Name: 대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: 배우세요 계절성 저산소 피오르드 환경에서 fosmid 라이브러리를 구축하는 방법을. E. coli를 이용한 파지 포장과 자동화된 콜로니 선별을 통해 미생물 다양성 연구를 위한 대형 삽입 환경 게놈 라이브러리를 제작합니다.

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우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. MT와 SL은 미생물 다양성과 진화 (CMDE)의 툴라 기초 투자 센터에서 장학금으로 지원했다. MT 또한 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 화목 지원을 받았습니다.

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

절차는 가장 효율적으로 해안 물 샘플에서 파생된 게놈 DNA와 큰 삽입 fosmid 라이브러리를 생성하는 방법을 설명합니다. 업 - 스트림 게놈의 DNA 추출은 별도의 프로토콜 [3]에 설명되어 있습니다. fosmid 라이브러리 생산 다단계 프로세스, 계획 네 명 모두 제공 단계를 포함하여 모든 절차에 시간에 최소한 2~3주 때문입니다. 게놈 DNA의 추출은 가장 중요한 단계와 단계를 추출한 게놈 DNA의 품질과 수량에 의존하는 모든 다운 스트림이며 때문에이 단계에 대한 충분한 시간을 보내는 고려하여 신중하게 작동합니다. 품질 및 추출한 DNA의 수량 조절은 매우 중요합니다. 이것이 당신이 만들려고하는 첫번째 라이브러리 특히 그것은 fosmid 클론의 숫자가 낮은 것을 발생할 수 있습니다. 자체 fosmid 라이브러리 건설 정직 한, 실패는 주로 귀하의 추출 및 정제 게놈 DNA의 부족 품질 및 / 또는 수량에 의해 발생합니다. 게놈 DNA를 다시 추출하여 도서관 공사가 성공...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;단계 II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CopyControl&amp;#8482; Fosmid Library Production Kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>fosmid 라이브러리 9-10개 생성에 충분한 양</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>교반 가열판</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>1.0X TAE 러닝 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉각 모듈 및 가변 속도 펌프를 포함한 CHEF Mapper XA 펄스장 전기영동 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#955; DNA-HindIII Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>MidRange I PFG Marker</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>10,000X SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>전자레인지 사용 가능 플라스틱 랩</td><td>Saran premium wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 트랜스일루미네이터</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>GELase Agarose Gel-Digesting Preparation</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Ultracel-10 멤브레인이 포함된 Amicon Ultra-4 원심분리 필터 유닛</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30 원심분리 필터 유닛</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 프리 워터</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>디지털 드라이 블록 히터</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>항온수조</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>원심분리 로터</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>탁상형 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리 튜브, 1.7 mL, 투명</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;단계 III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 배지</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>파지 희석 버퍼</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>냉동 보관 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;단계 IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 96웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 384웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 100 O.D. x 15mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 150 Dia. x 15mmH</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>LB 배지</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>QPix 콜로니 피커</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>피킹 헤드 (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

