Name: 인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: 배우세요 인간 CD40-활성화 B 세포를 말초혈액 단핵세포에서 배양하는 방법을. CD40 리간드와 인터루킨-4로 자극하여 항원제시능력을 향상시키는 면역학 기술입니다.

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PBMC에서 인간 CD40 - 활성 B 세포의 생성에 대한 프로토콜은 두 부분으로 나뉘어져 있습니다 : 제 플레이트 - 바운드 피더 세포로 사용됩니다 NIH/3T3 세포를 표현 CD40 리간드의 준비를 보여줍니다. 파트 B는 실제 CD40 - B 문화를 설명합니다. 피더 세포의 A. 준비 (tCD40L NIH/3T3) tCD40L NIH/3T3 완전히 합류가해서는 안 자기편 murine fibroblast 세포 라인입니다. 세포 따라서 주당 두번 splitted 수 있습니다. 6 개 이상 주 동안 Culturing하지 않는 것이 좋습니다. <ol><li> 멸균 피펫으로 기본 문화 올드 미디어를 제거하고 1X PBS의 10 ML과 세포를 씻으십시오. 세척 후 PBS를 대기음. </li><li> 37 5-10분에 75cm 2 플라스크 4 ML 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 ° C. 세포를 분리하기 위해 부드러운 도청을 사용합니다. </li><li> 야생 유형 매체 10 ML을 추가하고 부드럽게 회전. </li><li> 멸균 피펫과 50 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 뜨는을 제거하고 야생 유형 매체 10 ML에서 펠렛을 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 카운트하고 세포의 적절한 수의 세 50 ML 튜브를 준비 : <ol><li> subculturing에 대한 1.5 X 10 6 세포 </li><li> 0.2 X 10 6 세포 / 잘 CD40 - B 세포 배양에 사용되는 방사선에 대한 </li><li> 프리즈에 나머지 (필요한 경우). </li></ol></li><li> 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 뜨는을 제거합니다. <ol><li> subculturing 들면 : resuspend 1.5 75cm 2 세포 배양 플라스크 10 ML 야생 유형 매체 (세포 밀도가 1.5 X 10 5 셀 / ML)에서 X 10 6 세포, G - 418을 추가 [0.7 MG / ML]와에있는 세포를 품어 5% CO 2와 37 ° C. 두 당 주 세포를 분리. </li><li> CD40 - B 세포 배양의 경우 : 한 6 자 접시 1.2 X 10 6 세포가 필요합니다. 0.1 X 10 6 세포 / ML의 밀도에 야생 유형의 매체에있는 세포를 Resuspend하고 78 쥐에서 그들을 비추다. 물론 각 37에서 그들을 품어 ° C와 5 % CO 2에 세포 현탁액의 플레이트 2 ML. tCD40L NIH/3T3 세포가 자기편 때 B - 세포 자극이 준비한 접시를 사용합니다 (최소한 4 시간 : 현미경으로 준수를 확인, B - 세포 자극을 시작하는 이상 24 H를 기다리지 않는다). (B. 계속) </li></ol></li></ol> B. CD 40의 B 세포 배양 CD40 - 자극 (일 공)에 대한 PBMCs의 I. 준비 : 주의 : 당신이 피더 세포가 자기편 것을 확인할 계속하기 전에. 항상 인터루킨 - 4 및 시클 로스 포린의 성장 매체 바로 사용하기 전에 새로운 솔루션을 추가합니다. <ol><li> 신선한 또는 적절하게 해동 중 하나를 PBMCs 가져가라. Resuspend 그들을 씻고 7 분 및 기타 세포를 제거 7 분 190 XG에서 두 번째 시간에 265 XG에 처음 스핀 다운을 1X PBS의 50mL 두 번 PBMCs. 뜨는을 취소하고 PBS 20 ML에있는 세포를 resuspend. 세포 현탁액의 나누어지는의 휴대폰 번호를 확인합니다. </li><li> 5 분 225 XG에서 세포의 필요한 양을 스핀 다운. 6 잘 플레이트 4 X 10 6 세포 / 잘 따라서 판 당 24 X 10 6 셀 필요합니다. </li><li> 뜨는를 제거하고 성장 요인 및 0.63 μg / ML 시클 로스 포린과 같은 A는 T - 세포의 파생물을 방지하기 위해 갓 50 U / 인터루킨 - 4의 ML과 보충 CD40 - B 문화 매체 1 X 10 6 세포 / ML에서 PBMC를 resuspend (감안할 때 농도가 한 ML 문화 매체를 참조!). </li><li> 에서 뜨는을 제거 6 잘 플레이트 사전 incubated tCD40L NIH/3T3 세포와 함께. </li><li> 2 ML PBS마다 잘 첫번째와 CD40 - B 세척 매체 2 ML과 함께 두 번째 단계에서 자기편 tCD40L NIH/3T3 세포를 씻으십시오. </li><li> 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 잘하는 PBMC 정지 4 ML (1 X 10 6 세포 / ML)를 추가합니다. </li><li> 37 세포를 품어 ° C와 5 % CO 2. </li><li> 일 7.2에서 세포 (3.2 계속.) reculture. </li></ol> II. CD40 - B 세포 (일 7 다음 모든 3~4일)의 Recultivati​​on : <ol><li> 50 ML 튜브에 10 ML의 피펫과 수영장 그들과 함께 resuspending하여 6 - 잘 접시에서 CD40 - B 세포의 수확 클러스터. </li><li> 7분에 대한 225 XG에 스핀 다운 및 완전히 CD40 - B 세척 매체로 뜨는 교체하십시오. 나누어지는의 세포 금액을 계산하는 동안, 5 분 225 XG에서 세포를 스핀 다운. 1 X 10 6 세포 / ML의 농도에서 CD40 - B 문화 매체 Resuspend CD40 - B 세포. </li><li> 50 U / ML의 농도와 매체 0.63 μg / ML 시클 로스 포린의 인터루킨 - 4의 새로운 솔루션을 추가합니다. </li><li> 6 잘 플레이트 tCD40L NIH/3T3 세포 사전 incubated에서 뜨는을 제거합니다. </li><li> 2 ML PBS마다 잘 첫번째와 CD40 - B 세척 매체 2 ML과 함께 두 번째 단계에서 자기편 세포를 씻으십시오. </li><li&gt;을 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 잘하는 CD40 - B 정학 4 ML (1 X 10 6 세포 / ML)를 추가합니다. </li><li> 37 접시를 품어 ° C 5 % CO 2. </li><li> Subculture 세포가 다시 모든 3-4일 14 일 총 후에 고도로 순수한 인간 CD40 - B 세포 활성화와 최종 수 있습니다. </li></ol> C.의 문제 해결 - 뭐 CD40 - B 세포 성장하지 않으면? <ol><li> 당신은 피더 세포의 CD40 리간드 발현에 대한 검사 있습니까? </li><li> 판 - 바운드 자극에 사용되는 피더 세포는 24 시간 이상은 안하나요? </li><li> mycoplasma 수있는 오염인가? </li><li> 보완을 위해 사용되는 인터루킨 - 4 솔루션은 갓 해동하고 적절한 생물 학적 활동을했다나요? </li><li> 시클 로스 포린 A는 정확한 농도에 추가습니까? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="그림 1" /> 그림 1. 주시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">여기를 클릭하세요</a> 그림 1의 더 큰 버전을 위해. <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="그림 2" /> 그림 2.하세요 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 위해.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

