알 수 있습니다.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>신경 조직 해리 키트 (T)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-093-231</td><td>&lt;제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 제공해 주세요.&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>프로피듐 아이오다이드 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>주문 번호 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

마우스 신경 조직에서 단일 셀 suspensions의 생성

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

신경계 내에의 연결 및 glial 세포 유형의 수백이 설명되었습니다. 뇌 또는 척수의 각 특정 세포 유형은 세포 표면 분자, 또는 그것이 식별하고 특성화 할 수있는을 통해 분자 determinants의 레파토리가 있습니다. 현재, 강력한 세포 식별 및 분리 기술은 동시에 특성 표면 단백질의 세포 죽음과 파괴를 제한하면서 단일 셀 준비가 생성해야합니다. 항원 epitopes을 보존하고 셀 손실을 제한하면서 트립신 또는 papain 기반 분리 키트와 함께 사용 gentleMACS Dissociator는 효과적이고 부드럽게 뇌 조직을 떼어 놓다 수 있습니다. 단일 셀 suspensions의 표준화 준비는 C 튜브 및 최적화, 미리 gentleMACS 프로그램을 사용하여 이루어진다. 일단 생성, 단일 셀 suspensions는 신경 progenitors을 식별하거나, Myelin 제거 비즈를 사용하여 더욱 정화 방지 Prominin - 1 MicroBeads 같은 단클론 conjugates로 치료하실 수 있습니다.

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직 aggitation에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 nerual 조직이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

신경계 내에는 수백 가지의 뉴런 및 글리아 세포 유형이 기술되어 왔습니다. 뇌 또는 척수의 각 특정 세포 유형은...

