호르세쇼 크랩을 사용하여, Limulus Polyphemus 비전 연구

안녕하세요, 저는 보스턴 대학교 생명공학과 시각 정보 처리 연구실의 소장인 Chris Paglia입니다. 안녕하세요, 저는 Paglia 박사님 연구실의 박사 과정 학생인 Jacque Liu입니다. 저희 연구실은 동물이 시각 정보를 인식할 수 있게 하는 신경 계산 과정을 이해하는 데 연구 역량을 집중하고 있습니다.

본 연구에서는 지구상에서 가장 오래된 생물 중 하나인 미국 투구게를 사용합니다. 이 동물들은 살아있는 화석일 수 있으며, 생의학 연구에서 계속해서 필수적인 역할을 수행하고 있습니다.

이들의 혈액에는 과학자들이 의약품 내 박테리아 독소를 검출하는 데 사용하는 특수한 세포가 포함되어 있을 뿐만 아니라, 눈에는 우리의 시각 시스템이 어떻게 작동하는지에 대한 많은 통찰을 제공한 신경망이 포함되어 있습니다. 빛 적응 및 측방 억제와 같은 과정의 세포학적 기초는 이 동물의 복합 측안 연구를 통해 처음으로 밝혀졌으며, 이러한 선구적인 연구로 Keffer Hartline 박사는 1967년에 노벨상을 받았습니다. 투구게는 무척추동물치고는 크고 강인하며, 망막 뉴런이 크고 접근하기 쉽기 때문에 시각 연구를 위한 매력적인 모델로 남아 있습니다.

투구게의 시각 시스템은 소형이며 광범위하게 연구되었고, 그 시각적 행동 또한 잘 정의되어 있습니다. 더욱이, 눈의 구조와 기능은 동물의 뇌에 있는 서카디언 리듬 시계에 의해 매일 조절됩니다. 요약하자면, 투구게의 시각 시스템은 이해하기 충분히 단순하면서도, 흥미를 끌 만큼 충분히 복잡합니다.

이 영상에서는 이 전형적인 동물 모델을 이용하여 생체 내(in vivo)에서 수행할 수 있는 시각의 신경학적 기초 연구를 위한 세 가지 실험 패러다임을 설명하겠습니다. 시각 연구를 위해 망막전위도(ERG) 기록, 시신경 기록, 그리고 망막 내 기록을 수행합니다. 투구게는 조절된 명암 주기에 노출된 방의 폭기 소금물 수조에서 사육됩니다.

이러한 기록 기술을 시작하기 전에, 동물을 얼음 바구니에 약 10분 동안 넣어 냉각시킨 다음, pro soma에 두 개의 스테인리스 스틸 나사를, EPIs soma에 두 개의 나사를 박아 나무 플랫폼에 고정했습니다. 플랫폼 아래쪽에는 화강암 무게추를 달아 물속으로 가라앉게 했습니다. 망막전위도 또는 ERG는 시간에 따른 눈의 민감도를 모니터링하는 데 사용됩니다.

이는 눈에 있는 모든 세포의 전체적인 전기적 반응을 측정합니다. 빛 플래시를 위해 이 과정에 필요한 도구로는 드라이버, 바세린, 링거액, 피펫, LED, 기록 챔버, 스테인리스 스틸 나사 및 면봉이 포함됩니다. ERG를 측정하기 위해 자체 제작한 기록 챔버를 사용합니다.

본체는 식염수 저장조가 눈에 접촉하도록 설계되었습니다. 뚜껑에는 전도성 용액을 증폭기에 연결하기 위한 염화은 와이어와 부착 전 LED를 장착할 수 있는 크기의 작은 구멍이 있습니다. 챔버의 바닥면은 바셀린으로 코팅되어 있습니다.

그다음 두 개의 나사로 투구게의 눈 위에 챔버를 고정한 후, 식염수를 채우고 캡으로 닫습니다. 동물을 아가미가 잠길 정도의 해수가 채워진 수조 내의 차광 케이지에 넣습니다. LED 케이블을 챔버 뚜껑에 삽입합니다.

신호 리드는 챔버 와이어에, 기준 리드는 식립된 나사 중 하나에 클립으로 고정하고, 두 리드 모두 신호 증폭 및 노이즈 필터링을 위해 고임피던스 차동 증폭기의 헤드 스테이지에 연결합니다. 그런 다음 케이지를 닫아 실내 조명이 동물에게 닿지 않도록 합니다. AD 스테이지를 증폭기에 연결하고, 증폭기 필터를 약 10 hertz 미만의 주파수가 통과하도록 설정합니다.