미디어 A. 준비 : <table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 피더 세포 야생 유형 매체 </td><td colspan="2"> 피더 셀 선택 매체 </td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 집중 </td><td> 시약 </td><td> 집중 </td></tr><tr><td> DMEM - 햄의 / F12 </td><td></td><td> DMEM - 햄의 / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 365 μg / ML </td><td> L - 글루타민 </td><td> 365 μg / ML </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 MM </td><td> HEPES </td><td> 10 MM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 μg / ML </td><td> Gentamycin </td><td> 15 μg / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td> G - 418 </td><td> 0.7 MG / ML </td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40 - B 세척 매체 </td><td colspan="2"> CD40 - B 문화 매체 </td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 집중 </td><td> 시약 </td><td> 집중 </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 584 μg / ML </td><td> L - 글루타민 </td><td> 584 μg / ML </td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25 MM </td><td> HEPES </td><td> 25 MM </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 μg / ML </td><td> Gentamycin </td><td> 15 μg / ML </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> RH 트랜스페린 </td><td> 50 μg / ML </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> RH 인슐린 </td><td> 5 μg / ML </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB - Humanserum </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. 기타 시약 : <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 아니오를 주문하지 </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / 햄의 F12 </td><td> PAA </td><td> 고양이 번호 : E15 - 813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 PBS (10X) </td><td> PAA </td><td> 고양이도없는 H15 - 011 </td></tr><tr><td> AB - 인간 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 고양이도없는 34,005,100 </td></tr><tr><td> 홀로그램 트랜스페린 인간 </td><td> 시그마 </td><td> 고양이도없는 T0665 </td></tr><tr><td> 인슐린 인간 </td><td> 시그마 </td><td> 고양이도없는 I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td> 델타 선택 </td><td> 예술 없음 7,395,800 </td></tr><tr><td> 재조합 인간 인터루킨 - 4 </td><td> Immunotools </td><td> 고양이도없는 11,130,045 </td></tr><tr><td> 시클 로스 포린 </td><td> 노바티스 </td><td> 고양이도없는 NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> 고양이도없는 DE14 - 802C </td></tr><tr><td> HEPES 버퍼 </td><td> PAA </td><td> 고양이도없는 S11 - 001 </td></tr><tr><td> G - 418 황산염 </td><td> PAA </td><td> 고양이도없는 P02 - 012 </td></tr><tr><td> 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10X) </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table> C. 기타 용품 : <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 아니오를 주문하지 </td></tr><tr></tr><tr><td> 멸균 피펫 팁 </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 웰 플레이트 </td><td> NUNC </td><td> 고양이도 140,675 </td></tr><tr><td> 50mL 원뿔 관 </td><td> BD 팰컨 ™ </td><td> 고양이도 352,070 </td></tr><tr><td> 조직 문화 플라스크 </td><td> SARSTEDT </td><td> 고양이도없는 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

