Name: 인간 췌장 아일릿 절연 : 2 부 : 인간 아일 레츠의 정화와 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 인간 췌장 아일릿 정화 및 배양 방법을 통한 이식 생물학 연구. 수정된 자동화 기술로 고품질 아일릿을 분리하고 조직 배양 플라스크에서 배양하여 당뇨병 치료를 위한 임상 적용 가능성을 확보합니다.

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시카고 일리노이 대학에서 창립뿐만 아니라 지원 아일릿 세포 자원 센터 NIH 그랜트 (RFA - RR 05-003), 크리스토퍼 재단 Efroymson 재단과 Tellabs 재단으로.

1. 아일 레츠의 정제 <ol><li> 아일릿 정화 절차를 시작하려면, COBE 가방을 읽어 녹색 튜브를 제외한 모든 튜브 클램프, 0로 1,500 속도를 설정하고 슈퍼. </li><li> 후드에는 펌프와 그라디언트 비커를 설정하고 녹색 튜브에 수집 튜브를 연결합니다. </li><li> &quot;회전&quot;은 다음 앞에 비커에 Ficoll 1.100 110 ML을 추가 푸시하고, COBE 가방을로드하기 위해 펌프를 시작 이제 ficoll 1.100의 로딩이 시작할 수 있습니다. Ficoll이로드되면서, 슈퍼를 눌러 펌프를 정지, 펌프​​ 헤드를 unclamp 100에 슈퍼 제한 속도를 설정합니다. </li><li> ficoll이 비커에 도달하고 모든 공기가 펌프 헤드에서 튜브, 다시 클램프에서 퇴학 경우. 3000 회전 속도, 그리고 슈퍼 아웃 속도 0으로 설정합니다. </li><li> 지금은 전면 비커에 무거운 그라디언트를 따르고하여 그라디언트를 로드할 준비합니다. 약간 모든 공기를 제거하는 두 비커 사이의 클램프를 놓습니다. 그런 다음 다시 비커에 빛을 그라데이션을 따라줘. </li><li> 자기 활동가 켜고, COBE 기계에 &quot;스핀&quot;을 누르 두 비커를 연결하는 튜브의 클램프를 제거하고, 시각적으로 무겁고 가벼운 그라디언트가 혼합되어 있는지 확인합니다. </li><li> 그라디언트가 혼합 시작되면, 원심 분리기를 켜십시오. 잠시만 기다려 다음 혼합 그라디언트를 로드할 수있는 펌프를 켭니다. </li><li> 조직의 그라데이션이 앞에 비커에 부족하게 로드할 수 있지만, 공기가 로딩 튜브를 입력하도록 낮아 다음 비커를 연결하는 튜브를 reclamp하고 조직을로드하지 않습니다. </li><li> 조직의 나머지 부분을 계속 추가합니다. 그런 다음 세척 솔루션 50 ML과 조직을 개최 튜브를 세척하고, 전면 비커를 씻어을 사용합니다. </li><li> 조직의 마지막 봉투를 입력으로 동시에를 펌프를 정지 펌프 헤드에 unclamp하고, 가방 위 튜빙을 클램프. 5 분 원심 분리기로 진행합니다. </li><li> 원심 분리가 계속하는 동안, 후드에 12 컬렉션 튜브를 가지고와 그 뚜껑을 느슨하게. 노란색 튜브에 수집 튜브를 부착하고, 원뿔 튜브 하나에 멸균 수집 팁 장소. 다음 노란색 튜브를 unclamp하고, 녹색 튜브 클램프. </li><li> 회전이 끝나면 천천히 100 Superout을 올립니다. 튜브 1 150 ML를 수집합니다. 다음 (200-230 ML에서) 튜브 2-12에서 30 ML를 수집합니다. </li><li> 일단 수집이 완료되면, COBE의 &quot;STOP&quot;푸시. 이제 정화는 이제 끝났어 아일 ​​레츠는 평가와 교양 수 있습니다. </li></ol> 2. 샘플링과 문화 <ol><li> 정화 아일 레츠 분수를 수집 후, 12 컬렉션 튜브의 각 샘플을 제거하고 Dithizone로 얼룩. 얼룩은 레이어 낮은 순도 아일 레츠와 고순도 아일 레츠 대 레이어를 포함하는 표시됩니다. </li><li> 각 함께 높고 낮은 순도 조직과 수영장를 수집합니다. </li><li> 스핀과 두 번 씻으십시오. 두 번째 세척 후, 최종 와시 매체와 250 ML 각의 볼륨을 가져. </li><li> 평가하려면 풀링 분수가 낮은에서 풀링된 분수 하나 하나 ML 샘플의 높은 두 한 ML 샘플을 채취하여 시작합니다. 세척 용액 9 ML을 포함하는 원뿔 관에 각각 1ml 샘플을 전송합니다. </li><li> 다음 각 15 ML 관에서 계산 접시 1 ML을 전송하기만하면됩니다. 검사하고 현미경으로 세포를 계산합니다. </li><li> (십진수로 아일 레츠 총 EIN / 순수) / (술병 당 30,000 EIN) : 세포가 문화를 다음 수식을 사용하여 아일 레츠를 필요 flasks의 수를 계산 카운트 후. 예를 들어, 90 % 순도로 100,000 아일 레츠 4 flasks에서 양식입니다. </li><li> 37 T175 flasks 문화에 아일 레츠를 전송 ˚ C 및 5% CO 2 배양기. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

