인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

안녕하세요, 제 이름은 Alexander Shiku Van Hagen입니다. 저는 쾰른 대학 병원의 면역학 및 이식 면역학 연구소 소속입니다. 이 영상에서는 말초혈액 단핵구로부터 인간 CD40 활성 B 세포를 생성하는 방법을 보여드리겠습니다.

우리 실험실의 주요 관심 분야 중 하나는 B 세포의 항체 독립적 기능에 관한 연구입니다. B 세포는 항체 생성자로서의 역할 외에도, 생리적 조건과 자가면역 질환 모두에서 항원 제시 세포로서 중요한 역할을 합니다. B 세포는 활성화된 후, 특히 CD 40을 통해 활성화될 때 강력한 항원 제시 및 면역 자극 능력을 획득할 수 있습니다.

CD 40. 활성화된 B 세포는 수지상 세포와 비교했을 때 몇 가지 장점이 있습니다. 암 환자를 포함하여 소량의 말초혈액으로부터 상대적으로 낮은 비용으로 쉽게 증식시킬 수 있습니다.

이제 박사 과정생인 Tanya Leic와 기술원 LER가 말초혈액에서 인간 CD 40 활성화 B 세포를 생성하는 방법에 대해 단계별로 소개해 드리겠습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Tanya Livi입니다. 저는 박사 과정생이며, 인간 CD 40 활성화 B 세포를 생성하는 방법을 시연하고자 합니다.

이 절차는 본 연구실에서 최적화되었습니다. 주요 단계는 우선 피더 세포(feeder cells)를 준비하는 것입니다. 이를 위해 human CD 40 ligand가 형질전환된 N IH 33 세포를 사용하며, 해당 세포에 78 gray의 방사선을 조사한 후 6-well 플레이트에 도말합니다.

둘째로, 정제된 PBMC로부터 인간 CD 40 활성 B세포 배양을 시작하며, 이 세포들에 인간 interleukin 4와 cyclosporine A를 처리한 후 6-well 플레이트의 feta 세포 위에 플레이팅합니다. 이 과정은 7일 차에 반복하며, 이후 세포 배양 14일 차까지 3~4일마다 반복합니다. 고순도의 인간 CD 40 활성 B세포를 얻기 위해, 갓 정제했거나 적절히 해동한 인간 PBMC를 사용하여 CD 40 활성 B세포 생성을 시작합니다.

먼저 PBMC를 두 번 세척하며, 이를 위해 세포를 50 milliliter의 PBS에 재현탁합니다. PBMC를 1300 RPM(260 5G에 해당)에서 7분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 버리고, 세포를 다시 50 milliliter의 PBS에 현탁한 후 1100 RPM(190 G에 해당)에서 7분 동안 다시 원심 분리합니다. 상층액을 다시 버린 후 세포 수를 측정하기 위해 재현탁합니다.

PBMC를 20 milliliter의 PBS에 현탁시키고 볼텍싱을 통해 세포를 충분히 혼합한 후 세포 수를 측정합니다. CD 40 B 배양에 필요한 양의 PBMC를 1200 RPM(220 5G에 해당)에서 5분 동안 원심분리합니다. 6-웰 플레이트를 사용할 경우, 웰당 4 × 10⁶개의 세포가 필요하며, 플레이트당 총 24 × 10⁶개의 세포가 필요합니다.

그런 다음 PBMC를 CD 40 B 배양액에서 1 × 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 세포 현탁액에 자극을 위해 50 units/mL 농도의 신선한 인간 IL-4를 첨가하고, T세포의 증식을 억제하기 위해 0.63 µg/mL 농도의 cyclosporine A를 첨가합니다. 이제 PBMC 현탁액은 CD 40 리간드로 자극할 준비가 되었습니다.

저희가 알고 있는 바로는, 현재 기능성 GMP 등급의 SOMAL CD 40 리간드는 사용 가능하지 않습니다. 따라서 저희는 NIH 3T3 세포주가 배양 상태에서 수개월 동안 생존할 수 있다는 점을 이용하여, 세포 생존, 분화 및 증식을 자극하기 위해 인간 CD 40 리간드가 형질전환된 NIH 3T3 세포를 사용합니다. CD 40 리간드 발현의 소실 여부는 정기적으로 확인하여 배제해야 합니다.

CD 40 ligand가 형질전환된 NIH 3T3은 부착성 세포주이며, 0.7 mg/mL 농도의 G 418이 첨가된 선택 배지에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 배양합니다. 이 부착성 섬유아세포 세포주는 완전히 합류(confluent)되지 않도록 해야 하며, 주 2회 분할 배양해야 합니다. 부착 세포를 분할하려면 배지를 흡입하여 제거하고 10 mL PBS로 한 번 세척한 후 부드럽게 흔들어 줍니다. 다시 배지를 흡입하여 제거하고 75 cm² 플라스크에 4 mL trypsin EDTA를 첨가합니다.