인간 cd40 - 활성화된 b 세포의 생성

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40 - 활성화된 B 세포는 (CD40 - B 세포) 단백질 stimulatory 항원 제시 암 immunotherapy에 대한 세포 (APC하는) 1-3의 대체 소스로 확인되었습니다. CD40 - B 세포가 여러 가지 서로 다른 생물 학적 및 기술적 특성을 가지고 돌기 세포 (DCS), 최고의 특징 APC, 비교. DC가 마찬가지로, B 세포는 MHC와 공동 stimulatory 분자 (Fig.1b)의 증가 표현을 표시, 인터루킨 - 4 및 CD40 리간드 (CD40L)와 자극 후 강력한 철새 용량과 효율적인 T 세포에 존재 항원 프레 젠 테이션을 나타냅니다. 그러나, 미숙 또는 성숙 DC가와는 대조적으로, CD40 - B 세포는 CD62L, CCR7/CXCR4 이루어진 전체 림프절 유도 깡패을 표현하고, 보조 림프 기관으로 유도하기 위해 필요한 백혈구 기능 항원 - 1 (LFA1, CD11a/CD18) (Fig.1a) 3. CD40 - B 세포는 더욱 높은 순수 CD40 - B 세포를 건강한 기증자로부터 (&gt; 10 9 환자 당 세포)뿐만 아니라 암 매우 다량으로 체외로 확장시킬 수 말초혈 매우 소량의 어려움없이 생성할 수 있습니다 환자 (Fig.1c, D) 1,4. 이 프로토콜에서 우리는 인간의 PBMC에서 완벽하게 작동 CD40 - B 세포를 얻는 방법을 보여줍니다. 세포 배양을위한 주요 분자는 CD40 리간드, 인터루킨 -4 (IL - 4) 및 시클 로스 포린 A (CSA), 3~4일 문화주기에 보충함하는. 아르 실험 목적 CD40 - 자극은 재조합 인간 CD40 리간드 (tCD40L NIH/3T3) 5을 표현 NIH/3T3 세포에 의해 제공됩니다. 비 transfected 세포와 오염을 방지하려면 transfectants에있는 인간 CD40 리간드 표현 (Fig.2) 정기적으로 확인되어야한다. 십사일 후 CD40 - B 세포 배양 이상 순도 95 프로지 B 세포 65 일 동안 CD40 - B 세포의 확장 기능을 1, 4의 손실없이 자주이 가능합니다 구성되어 있습니다. CD40 - B 세포가 효율적으로 프로세스를 차지하고 T 세포에 항원 제시 6. 그들은 소수 naϊve 모르지만, 또한 메모리 T 세포에게 7,8를 확장합니다. CD40 - 활성화된 B 세포는 B - 세포 활성화, 차별과 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그들은 종양에 대한 치료 또는 구 예방 접종을위한 유망한 도구를 나타냅니다.