인간 아일릿 절연의 기술에 상당한 진보에도 불구하고, 아일릿 수율이 높은 변수 및 예측 남아 있습니다. 소화 췌장 조직의 정화는 이식을위한 성공적인 효소 소화 후 충분한 이슬 미사를 복구하는 데있어 매우 중요합니다. 매우 순수한 인간 아일 레츠의 뛰어난 복구이 방법을 사용하여 입증 되었기 때문에 UIC 정화 방법을 권장합니다. 또한, 소화 조직의 최대 50 ML 따라서 격리에 사용되는 총 시간을 단축하여 인간 아일 레츠의 국소 빈혈 - 관련 부상을 최소화 정화를위한 실행 단일 Cobe에 로드할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>원심분리기</td><td>장비</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Cobe 2991 세포 프로세서</td><td>장비</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>췌도 정제</td></tr><tr><td>MZ6 도립 현미경 TLBD4.1</td><td>장비</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>2 mm 그리드 세포 배양 접시</td><td>장비</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>췌도 계수</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>장비</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>COBE 백</td><td>일회용 장비</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>T175 배양 플라스크</td><td>일회용 장비</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>위스콘신 대학교(UW) 용액</td><td>시약</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 완충 염 용액 (HBSS)</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>시약</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>M199 배지 (세척액)</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>최종 세척/배양 배지</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 췌장 아일릿 절연 : 2 부 : 인간 아일 레츠의 정화와 문화

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

1 형 당뇨병의 관리는 매년 100여 억 달러를 비용, 모두 개인과 사회에, 부담합니다. 포도당 모니터링 및 새로운 인슐린 공법의 광범위한 사용에도 불구하고, 많은 사람은 여전히​​ 파괴적인 보조 합병증을 개발합니다. 췌장 아일릿 이식은 당뇨병 환자에서 정상적인 혈당 조절 근처에 복원할 수 있습니다<sup&gt; 1</sup&gt;, 집중적인 인슐린 요법과 관련된 심각한 혈당 에피소드의 위험이없이. 충분한 아일릿 질량을 제공하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 중요합니다. 그러나 기증자 특성, 기관 조달 및 보존은 절연 결과에 영향을<sup&gt; 2</sup&gt;. 시카고 일리노이 대학 (UIC)에서 우리는 개선 정화 기울기와 함께 성공적인 격리 프로토콜을 개발<sup&gt; 3</sup&gt;. 이 프로그램은 2004 년 1 월 시작했고 300 명 이상의 isolations 11 월 2008까지 수행했다. pancreata는 (UW, 위스콘신 또는 HTK 대학, 히스티딘 - 트립토판 Ketoglutarate) 차가운 보존 솔루션에 보내진<sup&gt; 4-7</sup&gt; 아일릿 절연을위한 UIC에서 셀 절연 연구실 있습니다. 췌장 아일 레츠는 원래 Ricordi에 기술된 방법의 수정된 버전입니다 UIC 방법을 사용하여 격리되었다<em&gt; 외</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. 로서 일부 설명 : 소화 및 췌장 조직의 수집, 인간의 췌장은 줄어들 cannulated, perfused, 그리고 소화했다. 수집 UW 솔루션에 부화 최소 30 분 후, 조직은 정화를위한 (COBE 2991, Cobe, 레이크 우드, CO) 세포 분리에로드했습니다<sup&gt; 3</sup&gt;. 다음 정화, 아일릿 수율 (아일릿 등가물, IEQ로 표현), 조직 볼륨, 그리고 순도가 표준 방식에 따라 결정되었습니다<sup&gt; 9</sup&gt;. 절연 아일 레츠는 CMRL -​​ 1066 1.5 % 인간의 알부민, 0.1 % 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 (ITS), * 시프 로플 록 사신, 1M HEPES 5 ML 1 ML과 보충 미디어 (Mediatech, 헤른던, VA), 그리고 14.5 ML에 교양되었습니다 37 T175 flasks에서 7.5 %의 나트륨 비카보네이트 ° C 야간 문화 아일 레츠가 이식이나 연구에 사용하기 전에.