플라스크를 인큐베이터에서 37°C로 5~10분 동안 배양합니다. 플라스크를 다시 꺼냅니다. 플라스틱에서 세포를 떼어내기 위해 가볍게 두드립니다.

그런 다음 야생형 배지 10 milliliter를 첨가하고 부드럽게 흔들어 섞은 후, 세포를 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. NA eight three T three 세포를 1200 RPM(120 5G에 해당)에서 5분 동안 원심 분리합니다. 침전된 세포를 야생형 배지 10 millimeter에 조심스럽게 재현탁합니다.

N IH 33 계대 배양의 세포 수를 측정하고 1.5 × 10⁶개의 feeder cell을 10 mL의 야생형 배지에 재현탁합니다. 이를 75 cm² 플라스크로 옮기고, 네오마이신 내성 유전자를 가진 형질전환 세포를 선별하기 위해 0.7 mg/mL 농도의 G 418을 첨가합니다. 마지막으로 feeder cell을 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하여 CD 40 B 자극을 유도합니다.

나머지 NI 8 3 3 세포를 취하여 78 Gy로 치사량 조사하여 증식을 중단시킵니다. 조사된 피더 세포(feeder cells)를 세포 밀도가 0.1 × 10⁶ cells/mL가 되도록 배양액으로 희석하여 6-웰 플레이트의 각 웰에 2 mL씩 분주합니다. CD 40 리간드를 이용한 B 림프구 자극을 위해 피더 세포로 사용하기 전, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하여 6-웰 플레이트의 세포들이 다시 부착되도록 합니다.

현미경으로 전날 분주한 피더 세포(feeder cells)가 부착되었는지 확인하십시오. 피더 세포가 부착되었다면, 각 웰에서 SUP natin을 제거하고 빠르게 두 번 세척하십시오. 먼저 각 웰을 2 mL PBS로 세척하고, 두 번째로 2 mL로 세척하십시오.

PBMC 현탁액 자극을 위한 CD 40 B 세척 배지. 피더 세포(feeder cells)에 대해 1×10⁶ cells/mL의 세포 밀도로 직전에 준비합니다. 이를 위해, 각 웰에 세포 현탁액 4 mL를 조심스럽게 옮깁니다.

7일째에 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. CD 40 B 세포는 7일째에 활성화된 B 세포를 대상으로 첫 번째 CD 40 계대 배양을 할 수 있으며, 이후 3~4일마다 계대 배양을 수행합니다.

6-웰 플레이트에서 응집된 세포를 Resus로 조심스럽게 수확하고, 10 mL 파이펫으로 부유시킵니다. CD 40 B 세포를 50 mL 튜브에 옮깁니다. CD 40 B 세포를 1200 RPM(220 ×g에 해당)에서 7분 동안 완전히 원심분리합니다.

배지를 CD 40 B 세척 배지로 교체하고 활성화된 CD 40 B 세포의 세포 수를 측정합니다. CD 40 B 세포를 CD 40 B 배양 배지에서 1×10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다.

그런 다음, 자극을 위해 신선한 인간 IL-4를 50 units/mL 농도로, cyclosporine A를 0.63 µg/mL 농도로 세포 현탁액에 보충합니다. 하루 전에 준비한 조사된 피더 세포를 사용합니다. 물론, 조사된 피더 세포는 사용 직전에 현미경으로 부착 상태를 다시 확인해야 합니다.

세포가 부착되었다면, 이전과 마찬가지로 먼저 PBS로 한 번, 그다지 CD 40 B 세척액으로 또 한 번 빠르게 세척합니다. 그런 다음 1 × 10⁶ cells/mL로 농도를 맞춘 CD 40 B 현탁액 4 mL를 6-well 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 분주합니다. 이러한 계대 배양을 3~4일 간격으로 일주일에 두 번 동일하게 반복하여, 배양 14일 차에 고순도의 인간 CD 40 활성화 B 세포 클러스터를 얻습니다.

이 시점에서 CD 40 B 세포는 CD 80, CD 86, CD 83 MHC 분자와 같은 공동 자극 분자와 소위 림프절 호밍 트라이어드인 CD 62 리간드, CCR 7 및 LFA 1을 발현하며, 이는 생성 과정 중 유세포 분석기(Fox)를 통해 확인할 수 있습니다. 문제 해결을 위해서는 본 프로토콜의 텍스트 버전을 참조하십시오. 향후 CD 40 활성화 B 세포가 암 면역 치료를 위한 중요한 도구로 활용되기를 기대합니다.

실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.