대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학의 미생물학 및 면역학과의 스티븐 헬름(Steven Helm) 연구실에서 근무하는 마커스입니다. 오늘은 대형 인서트 환경 라이브러리를 구성하는 절차를 보여 드리겠습니다. 오늘 절차를 도와준 것은 도서관 숙주 대장균의 파지 패키징 및 감염을 수행할 San Lee와 군체 채취를 수행할 Elise Hawley와 Chin Yang입니다.

우리 실험실에서는 해양 및 육상 환경에서 미생물 군집 구조와 신진대사를 연구하기 위해 이 절차를 시행하고 있습니다. 시작하겠습니다. fo smid DNA 라이브러리를 만들기 위한 이 프로토콜은 Jo of articles와 함께 제공된 절차에서 자세히 설명한 바이오매스 샘플에서 게놈 DNA의 분리 및 전단 이후에 시작됩니다.

다음 몇 단계는 SMID 벡터 PCC 1로의 결찰을 위해 SHE DNA를 준비합니다. 첫 번째 단계는 SHE DNA 조각과 인산화의 말단을 복구하는 것입니다. 5개의 주요한 끝은, 이 단계를 위해 필요한 모든 시약 진원지에서 PCC 하나 SMID 도서관 생산 장비에서 끝 수선 반응을 놓고, 얼음에 모든 시약을 해동하고, 그 후에 끝 수선 완충액 DNTP를 결합하고, 마이크로리터 효소 혼합물 및 물 당 0.5 마이크로그램에 그녀 삽입 DNA의 20 마이크로그램까지 TP를 섞습니다 80 마이크로리터에 도달하기 위하여 모든 액체를 얻기 위하여 관을 짧게 원심 분리하십시오 밑바닥.

말단 복구 반응을 실온에서 45분에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 가열하고 섭씨 70도에서 10분 동안 효소를 비활성화합니다. 말단 수리 배양 중에 다음 단계를 위해 겔을 준비할 수 있습니다.

펄스 필드 겔 전기영동 또는 PFGE의 목표는 30에서 60 범위의 DNA 분자를 분리하는 것입니다. Kilobases PFGE는 표준 전기영동 중에 함께 실행되는 이러한 큰 단편을 분해하기 위한 전기영동 방법입니다. 먼저 XTAE 러닝 버퍼 150ml에 저융점 aros를 사용하여 1% gel을 준비합니다.

80마이크로리터의 말단 복구 DNA 샘플 전체와 로딩 버퍼를 하나 또는 두 개의 웰에 로드할 수 있는 빗을 선택하십시오. 젤을 저융점 agros gel로 취급하는 데 특히 주의하십시오. 젤이 응고되는 동안 매우 쉽게 끊어집니다.

전기영동 챔버를 준비합니다. 2.2리터의 XTAE 1개를 챔버에 넣고 기계를 켜서 실행 중인 버퍼를 순환시킵니다. 냉각 장치를 섭씨 14도로 설정하고 펌프를 70RPM으로 설정합니다.

NEB의 미드레인지 1 PFG 마커도 포함합니다. 젤을 너무 높게 자르지 않으려면 젤 주사기에서 아로를 밀어내고 메스로 끝에서 작은 플러그를 자릅니다. 우물 전면에 플러그를 놓고 용융된 아로스로 밀봉합니다.

젤을 로드하기 전에 러닝 버퍼가 섭씨 14도로 냉각되었는지 확인하십시오. 첫 번째 우물에서 New England Biolabs Lambda Hindi 3 다이제스트 5 마이크로 리터를로드합니다. 두 번째 우물에서 10마이크로리터의 멸균수와 로딩 버퍼로 희석된 Smid 제어 크기 마커 1마이크로리터를 로드합니다.

그런 다음 끝부분을 수리하고 가열하지 않은 믹스와 로딩 버퍼를 로드하십시오. 뚜껑을 닫고 기계를 프로그래밍합니다. 젤은 하룻밤 또는 12시간 동안 작동합니다.

젤이 실행되면 사이버 골드 스테인을 사용하여 DNA가 사이버 골드를 희석하는 것을 시각화합니다. 1 XTAE의 250 밀리리터에 젤을 용액에 넣고 젤이 염색되는 동안 금은 빛에 민감합니다. 다음 젤 추출 단계를 위해 섭씨 70도에서 섭씨 1F 45도의 수조를 준비합니다.

다음 단계는 소비세와 젤화입니다. 30-60 kilobase의 원하는 크기 범위 내에서 DNA를 정제합니다. 염색된 젤을 비어 있고 찢어지고 라벨이 붙은 마이크로 속임수 튜브와 멸균 메스와 함께 블루라이트 트랜스루미네이터에 가져갑니다.

젤이 교차 오염되는 것을 방지하기 위해 트랜스루미네이터에 플라스틱 랩을 깔아줍니다. 새벽녘 view안경을 쓰고 푸른 빛을 켭니다. 이제 말단 복구된 게놈 DNA와 FO smid control 크기 마커를 볼 수 있습니다.메스를 사용하여 smid control size marker와 함께 약간 위로 이동한 5-7mm 너비의 젤 슬라이스를 절제합니다.