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연 (부분 II : 인간 아일 레츠의 정화 및 문화)에 대한 절차를 수정 자동화된 방법을 사용하여.

제1형 당뇨병 관리는 개인과 사회 모두에게 부담이 되며, 연간 1,000억 달러 이상의 비용이 발생합니다. ...의 광범위한 사용에도 불구하고...

이 영상에서는 이전에 분리 및 소화된 췌장 조직을 이용하여 파이칼 농도 구배 정제(fial gradient purification)를 수행하며, 이를 통해 최종적으로 이식 전까지 조직 배양 플라스크에서 배양할 수 있는 정제된 췌도 분획을 얻게 됩니다. 안녕하세요, 저는 일리노이 대학교 시카고 캠퍼스 외과 학과 내 인간 췌도 프로그램 연구실의 American Chief입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Barbara Barbero이며 저 또한 인간 췌도 프로그램 소속입니다.오늘은 인간 췌도 분리 절차를 보여드리겠습니다. 저희 시설에서는 임상적 용도로 사용하기 위한 고품질의 인간 췌도를 수확하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다.아이렛(eyelet) 정제 절차를 시작하려면 COBE 백을 장착하고 녹색 튜브를 제외한 모든 튜브를 클램프로 잠근 후, 후드 내에서 속도를 1500으로, super out을 0으로 설정하십시오. 펌프와 기울기 비커를 준비하고 수집 튜브를 녹색 튜브에 연결하십시오. 이제 FI 콜(FI call) 로딩을 시작할 수 있으므로 스핀(spin) 버튼을 누르십시오.그런 다음 fi 110 milliliters를 추가합니다. 전면 비커로 호출하고 펌프를 작동시켜 COBE 백을 로드합니다. FI 호출이 로드되면 super out을 누릅니다.펌프를 정지시키고, 펌프 헤드의 클램프를 푼 다음 super out 속도를 100으로 설정하십시오. FI 콜이 비커에 도달하고 튜브 내의 모든 공기가 배출되면 펌프 헤드의 클램프를 다시 잠그고, 회전 속도를 3000으로, super out 속도를 0으로 설정하십시오. 이제 무거운 구배액을 전면 비커에 조금씩 부어 구배를 로드할 준비를 하십시오.공기를 제거하기 위해 두 비커 사이의 클램프를 풉니다. 그런 다음 가벼운 밀도 구배액을 뒤쪽 비커에 붓습니다. 마그네틱 교반기를 켭니다.COBE 장비의 spin 버튼을 누릅니다. 두 비커를 연결하는 튜브의 클램프를 제거하고 고밀도 및 저밀도 구배가 혼합되는지 확인합니다. 구배가 혼합되기 시작하면 원심분리기를 켭니다.1분간 기다린 후, 펌프를 켜서 조직을 적재하기 위한 혼합 경사도를 로드하십시오. 앞쪽 비커의 경사도 높이를 낮추되, 로딩 튜브로 공기가 유입되지 않을 정도로만 낮게 유지하십시오. 그런 다음 비커들을 연결하는 튜브를 고정하고 조직을 적재하십시오.나머지 조직을 계속해서 추가합니다. 그런 다음 조직이 들어있던 튜브

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연을위한 절차 : 수정된 자동화된 방법을 사용하여 (부분 I 소화 및 췌장 조직의 수집).

인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 I : 소화 및 췌장 조직의 수집

연구 2 형 당뇨병 아일 레츠의 공급 부족이다. 여기 부분 pancreatectomy를 겪고 환자에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유할 수 있습니다. 이 방법은 제 2 형 당뇨병 환자에서 아일 레츠을 얻기위한 독특한 장소를 나타내며 임상 기초 및 임상 연구에 적합한 숫자가 아닌 당뇨병 과목과 일치.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

이 프로토콜은 섬 분리 및 정제를 위한 돼지 췌장 조달을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

Islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

배우세요 인간 췌장 아일릿 정화 및 배양 방법을 통한 이식 생물학 연구. 수정된 자동화 기술로 고품질 아일릿을 분리하고 조직 배양 플라스크에서 배양하여 당뇨병 치료를 위한 임상 적용 가능성을 확보합니다.

인간 췌장 아일릿 절연 : 2 부 : 인간 아일 레츠의 정화와 문화

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