Large Insert Environmental Genomic Library Production

자연 미생물의 대부분은 현재 전통적인 재배 방식에 액세스할 수 남아 있습니다. 지난 10 년간, 문화, 독립적인 환경 게놈 (<em&gt; 예</em&gt; metagenomic) 접근 방식은 연구자가 환경에서 직접 토착 미생물 커뮤니티의 유전 내용을 캡처하여 재배 격차를 다리 수 있도록, 부상했습니다. 이를 위해 게놈 DNA 라이브러리 좋을 실험실 복제 기법 불구하고 표준을 사용하여 제작하고 있습니다. 여기서 우리는 계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속에서 파생된 DNA와 큰 삽입 환경 게놈 fosmid 라이브러리의 건설을 설명합니다. 이 프로토콜은 직접적으로 연안 해양 수질 샘플링 [1]을 포함한 연결 프로토콜 시리즈 연결된 미생물 바이오 매스의 대량 여과 [2]와 DNA 추출 및 정화 프로토콜 [3]. 다시 원점으로, 고품질의 게놈의 DNA는 5 phosphorylated 무딘 종료의 생성과 함께 최종 수리입니다. 최종 수리 DNA는 크기의 선택과 겔 추출이 30 60000 기본 쌍 (KB) 길이 사이의 DNA 조각을 복구 수행을위한 펄스 - 필드 겔 전기 영동 (PFGE)를 받게됩니다. 사이즈 선택 DNA는 PFGE 젤 매트릭스 멀리 정화 및 인산 가수 분해 효소 - 처리 무딘 엔드 fosmid CopyControl 벡터 pCC1 (EPICENTRE에 출혈도 잡았입니다<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). pCC1과 삽입 DNA의 선형 concatemers는 이후 파지 모성의 후속 감염, 람다 파지 terminase에 의해 입자로 포장 headfull 아르<em&gt; E. 대장균</em&gt; 세포. 성공적으로 transduced 클론은 항생제 선택에 따라 LB 한천 플레이트에 대한 회수 및 로봇을 따기 자동 콜로니 (Qpix2, GENETIX)를 사용하여 384 자 플레이트 형식으로 저장이됩니다. 현재 프로토콜은 EPICENTRE에서 CopyControl Fosmid 라이브러리 제작 키트 등 다양한 소스에서 그리는 여러 연구 그룹의 발표 작품 [4-7]. 각 단계는 마음에 모범 사례와 함께 제공됩니다. 우리 도서관 생산의 전반적인 품질과 효율성을 향상시키기 위해 실행 미묘을 강조 가능하다면. 포함된 여러 배양 단계가 같은 fosmid 라이브러리 제작 및 자동 식민지 따기의 전체 프로세스는 적어도 7~10일 걸립니다. 그러나, 프로토콜 내에서 설명하는 몇 가지 가능한 멈추는 지점이 있습니다.

계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속으로부터 격리 환경 게놈 DNA와 fosmid 라이브러리의 구축이 설명되어 있습니다. 그 결과 클론 라이브러리는 384 잘 접시에 들어서 자동 식민지 따기 시스템의 응용 프로그램에서 스트림 시퀀싱 및 기능 검사를 위해 보관됩니다.

자연계에 존재하는 대다수의 미생물은 현재까지 전통적인 배양 방법으로는 접근이 불가능한 상태로 남아 있습니다. 지난 10년 동안, 배양 독립적...

안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물학 및 면역학과의 Steven Helm 교수 연구실 소속 Marcus입니다. 오늘은 대형 삽입물 환경 라이브러리 구축 절차를 보여드리겠습니다. 오늘 실험에서는 San Lee 님이 파지 패키징과 라이브러리 숙주 e coli 감염을 담당하고, Elise Hawley 님과 Chin Yang 님이 콜로니 피킹을 도와주시겠습니다.본 실험실에서는 해양 및 육상 환경의 미생물 군집 구조와 대사를 연구하기 위해 이 절차를 수행하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다. fosmid DNA 라이브러리 제작을 위한 이 프로토콜은 바이오매스 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하고 셰어링(shearing)하는 과정 이후부터 시작되며, 해당 과정은 함께 제공되는 JoVE 논문에 상세히 기술되어 있습니다.다음 몇 단계에서는 SHE DNA를 SMID 벡터 PCC one에 결찰하기 위한 준비 과정을 거칩니다. 첫 번째 단계는 SHE DNA 조각의 말단을 수선하고 인산화하는 것입니다. 5' 말단 수선에 필요한 모든 시약은 epicenter의 PCC one SMID 라이브러리 제작 키트에 포함되어 있습니다. 말단 수선 반응을 설정하려면 모든 시약을 얼음 위에서 해동한 다음, 말단 수선 버퍼, DNTP, 0.5 µg/µL 농도의 SHE 삽입 DNA를 최대 20 µg까지, 효소 혼합물 및 물을 추가하여 최종 부피가 80 µL가 되도록 혼합합니다. 튜브를 짧게 원심 분리하여 모든 액체가 바닥에 모이게 합니다.말단 수복(end repair) 반응물을 상온에서 45분에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 70 °C에서 10분 동안 가열하여 효소를 불활성화합니다. 말단 수복 배양 과정 중에 다음 단계에 필요한 젤을 준비할 수 있습니다.펄스장 젤 전기영동(Pulsed field gel electrophoresis) 또는 PFGE의 목적은 30에서 60 Kilobases 범위의 DNA 분자를 분리하는 것입니다. PFGE는 표준 전기영동 시 함께 이동하는 이러한 거대 단편들을 분해하기 위한 전기영동 방법입니다. 우선, 150 milliliters의 1X TAE running buffer에 low melting agarose를 사용하여 1% 젤을 준비하십시오.80 µL의 end repair DNA 샘플과 로딩 버퍼 전체를 하나 또는 두 개의 웰에 넣을 수 있는 콤을 선택하십시오. 저융점 아가로스 겔은 겔이 응고되는 동안 매우