PFG 마커를 슬라이스의 상한으로 사용합니다. 슬라이스를 찢어진 튜브로 옮깁니다. 계속 진행하기 전에 최대 1년 동안 섭씨 영하 20도에서 슬라이스를 보관할 수 있습니다.

이제 젤을 사용할 시간입니다. 슬라이스에서 DNA를 정제하십시오. 젤 슬라이스가 들어있는 튜브의 무게를 측정하고 찢어짐 무게를 빼서 슬라이스의 무게를 계산합니다.

그런 다음 섭씨 70도의 수조에서 10-15분 동안 슬라이스를 녹입니다. 젤 슬라이스가 완전히 녹은 후 튜브를 섭씨 45도의 수조로 빠르게 옮깁니다. 1 밀리그램의 고체 젤은 녹은 후 1 마이크로 리터의 부피를 갖는다는 것을 명심하십시오.

용융된 아로스 100마이크로리터당 1단위 또는 1마이크로리터의 Jase 효소 제제를 첨가합니다. 섭씨 45도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 2-4 마이크로 리터를 더 넣고 섭씨 45도에서 1 시간 더 가열하여 배양합니다.

가열 후 10분 동안 섭씨 70도에서 젤을 비활성화합니다. 효소를 비활성화하고 최대 속도로 원심분리기보다 10분 동안 얼음 위에 튜브를 놓습니다. 13, 어떤 불용해성 입자든지 펠릿에 15 분 동안 000 회전수.

펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 정제된 DNA가 들어 있는 상부 상층액을 제거하고 15ml 매 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 3 밀리리터의 멸균 물로 DNA를 씻고 농축하십시오.

15 밀리리터 Falcon 튜브에서 울트라 셀 10 멤브레인이 있는 Ancon Ultra 4 원심 필터 장치로 용액을 옮깁니다. 50밀리리터 팔콘 튜브를 어댑터로 사용하여 필터 장치를 스윙 버킷 로터에 놓고 4, 000GS에서 6-8분 동안 회전합니다. 약 100-500 마이크로 리터의 용액이 될 때까지 원심 분리기.

필터에 남아 있고 흐름을 버리십시오. 그런 다음 빈 매 튜브에 멸균수 3ml를 더 추가합니다. 용액을 Amon 튜브로 옮기고 원심분리 단계를 반복합니다.

팔콘 튜브를 세 번 세척하고 필터에 수집된 최종 부피를 50-100마이크로리터로 줄입니다. 샘플 손실에 대해 걱정할 필요가 없습니다. 필터는 장시간 원심분리 후에도 50마이크로리터의 액체를 유지합니다.

AmCon 튜브의 남은 DNA 용액을 사전 세척된 MicroCon YM 50 원심 필터 장치로 옮기고 Amon 튜브를 추가로 50마이크로리터의 멸균수로 헹구어 모든 DNA 원심분리기를 회수합니다. 10, 여과기가 액체로 아직도 경미하게 덮을 때까지 10, 000 GS에 마이크로 분리기에 있는 MicroCon YM 50 원심 여과기 단위. 매 순간 확인하십시오.

필터에 소량의 액체만 남아 있는 경우. 필터를 거꾸로 뒤집고 새로운 마이크로 원심분리기 튜브에서 1000GS의 두 번째 원심분리 단계로 3분 동안 DNA 용액을 회수합니다. 결과 부피는 총 10-15 마이크로 리터를 초과해서는 안됩니다.

그렇지 않으면 DNA가 결찰에 비해 너무 희석될 수 있습니다. 생성된 DNA 용액의 농도를 NanoDrop 또는 Pico Green Assay로 확인합니다. 복구 및 수리되었습니다.

이제 DNA를 PCC one FO SMID 클로닝 벡터에 연결하여 얼음 위의 모든 시약을 결찰할 준비가 되었습니다. 그런 다음 여기에 나열된 순서대로 결합하고 추가할 때마다 혼합합니다. 먼저 멸균수를 추가하여 10마이크로리터의 반응 부피에 도달합니다.

그런 다음 10 x fast link ligation buffer, 10 millimolar A-T-P-P-C-C 하나의 SMID 벡터를 10:1 몰 비율로 삽입합니다. 그리고 마지막으로 빠른 연결 DNA 리가제. 튜브를 짧게 원심분리하여 모든 액체를 바닥으로 가져옵니다.

튜브를 탭하고 다시 돌립니다. 결찰반응을 실온에서 2시간 동안 배양하고 섭씨 70도에서 10분 동안 효소를 불활성화시킵니다. 이 시점에서 결찰 반응을 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 파지 패키징 단계로 진행할 수 있습니다.

다음 단계는 파지 패키징 단계를 수행하기 2-3일 전에 FO SMID 라이브러리를 대장균에 도입하는 기능을 하는 박테리아 파지를 생성하고, 제공된 EPI 300 T 1 저항성 도금 변형주를 일반 LB 플레이트에 줄무늬를 제거하고, 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하여 단일 콜로니를 얻는 것입니다. 이 플레이트를 밀봉하고 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 포장 반응 전날, 225RPM과 섭씨 37도의 쉐이크에서 Epi 300 플레이트 쉐이크의 단일 콜로니와 함께 Albee 육수 50ml와 황산 마그네슘 10ml를 접종합니다.

