전체 몽키 브레인에서 대규모 단백질 탐지에 대한 배치 Immunostaining
2009년 7월 27일
전체 영장류 두뇌를 통해 대상 단백질의 대규모 면역이 포함 소설 조직을 고용하고 주어진 시간에 여러 자유 부동 섹션의 배치 얼룩을위한 창조적인 장치를 이용하여 결합 방법을 sectioning에서 가능합니다.
이 절차는 4% PFA 관류, 외부화 및 극저온 보호 뇌를 수령한 즉시 시작되며, 이 뇌는 주변 매트릭스에 내장된 정렬 랜드마크를 사용하여 내장하기 위해 신경과학 담당자에게 보내졌습니다. 뇌는 관상동맥 평면(coronal plane)에서 절편화하여 원하는 두께로 연속적인 절편을 생성할 수 있으며, 이는 특수 바구니와 용기를 사용하여 뇌의 전체 전방 후방 범위를 나타냅니다. 배치 면역 처리는 전체 뇌에 걸쳐 단백질의 공간 발현 패턴을 결정하기 위해 수행할 수 있습니다.
안녕하세요, 저는 몬트리올 대학교 검안 학교의 시각 신경과학 연구실의 Shaheen Zur 박사입니다. 안녕하세요, 저는 몬트리올 대학교 검안 학교의 시각 신경과학 연구실의 마크 버크 박사입니다. 안녕하세요, 저는 몬트리올 대학교 검안 학교의 시각 신경 과학 연구소 소장인 Dr.Mo Petto입니다.
오늘은 원숭이 뇌 전체에서 대규모 단백질 검출을 위한 배치 면역 염색 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 전체 뇌에 걸친 표적 단백질의 발현 패턴을 연구하고 동일한 뇌 내에서 이러한 단백질의 발현을 비교 및 대조합니다. 시작하겠습니다.
조직학적 처리 전에, 전신 관류 및 고정 후 및 등급이 매겨진 자당 용액을 사용하여 극저온 보호를 통해 보존된 영장류 뇌를 얻습니다. 이 단계에서 뇌는 신경과학 연구원에게 보내져 독점 기술을 사용하여 삽입되고 자유 절편됩니다. 돌아 오면 7 개의 정렬 랜드 마크가 임베딩 매트릭스에 배치되어 조직 학적 처리가 완료된 후 섹션의 방향을 올바르게 지정하고 재정렬 할 수 있음을 관찰 할 수 있습니다.
절편화가 수행되는 동안 나중에 해부학 지도의 3D 재구성에 사용할 수 있는 디지털 이미지가 촬영됩니다. 신경과학자들은 우리 조직을 처리하여 전체 뇌에 걸쳐 50마이크로미터 두께의 자유 부유 관상 절편을 연속적으로 생성합니다. 완료되면 섹션의 조직학적 처리를 시작할 수 있습니다.
조직학적 처리를 시작할 때 일반적으로 항체 또는 염색당 약 140개의 절편을 처리해야 합니다. 여기에서는 인산화되지 않은 신경필라멘트 단백질에 대한 단클론 항체인 항체 SMI 32로 처리된 더 작은 절편 샘플로 기술을 시연할 것입니다. 절차 전반에 걸쳐 특수 염색 접시와 바구니가 사용되어 많은 수의 자유 부동 섹션을 동시에 효율적으로 처리할 수 있습니다.
이렇게 하면 결과 염색이 모든 섹션에서 일관되게 유지됩니다. 첫 번째 단계는 TRITTON X 100과 일반 말 혈청을 함유한 PBS 기반 용액에서 절편을 60분 동안 배양하는 것입니다. 이렇게 하면 배경 염색을 유발하는 항체 분자의 비특이적 결합이 줄어듭니다.
다음으로, 절편을 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 tritton X 100과 일반 말 혈청을 보충한 PBS 기반 SMI 32 항체 용액에서 절편을 세척 용액에서 10분 동안 3회 세척한 다음 실온에서 2시간 동안 배양합니다. PBS 기반 비오틴화 Muse 2차 항체 솔루션에는 Triton X 100과 일반 말 혈청이 함유
되어 있습니다.3회 추가 10분 세척 세트 후, 절편을 실온에서 1시간 동안 avadon biotin conjugated horse radish peroxidase complex 용액에 넣습니다. 마지막으로, 또 다른 세척 후 절편을 10분 동안 D 아미노 벤진 반응에 배치하여 면역 반응성 뉴런 내에 갈색 염색을 생성합니다. 그런 다음 염색 바구니를 제거하고 단면을 PBS에 담그면 반응이 중지됩니다.
2-3분 후 PBS 섹션을 5분 동안 헹궈낸 후 대형 페트리 접시와 매우 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 장착 프로세스를 시작하기 위해 유리 슬라이드에 개별적으로 장착할 준비가 됩니다. 절편은 PBS 버퍼 용기에서 들어 올려 젤라틴 코팅 유리 슬라이드에 개별적으로 장착됩니다. 그런 다음 샘플은 다음 날 흄 후드에서 밤새 자연 건조됩니다.