이 비디오에서는 소개<em&gt; 예 생체내</emCD40 리간드와 인터루킨 - 4 자극에 의​​해 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)에서 인간 CD40 - 활성 B 세포의&gt; 생성 및 확장 (CD40 - B).

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

CD40 활성화 B 세포(CD40-B 세포)는 암 치료를 위한 면역 자극 항원 제시 세포(APC)의 대안적 공급원으로 확인되었습니다...

안녕하세요, 제 이름은 Alexander Shiku Van Hagen입니다. 저는 쾰른 대학 병원의 면역학 및 이식 면역학 연구소 소속입니다. 이 영상에서는 말초혈액 단핵구로부터 인간 CD40 활성 B 세포를 생성하는 방법을 보여드리겠습니다.우리 실험실의 주요 관심 분야 중 하나는 B 세포의 항체 독립적 기능에 관한 연구입니다. B 세포는 항체 생성자로서의 역할 외에도, 생리적 조건과 자가면역 질환 모두에서 항원 제시 세포로서 중요한 역할을 합니다. B 세포는 활성화된 후, 특히 CD 40을 통해 활성화될 때 강력한 항원 제시 및 면역 자극 능력을 획득할 수 있습니다.CD 40. 활성화된 B 세포는 수지상 세포와 비교했을 때 몇 가지 장점이 있습니다. 암 환자를 포함하여 소량의 말초혈액으로부터 상대적으로 낮은 비용으로 쉽게 증식시킬 수 있습니다.이제 박사 과정생인 Tanya Leic와 기술원 LER가 말초혈액에서 인간 CD 40 활성화 B 세포를 생성하는 방법에 대해 단계별로 소개해 드리겠습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Tanya Livi입니다. 저는 박사 과정생이며, 인간 CD 40 활성화 B 세포를 생성하는 방법을 시연하고자 합니다.이 절차는 본 연구실에서 최적화되었습니다. 주요 단계는 우선 피더 세포(feeder cells)를 준비하는 것입니다. 이를 위해 human CD 40 ligand가 형질전환된 N IH 33 세포를 사용하며, 해당 세포에 78 gray의 방사선을 조사한 후 6-well 플레이트에 도말합니다.둘째로, 정제된 PBMC로부터 인간 CD 40 활성 B세포 배양을 시작하며, 이 세포들에 인간 interleukin 4와 cyclosporine A를 처리한 후 6-well 플레이트의 feta 세포 위에 플레이팅합니다. 이 과정은 7일 차에 반복하며, 이후 세포 배양 14일 차까지 3~4일마다 반복합니다. 고순도의 인간 CD 40 활성 B세포를 얻기 위해, 갓 정제했거나 적절히 해동한 인간 PBMC를 사용하여 CD 40 활성 B세포 생성을 시작합니다.먼저 PBMC를 두 번 세척하며, 이를 위해 세포를 50 milliliter의 PBS에 재현탁합니다. PBMC를 1300 RPM(260 5G에 해당)에서 7분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 버리고, 세포를 다시 50 milliliter의 PBS에 현탁한 후 1100 RPM(190 G에 해당)에서 7분 동안 다시 원심 분리합니다. 상층액을 다시 버린 후 세포 수를 측정하기 위해 재현탁합니다.PBMC를 20 milliliter의 PBS에 현탁시키고 볼텍싱을 통해 세포를 충분히 혼합한 후 세포 수를 측정합니다. CD 40 B 배양에 필요한 양의 PBMC를 1200 RPM(220 5G에 해당)에서 5분 동안 원심분리합니다. 6-웰 플레이트를 사용할 경우, 웰당 4 × 10⁶개의 세포가 필요하며, 플레이트당 총 24 × 10⁶개의 세포가 필요합니다.그런 다음 PBMC를 CD 40 B 배양액에서 1 × 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 세포 현탁액에 자극을 위해 50 units/mL 농도의 신선한 인간 IL-4를 첨가하고, T세포의 증식을 억제하기 위해 0.63 µg/mL 농도의 cyclosporine A를 첨가합니다. 이제 PBMC 현탁액은 CD 40 리간드로 자극할 준비가 되었습니다.저희가 알고 있는 바로는, 현재 기능성 GMP 등급의 SOMAL CD 40 리간드는 사용 가능하지 않습니다. 따라서 저희는 NIH 3T3 세포주가 배양 상태에서 수개월 동안 생존할 수 있다는 점을 이용하여, 세포 생존, 분화 및 증식을 자극하기 위해 인간 CD 40 리간드가 형질전환된 NIH 3T3 세포를 사용합니다. CD 40 리간드 발현의 소실 여부는 정기적으로 확인하여 배제해야 합니다.CD 40 ligand가 형질전환된 NIH 3T3은 부착성 세포주이며, 0.7 mg/mL 농도의 G 418이 첨가된 선택 배지에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 배양합니다. 