그 후, 신호는 관찰을 위해 오실로스코프로, 컴퓨터 분석 및 저장을 위해 데이터 수집 보드로 전송됩니다. LED로부터 빛 자극을 전달하고 ERG 신호를 기록하기 위해 LabVIEW로 작성된 맞춤형 프로그램을 사용합니다. LED는 10분마다 5V의 100 millisecond 펄스로 트리거됩니다. 왼쪽에는 각 빛 플래시에 대한 ERG 파형이 표시되며, 오른쪽에는 시간에 따른 안구 민감도 변화를 추적하기 위해 연속적인 플래시 파형의 peak to peak 진폭이 도식화되어 있습니다.

ERG 기록을 통해 빛 적응 및 일주기 신경 조절의 효과를 연구할 수 있습니다. 눈은 뇌로 시각적 메시지를 전달하며, 시신경 섬유의 스파이크 반응을 유도합니다. 이렇게 인코딩된 메시지는 단일 신경 섬유에서 세포 외 기록을 수행함으로써 연구할 수 있습니다.

이 방법을 통해 눈으로 되돌아오는 서카디안 리듬(circadian clock) 메시지 또한 연구할 수 있습니다. 이 절차에 필요한 도구로는 드라이버, 세척액, 핀셋, 가위, 기록 챔버, 곡선 핀셋, 미세 바늘 프로브, 무딘 메스, 수술용 가위 및 단면 전극이 포함됩니다. 신경을 수용할 수 있는 혀 모양의 구조로 설계된 기록 챔버는 16 gauge 바늘을 힌지 근육과 심장 사이에 삽입하여 말의 대퇴동맥으로부터 20 milliliters의 혈액을 추출하여 채울 수 있습니다.

방혈이 필수적인 것은 아니나, 동물을 플랫폼에 고정한 상태에서 시신경 절제를 더 용이하게 해줍니다. 시신경의 위치는 외안과 내안 사이의 카르푸스(carpus) 위에 약간 굽은 선을 그려 추정합니다. 그런 다음 리파인(refin)을 사용하여 카르푸스에 원형 구멍을 뚫습니다.

구멍의 직경은 챔버 바닥의 직경과 동일합니다. 구멍의 중심은 외안(lateral eye)에서 전방으로 약 2cm, 그리고 신경이 챔버의 복측부를 따라 주행하도록 기준선보다 약간 등측에 위치시킵니다. 신경의 전체 길이가 보일 때까지 결합 조직을 제거하고, 노출된 신경을 주변 및 하부 조직으로부터 분리합니다. 실 한 가닥을 신경 주위에 걸어 바닥의 반원형 개구부를 통해 챔버 내부로 끌어당깁니다.

동일한 개구부를 통해 실을 당겨 신경을 챔버 안으로 조심스럽게 안내합니다. 신경이 챔버로 들어갈 때, 신경에 가해지는 신장을 최소화하기 위해 챔버 바닥을 구멍 쪽으로 밀어 넣습니다. 그 다음 챔버를 두 개의 나사로 고정하고 링거 용액(ringer solution)으로 채웁니다.

챔버를 부착한 후, 동물을 아가미 높이까지 바닷물이 채워진 수조 내의 가벼운 구속 케이지에 넣습니다. 실체 현미경으로 챔버 내부를 관찰하고, 혈액이 챔버 내부로 유입되거나 링거액이 외부로 유출되는 것을 방지하기 위해 바닥 개구부 주변에 솜을 채웁니다. 그 후 챔버를 신선한 Ringer 용액으로 다시 채웁니다.

잔여 조직을 미세 가위와 핀셋으로 제거합니다. 신경을 감싸고 있는 초(sheath)에 작은 절개를 넣고, 미세 바늘 프로브를 사용하여 초에서 신경을 분리합니다. 신경의 길이를 따라 절개하여 초를 서서히 풀어 제거합니다.

그 후 프로브를 사용하여 신경에서 작은 섬유 다발을 분리하고, 구심성 섬유 기록을 위해서는 눈에서 가장 먼 끝부분을, 원심성 섬유 기록을 위해서는 눈에서 가장 가까운 끝부분을 절단합니다. 기록을 위해 Springer solution이 채워진 AM system section 전극을 사용하며, 이는 흡입을 위해 튜브로 Gilman syringe와 연결됩니다. 전극 팁은 직경 1mm의 borosilicate glass 모세관 끝부분을 화염 연마하여 제작합니다. B 및 C 연결은 신호 리드선을 제공하며, 노이즈를 줄이기 위해 전극 주위에 감은 Silver chloride 와이어가 기준 리드선 역할을 합니다.