섹션은 장착 과정에서 남을 수 있는 소금 결정을 씻어내기 위해 탈이온수에 담궈 헹굽니다. 그런 다음 슬라이드는 등급이 매겨진 에탄올 단계에서 탈수되고 크실렌으로 세척되고 마운트 장착 매체별로 덮개를 미끄러집니다. 이 단계에서 슬라이드는 장착 매체가 굳을 수 있도록 수평 위치에 약 일주일에서 10일 동안 보관해야 합니다.
그런 다음 슬라이드를 슬라이드 상자에 보관하거나 현미경을 통해 이미징할 수 있습니다. 이 방법은 전체 원숭이 뇌에 걸쳐 관심 대상 단백질의 완전한 발현 프로파일을 생성합니다. 여기에서는 FMRP, new n 및 SMI 32 표현식의 스냅샷을 제공하는 대표적인 코로나 단면을 보여줍니다.
같은 원숭이의 뇌에서. 방금 뇌 전체에 걸쳐 관심 있는 표적 단백질에 대한 배치 면역 염색을 완료하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 모든 섹션이 다양한 용액에서 배양되는 동안 가벼운 교반을 겪고 항상 완전히 잠긴 상태를 유지하는 것이 중요합니다.
또한 절개를 유리로 장착하는 동안 시간을 갖고 조직의 무결성을 손상시키지 않고 가능한 한 많은 주름과 접힘을 제거하십시오. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
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개요
이 기사는 영장류 뇌 전체에서 표적 단백질을 대규모로 면역 검출하는 새로운 접근법에 대해 논의합니다. 혁신적인 조직 임베딩 및 단면화 방법과 여러 자유 부유 단면에 대한 일괄 염색 기술을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 면역 검출
- 뇌 영상
배경
- 면역 검출은 뇌에서 단백질 발현을 연구하는 데 중요합니다.
- 기존 방법은 범위와 효율성에서 제한될 수 있습니다.
- 조직 처리 기술의 발전은 연구 능력을 향상시킬 수 있습니다.
- 일괄 처리를 통해 단백질 분포의 포괄적인 분석이 가능합니다.
연구 목적
- 영장류 뇌에서 대규모 면역 검출 방법을 개발합니다.
- 단백질 발현 분석의 효율성을 향상시킵니다.
- 뇌 전체에 걸친 공간 발현 패턴의 연구를 촉진합니다.
사용된 방법
- 뇌 보존을 위한 4% PFA 순환.
- 주변 매트릭스에 정렬 랜드마크를 사용한 임베딩.
- 연속 단면을 위한 코로널 평면에서의 단면화.
- 공간 단백질 발현 분석을 위한 일괄 면역 처리.
주요 결과
- 영장류 뇌 조직의 성공적인 임베딩 및 단면화.
- 단백질 발현 패턴을 분석하는 능력 입증.
- 혁신적인 기술이 면역 검출의 효율성을 향상시킵니다.
- 신경과학 연구에서 더 넓은 응용 가능성이 있습니다.
결론
- 개발된 방법은 대규모 면역 검출을 크게 개선합니다.
- 이 기술들은 뇌 단백질 발현에 대한 이해를 발전시킬 수 있습니다.
- 향후 연구는 이러한 방법을 다양한 응용을 위해 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Large-scale protein expression mapping in primate brains supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. Batch immunostaining enables reproducible, quantitative assessment of spatial protein distribution across the whole brain, improving predictive confidence in target engagement and pathway modulation. This approach addresses a critical gap in translational research by providing disease-relevant system data for lead identification and preclinical model alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping target protein expression across the entire primate brain.
- Operational Value: Supports biological de-risking through uniform staining of serial sections for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing spatially resolved protein expression data for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via batch processing of free-floating sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through synchronized immunostaining of large section sets.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse for reliable compound evaluation in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through alignment of protein expression patterns with neurological disorder models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation using standardized immunostaining protocols.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by enabling quantitative measurement of protein levels and neuronal populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation to preclinical research by enabling spatially resolved protein expression analysis in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through whole-brain protein mapping.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility via batch immunostaining of serial sections.
- Analytics: Highlights quantitative readouts such as protein levels and neuron population counts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via alignment of expression patterns with biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for large-scale protein detection across multiple targets and studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein expression studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of immunostaining workflows for large section sets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on whole-brain expression profiles.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, immunohistochemistry, and neuroanatomy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including specialized staining dishes, baskets, and microscopy systems.
- Cross-team standardization requirements for section alignment, staining consistency, and data interpretation.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primate versus rodent brain processing.
- Practical limitations including section handling complexity and mounting precision for large-scale serial sections.