이 부착성 섬유아세포 세포주는 완전히 합류(confluent)되지 않도록 해야 하며, 주 2회 분할 배양해야 합니다. 부착 세포를 분할하려면 배지를 흡입하여 제거하고 10 mL PBS로 한 번 세척한 후 부드럽게 흔들어 줍니다. 다시 배지를 흡입하여 제거하고 75 cm² 플라스크에 4 mL trypsin EDTA를 첨가합니다.플라스크를 인큐베이터에서 37°C로 5~10분 동안 배양합니다. 플라스크를 다시 꺼냅니다. 플라스틱에서 세포를 떼어내기 위해 가볍게 두드립니다.그런 다음 야생형 배지 10 milliliter를 첨가하고 부드럽게 흔들어 섞은 후, 세포를 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. NA eight three T three 세포를 1200 RPM(120 5G에 해당)에서 5분 동안 원심 분리합니다. 침전된 세포를 야생형 배지 10 millimeter에 조심스럽게 재현탁합니다.N IH 33 계대 배양의 세포 수를 측정하고 1.5 × 10⁶개의 feeder cell을 10 mL의 야생형 배지에 재현탁합니다. 이를 75 cm² 플라스크로 옮기고, 네오마이신 내성 유전자를 가진 형질전환 세포를 선별하기 위해 0.7 mg/mL 농도의 G 418을 첨가합니다. 마지막으로 feeder cell을 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하여 CD 40 B 자극을 유도합니다.나머지 NI 8 3 3 세포를 취하여 78 Gy로 치사량 조사하여 증식을 중단시킵니다. 조사된 피더 세포(feeder cells)를 세포 밀도가 0.1 × 10⁶ cells/mL가 되도록 배양액으로 희석하여 6-웰 플레이트의 각 웰에 2 mL씩 분주합니다. CD 40 리간드를 이용한 B 림프구 자극을 위해 피더 세포로 사용하기 전, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하여 6-웰 플레이트의 세포들이 다시 부착되도록 합니다.현미경으로 전날 분주한 피더 세포(feeder cells)가 부착되었는지 확인하십시오. 피더 세포가 부착되었다면, 각 웰에서 SUP natin을 제거하고 빠르게 두 번 세척하십시오. 먼저 각 웰을 2 mL PBS로 세척하고, 두 번째로 2 mL로 세척하십시오.PBMC 현탁액 자극을 위한 CD 40 B 세척 배지. 피더 세포(feeder cells)에 대해 1×10⁶ cells/mL의 세포 밀도로 직전에 준비합니다. 이를 위해, 각 웰에 세포 현탁액 4 mL를 조심스럽게 옮깁니다.7일째에 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. CD 40 B 세포는 7일째에 활성화된 B 세포를 대상으로 첫 번째 CD 40 계대 배양을 할 수 있으며, 이후 3~4일마다 계대 배양을 수행합니다.6-웰 플레이트에서 응집된 세포를 Resus로 조심스럽게 수확하고, 10 mL 파이펫으로 부유시킵니다. CD 40 B 세포를 50 mL 튜브에 옮깁니다. CD 40 B 세포를 1200 RPM(220 ×g에 해당)에서 7분 동안 완전히 원심분리합니다.배지를 CD 40 B 세척 배지로 교체하고 활성화된 CD 40 B 세포의 세포 수를 측정합니다. CD 40 B 세포를 CD 40 B 배양 배지에서 1×10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다.그런 다음, 자극을 위해 신선한 인간 IL-4를 50 units/mL 농도로, cyclosporine A를 0.63 µg/mL 농도로 세포 현탁액에 보충합니다. 하루 전에 준비한 조사된 피더 세포를 사용합니다. 물론, 조사된 피더 세포는 사용 직전에 현미경으로 부착 상태를 다시 확인해야 합니다.세포가 부착되었다면, 이전과 마찬가지로 먼저 PBS로 한 번, 그다지 CD 40 B 세척액으로 또 한 번 빠르게 세척합니다. 그런 다음 1 × 10⁶ cells/mL로 농도를 맞춘 CD 40 B 현탁액 4 mL를 6-well 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 분주합니다. 이러한 계대 배양을 3~4일 간격으로 일주일에 두 번 동일하게 반복하여, 배양 14일 차에 고순도의 인간 CD 40 활성화 B 세포 클러스터를 얻습니다.이 시점에서 CD 40 B 세포는 CD 80, CD 86, CD 83 MHC 분자와 같은 공동 자극 분자와 소위 림프절 호밍 트라이어드인 CD 62 리간드, CCR 7 및 LFA 1을 발현하며, 이는 생성 과정 중 유세포 분석기(Fox)를 통해 확인할 수 있습니다. 문제 해결을 위해서는 본 프로토콜의 텍스트 버전을 참조하십시오. 향후 CD 40 활성화 B 세포가 암 면역 치료를 위한 중요한 도구로 활용되기를 기대합니다.실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