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Metagenomic 도서관 대규모 화면

여기 T7 RNA 선형 증폭을 기반으로 유전자 발현 분석을 위해 모두 하나의 읽기 및 이점 엔드 Illumina mRNA - Seq 시퀀싱 라이브러리의 준비를위한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 총 RNA를 시작하는 10 나노 그램이 필요하고 전체 성적표를 나타내는 매우 일관된 라이브러리를 생성합니다.

10 나노 그램 총 RNA의 단일 읽기와 결합하여 최종 mRNA - Seq의 Illumina 도서관

유전자 리포터 분석은 DNA 염기서열과 유전자 조절 활동 사이의 관계를 해부하기 위한 잘 정립되고 강력한 도구입니다. 후보 조절 요소를 식별 염기서열 태그를 운반하는 리포터 유전자에 결합하면 이러한 분석의 대규모 병렬화가 가능합니다.

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

이 원고는 차세대 염기서열분석을 위해 DNA 단편을 정제하기 위한 자동화된 겔 크기 선택 접근법을 설명합니다. Ranger Technology는 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편 회수의 전체 프로세스를 완전히 자동화하여 고처리량 및 고품질 차세대 염기서열분석 라이브러리를 가능하게 합니다.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

간단 하 고 효율적인 비용 효율적인 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하기 위한 방법 이어야 한다. 우리는 표적 DNA의 효소 소화에 따라 gRNA 라이브러리의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드를 CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대) 비용이 많이 드는 사용자 지정 oligonucleotide 종합에 대안을 선물 한다.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

PBIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 생성 유전자 변형 식물을 그대로 단일 복사본 삽입, 쉬운 과정을 만든다. 여기, 프로토콜의 시리즈는 유전자 변형 애기 식물을 생성 하 고 intactness에 대 한 식물을 테스트 과정을 통해 독자를 안내 하 고 삽입의 수를 복사 하 여.

BIBAC-GW 이진 벡터를 사용 하 여 단일 복사본 삽입을 가진 유전자 변형 식물 생성

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

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짧고 긴 읽기 시퀀싱 기술을 사용하여 요로나박테리아의 완전한 게놈 생성을 위한 하이브리드 드 노보 게놈 조립

삽입 돌연변이 유발은 기능적 게놈 요소를 식별하기 위한 순 유전학의 필수 도구입니다. 여기에서는 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 검출하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)에 대해 설명합니다.

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별)

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

배우세요 계절성 저산소 피오르드 환경에서 fosmid 라이브러리를 구축하는 방법을. E. coli를 이용한 파지 포장과 자동화된 콜로니 선별을 통해 미생물 다양성 연구를 위한 대형 삽입 환경 게놈 라이브러리를 제작합니다.

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

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