전극 팁을 기록 챔버 내에 배치하고, 흡입을 통해 신경 다발의 절단단을 유리 팁 안으로 끌어당깁니다. 신호 및 참조 리드는 신호 증폭과 노이즈 필터링을 위해 차동 증폭기의 헤드 스테이지에 연결합니다. 증폭기 출력은 시각화를 위한 오실로스코프와 컴퓨터 분석 및 저장을 위한 데이터 수집 카드로 전달됩니다.

우리는 빛 자극을 제어하기 위해 LabVIEW로 작성된 맞춤형 프로그램과 스파이크 열을 기록하기 위한 디지털 스파이크 판별기를 사용합니다. 단일 세포 조명에는 광섬유 라이트 파이프가 사용되며, 시신경 기록을 통한 패턴 자극에는 컴퓨터 제어 비디오 디스플레이가 사용됩니다. 이를 통해 안구와 뇌 사이의 망막 내 신호 전달을 연구할 수 있습니다. 기록 과정은 미세 전극을 안구 내 세포에 직접 삽입하고 빛에 의해 유도된 세포 내 전압 변동을 기록하는 방식으로 이루어집니다.

이 절차에 필요한 도구로는 드라이버, L자형 투명 플랫폼, 유리 전극 상단을 고정하기 위한 나사산 미세 전극 구멍, 스테인리스 스틸 나사, 핀셋 및 정밀 메스가 포함됩니다. 게를 단단히 고정한 후, 나무 플랫폼과 미리 나사 구멍이 뚫린 투명 플레이트를 손목 마디(carpus)의 측면 두 곳과 상단 한 곳에 나사 두 개와 하나로 부착합니다.

동물을 아가미 위까지 바닷물이 채워진 수조 내의 차광 케이지에 넣습니다. 전동식 마이크로 포지셔너를 나사로 블레이드에 고정하고, 포지셔너 암을 눈 위에 정렬합니다. 외경 1mm의 실리케이트 유리를 사용하여 유리 마이크로 피펫 일괄분을 제작하고, 모세관 현상을 통해 팁 내부를 채웁니다.

피펫을 3M 염화칼륨 용액이 담긴 바이알에 몇 분간 담근 후, 피펫의 나머지 부분을 염기 용액으로 수동으로 채우고 기포 형성을 방지하기 위해 용액이 미리 채워진 미세 전극 홀더에 삽입합니다. 그런 다음 전극 홀더를 마이크로 포지셔너에 고정된 세포 내 증폭기의 헤드 스테이지에 삽입합니다. 배측 각막의 작은 정사각형 구역을 조심스럽게 절개하여 망막의 일부를 노출시킵니다.

메스로 노출된 조직 위에 링거액(Ringer Solution) 한 방울을 떨어뜨려 건조를 방지하고, 마이크로 피펫을 망막 쪽으로 전진시킵니다. 피펫 팁이 용액에 닿으면 세포 내 증폭기의 전류 주입 모드를 활성화하여 전극 임피던스를 측정하며, 임피던스가 20에서 70 mega ohms 범위를 벗어나는 마이크로 피펫은 폐기합니다. 해당 범위 내의 피펫을 마이크론 단위의 단계로 망막 내부로 전진시킨 후, 팁을 전자적으로 진동시켜 세포에 삽입하며, 광섬유 파이프나 비디오 디스플레이를 통해 빛 자극을 전달하여 세포를 천자합니다.

투구게의 눈에서는 ular 세포, eccentric 세포, 그리고 색소 세포라는 세 가지 유형의 세포를 발견할 수 있습니다. ular 세포는 빛에 대해 큰 탈분극 반응을 보이며, eccentric 세포는 탈분극 반응 위에 일련의 활동 전위가 나타나는 특성을 보이고, 색소 세포는 빛에 대한 반응이 전혀 나타나지 않습니다. 이러한 반응은 망막 내 기록법을 통해 오실로스코프로 관찰하고 컴퓨터에 기록합니다. 이를 통해 시각의 세포적 기반을 연구할 수 있습니다.

결론적으로, 본 영상에서는 투구게를 대상으로 생체 내(in vivo)에서 망막전위도(electroretinogram) 기록, 시신경 기록 및 망막 내 기록을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이러한 방법들은 널리 사용되고 있으며, 투구게의 시각 정보 처리 신경 기전에 대한 독특한 통찰을 제공합니다. 이 기법들은 연구실에서 적용하기 간편할 뿐만 아니라, 시각 신경생리학 교육 과정에도 쉽게 도입할 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.