generation-of-human-cd40-activated-b-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 CD40 - 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마​​우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

에서 유전자의 구조와 기능 분석의 효율적인...

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

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In vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors(일반 림프구 전구 세포에서 Plasmacytoid 수지상 세포의 체외 생성)

이 동영상은 종양 항원 특이적 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 CD8αβ+ T 세포를 생성하는 분석을 보여줍니다. 종양 항원 특이적 iPSC는 기질 세포 단층에서 성장하며 조혈전구세포(HPC)로 분화됩니다. HPC는 분화 배지를 사용하여 CD4+, CD8+, 이중 양성 T 세포로 분화됩니다. 그런 다음 이러한 세포를 자극하여 CD8을 발현하는 단일 양성 T 세포를 생성합니다.

유도 만능 줄기 세포에서 단일 양성 CD8 T 세포 생성

이 논문은 정의된 동종항원에 특이적으로 반응하는 인간 T 세포 클론의 생성 및 증식 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 펩타이드-MHC 리간드에 특이적인 인간 T 세포를 클로닝하는 데 적용할 수 있습니다.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

여기서 우리는, 기존 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 페어링 말초 T 세포 수용체 레퍼토리 상보 hemichain으로 관심 항원 특이성을 보유하여 항원 특이 적 T 세포 수용체 (TCR도)을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 드 노보 생성 TCR도 선호도 변화와 항원 특이성을 유지한다.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

여기에서는 인간 항응고 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 말초 혈액 단핵 세포에서 자기 비드 분리에 의해 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 5일 동안 배양한 후 인간 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화되고 비임상 환경에서 실험 절차를 수행할 준비가 됩니다.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

생체 외에서 B 세포 플라즈마 세포 차별화 모델을 보고 다단계 문화 시스템을 사용 하 여, 우리.

수명이 긴 플라즈마 세포에 인간의 정상적인 메모리 B 세포의 체 외 분화 모델

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

배우세요 인간 CD40-활성화 B 세포를 말초혈액 단핵세포에서 배양하는 방법을. CD40 리간드와 인터루킨-4로 자극하여 항원제시능력을 향상시키는 면역학 기술입니다.

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

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