신경계 내에는 수백 가지의 뉴런 및 글리아 세포 유형이 기술되어 있습니다. 뇌 또는 척수의 각 특정 세포 유형은 식별 및 특성 분석이 가능한 세포 표면 분자 또는 분자 결정 인자들의 레퍼토리를 가지고 있습니다.현재의 정밀한 세포 식별 및 분리 기술은 세포 사멸과 특징적인 표면 단백질의 파괴를 동시에 최소화하면서 단일 세포 준비물을 생성하는 것을 필요로 합니다. Gentle Max Associator를 trypsin 또는 pepane 기반의 해리 키트와 함께 사용하면, 세포 손실을 제한하면서 항원 에피토프를 보존하며 뇌 조직을 효과적이고 부드럽게 해리할 수 있습니다. 이렇게 생성된 단일 세포 현탁액은 신경 전구세포를 식별하는 anti-prominin-1 microbeads와 같은 단클론 항체 접합체로 처리하거나, myelin 제거 비드를 사용하여 추가로 정제할 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Sandra PeNAT입니다. 저는 독일 baggage Gabert에 위치한 Mil Biotech에서 신경과학 제품 프로젝트 매니저를 맡고 있습니다. 오늘은 genix dis associator를 사용하여 마우스 뇌 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.Genix dis associator는 밀폐된 멸균 환경에서 다양한 조직 유형을 해리할 수 있는 장치로, 번거로운 수동 기계적 해리 과정을 생략할 수 있게 해줍니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 후속 응용 단계에서 관심 있는 항원 에피토프에 따라 papain 기반 신경 조직 해리 키트 또는 trypsin 기반 신경 조직 해리 키트 중 하나를 사용하십시오.오늘의 실험에서는 anti prominent one microbeads를 사용하여 주요 양성 세포를 분리하고자 하므로 neuro tissue dissociation kit P를 사용합니다. Prominent one은 pepane과 trypsin 모두에 민감하지 않으며, 이러한 경우에는 neuro tissue dissociation kit P가 더 적합한 선택입니다. 프로토콜을 시작하기 전에, 이 키트에 필요한 시약과 용액을 준비해야 합니다.칼슘 이온과 마그네슘 이온이 없는 Hank's balance salt solution(HBSS), 칼슘과 마그네슘 이온이 포함된 HBSS, 그리고 $\beta$-mercaptoethanol 재고분은 미리 준비해 둡니다. 우선 솔루션 2와 솔루션 4를 준비한 후, 이어서 효소 혼합물 1을 준비합니다. 먼저, $\beta$-mercaptoethanol을 솔루션 2에 추가하여 최종 농도가 0.067 mM이 되도록 합니다.이 용액은 4°C에서 보관할 때 최대 한 달 동안 안정적입니다. 다음으로, 동결건조 분말과 'solution.Four'라고 표시된 바이알을 0.7 mL의 보관 버퍼를 사용하여 부드럽게 혼합하며, 볼텍싱하지 마십시오.이제 C 튜브에 용액 2 1900 µL와 용액 1 50 µL를 피펫팅하여 효소 혼합물 1을 준비합니다. 이 양은 400 mg의 조직을 해리시키기에 충분한 양이므로, 더 많은 양을 해리시켜야 한다면 효소 혼합물 1을 추가로 준비하십시오. C 튜브 하나로는 최대 1600 mg의 뇌 조직을 처리할 수 있습니다.C 튜브에 담긴 효소 혼합물 1을 37 °C에서 10~15분 동안 배양합니다. 해리 과정을 시작하려면 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 HBSS 1 mL를 튜브에 피펫으로 넣습니다. 튜브를 저울 위에 올리고 뇌 조직을 추가한 뒤 그 질량을 기록합니다.이 P 4 마우스 뇌의 무게는 약 0.2 g입니다. 성체 뇌의 무게는 약 0.4 g이며, 400 mg 미만의 모든 조직 샘플에 대해 오늘 사용할 용액 부피는 적절합니다.조직의 무게가 400 mg을 초과하는 경우, 모든 시약의 부피를 그에 맞게 늘리십시오. C 튜브 하나당 최대 1600 mg의 조직을 처리할 수 있습니다. 미리 가열된 효소 1,950 µL가 들어 있는 준비된 C 튜브에 마우스 뇌를 옮깁니다. 혼합한 후 캡을 단단히 밀봉하십시오.이제 C 튜브의 캡이 아래로 향하게 하여 gen max associator에 배치하고, 조직이 스테이터(stator) 영역에 위치해 있는지 확인하십시오. MCO brain O one 프로그램을 선택하고 실행합니다. 이는 해리 과정에서 실행할 세 가지 프로그램 중 첫 번째 단계이며, 프로그램이 종료되면 다음 단계로 진행합니다.C 튜브를 제거하고, 천천히 지속적으로 회전시키며 37 °C에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. max mix 튜브 회전기를 사용할 때, 장치의 작동 모드는 4 RPM에 해당합니다. 1차 배양 후, 튜브를 해리 장치에 거꾸로 다시 끼우고 M brain O2 프로그램을 실행합니다. 다음 결합 과정 중에, 솔루션 3 20 µL와 솔루션 4 10 µL를 첨가하여 조직 400 mg당 30 µL의 효소 믹스 2를 준비합니다.두 번째 교반 주기가 끝나면, 캡 중앙의 격막 밀봉 개구부를 통해 C 튜브에 30 µL의 효소 혼합액 2를 직접 넣습니다. 무균 상태를 유지하기 위해 C 튜브를 가볍게 반전시켜 혼합하며, 볼텍싱은 하지 마십시오. 그런 다음 C 튜브를 다시 max mix 튜브 회전기에 장착하고 37 °C에서 4 RPM으로 혼합하며 10분 동안 시료를 배양합니다.그다음 CTU를 gentle max dis associator에 세 번째이자 마지막으로 다시 넣고, 프로그램 M brain oh three를 실행합니다. 세 번째 프로그램이 완료되면, C tube를 rotator에 놓고 37 °C에서 10분 더 배양합니다. 이제 샘플을 짧게 원심분리하여 튜브 바닥에 세포를 수집합니다.이제 세포를 여과할 준비가 되었습니다. 관심 있는 세포 유형의 크기에 따라 세포 스트레이너를 선택하십시오. kinji 세포와 같이 수집하려는 세포의 직경이 30 µm보다 큰 경우, 해당 직경의 세포 본체가 통과할 수 있을 만큼 공극 크기가 충분히 커야 합니다.크기가 큰 단일 양성 세포를 분리하려면 30 µm 필터가 적합합니다. C 튜브 캡의 격막 밀봉 개구부를 통해 들어가는 1000 µL 피펫 팁을 사용하여 해리된 조직을 C 튜브에서 꺼냅니다. 15 mL 수집 튜브 위에 놓인 분리 전 필터에 세포 현탁액을 가합니다.더 큰 시료 크기의 경우 50 milliliter 튜브가 필요할 수 있습니다. 세포 현탁액이 필터를 통해 흐르도록 둡니다. 그 다음, 칼슘 및 마그네슘 이온이 포함된 HBSS 용액 10 milliliters를 추가하여 필터를 세척합니다.400 mg 이상의 조직량을 다룰 때는 필터 세척을 위해 칼슘 및 마그네슘 이온이 포함된 HBSS를 최대 30 mL까지 사용하십시오. 이제 수집 튜브의 세포를 실온에서 300 Gs로 10분 동안 원심 분리하여 펠렛화하고, 상층액을 완전히 흡입한 후 선택한 버퍼 또는 배지로 세포 펠렛을 재현탁하십시오. 이 단계에서 세포 분리 및 항체 염색을 방해할 수 있는 수초 파편(myelin debris)을 제거하는 것이 좋습니다.미엘린 잔해를 제거하려면 미엘린 제거 비즈를 사용할 것을 권장합니다. 그 외의 경우, 세포는 추가 응용 단계에 사용할 준비가 된 상태입니다. 프로피듐 요오드(propidium iodide) 염색을 기반으로 한 이 점 도표(dot plot)는 본 영상에서 생성된 것과 같이 마우스의 염좌 부위에서 얻은 단일 세포 현탁액에 존재하는 세포의 97%가 생존해 있음을 나타냅니다.이 세포들은 anti-prominin 마이크로비즈를 사용하여 추가로 정제함으로써 신경 전구세포를 얻을 수 있으며, B 27 plus가 첨가된 max neuro 배지에서 배양하면 이 도트 플롯과 같이 신경구(neurospheres)를 형성할 수 있습니다. 수스펜션을 myelin 제거 비즈로 처리했을 때의 이점이 확인되었습니다. 단일 세포 수스펜션에서 myelin을 제거한 후 max separation을 수행하면 prominin-1을 발현하는 신경 전구세포의 비율이 유의미하게 더 높게 나타납니다.지금까지 Genix 해리 및 신경 조직 해리 키트를 사용하여 마우스 뇌 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 선택한 신경 조직 해리 키트(T 또는 P)에 맞게 모든 용액이 적절하게 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다. NDK 애플리케이션 노트 또는 데이터 시트를 참조하십시오. 이 방법을 사용하면 배아 조직뿐만 아니라 조직 절편 또는 전체 뇌를 멸균 조건 하에서 표준화된 방식으로 시간을 절약하며 처리할 수 있습니다.시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Biology

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