포장 반응 당일에는 신선한 50ml LB 육수와 10밀리몰의 황산 마그네슘에 5ml의 하룻밤 배양을 접종합니다. 배양, 섭씨 37도에서 박테리아를 0.8 내지 1.0의 OD 600으로 만듭니다. 600의 OD 1.0을 초과하지 마십시오.

정확한 결과를 얻을 수 있도록 분광 광도계에서 측정하기 전에 샘플을 희석하십시오. 얼음 위에 보관하거나 섭씨 4도에서 계속 진행할 준비가 될 때까지 또는 최대 72시간까지 보관합니다. 이제 박테리아가 감염될 준비가 되었으니 파지 해동을 준비할 차례입니다.

Lambda Packaging이 얼음 위에서 추출하는 최대 플라크. 결찰 반응당 하나의 튜브를 사용하여 해동에는 약 10-15분이 소요됩니다. 한편, 반응당 하나의 튜브를 사용하여 빈 1.5ml 튜브를 얼음에 다시 사전 냉각합니다.

Lambda 포장 추출물이 해동되면 즉시 각 포장 추출물을 25마이크로리터로 사전 냉각된 1.5ml 마이크로 퍼지 튜브에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 남은 포장 추출물을 섭씨 영하 80도로 되돌립니다. 해동된 포장 추출물을 얼음 위에 너무 오래 두면 감염 효율이 떨어집니다.

다음으로, 기포를 도입하지 않고 용액을 여러 번 피펫팅하여 혼합된 얼음 위에 해동된 추출물 25마이크로리터 각각에 10마이크로리터의 결찰 반응을 추가합니다. 튜브 바닥에 있는 모든 액체를 통합하기 위해 간단히 원심분리하고 섭씨 30도의 수조에서 90분 동안 포장 반응을 배양합니다. 80분 배양 후 남은 포장 추출물을 얼음에 담아 해동합니다.

90분 포장 반응이 완료된 후 나머지 25마이크로리터의 포장 추출물을 각 반응 튜브에 추가합니다. 섭씨 30도에서 추가로 90분 동안 반응을 배양합니다. 두 번째 배양 후 각 포장 튜브에 준비된 파지 희석 완충액 100마이크로리터를 추가하고 각 튜브에 5마이크로리터의 클로로포름을 부드럽게 혼합합니다.

이제 튜브에 총 부피가 165마이크로리터가 있어야 합니다. 점성 침전물은 클로로포름 에디션 후에 형성될 수 있습니다. 파지 입자를 피펫팅할 때 이러한 침전물과 유기 클로로포름 상을 피하십시오.

이 시점에서 필요한 경우 포장된 파지 입자를 4도에서 며칠 동안 보관할 수 있지만 최상의 결과를 얻으려면 새로 준비된 파지를 사용할 수 있습니다. 이제 패키징된 파지로 파지 패키징 단계 전반에 걸쳐 성장해 온 숙주 세포를 감염시킬 준비가 되었습니다. EPI 300 T one 내성 숙주 세포 OD 600.8 대 1.0에 패키징된 파지를 첨가하며, 이는 파지 입자 10마이크로리터당 epi 300 T one 내성 세포 400마이크로리터의 비율로 합니다.

포장된 파지 튜브 바닥에서 클로로포름이 피펫팅되는 것을 방지하기 위해 125마이크로리터의 포장된 파지 입자와 5밀리리터의 준비된 에피 300 T 1 내성 숙주 세포를 부드럽게 혼합한 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 다음 단계는 패키징된 파지의 역가를 측정하는 것입니다. 감염된 박테리아를 배지에 도금하여 감염된 세포를 선택함으로써 이를 수행합니다.

그런 다음 결과 군체를 세고 플레이팅한 박테리아에 추가된 파지의 양으로 나눕니다. C one SMID에는 클로람페니콜 내성 유전자가 포함되어 있습니다. 따라서 감염된 클론을 선택하려면 LB 플레이트가 포함된 클로람페니콜에 박테리아를 플레이트화합니다.

50 마이크로리터 2회, 10 마이크로리터 2회, EPI 300 T 1 내성 세포를 4개의 별도 플레이트에 퍼뜨리고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 16-24시간, 군집이 형성될 때까지 48시간 이내에 거꾸로 놓습니다. 그 사이에, 3, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 500 GS에 원심 분리에 의하여 5 밀리리터 감염에서 잔여 EPI 300 T 하나 저항하는 세포를 가을걷이하십시오. 상등액을 버리십시오.

튜브 resus에 20% 글리세롤이 함유된 LB 1ml를 추가합니다. 세포 펠릿과 쿼트를 2 밀리리터 극저온 바이알 튜브에 각각 100 마이크로 리터로 현탁시키고 즉시 동결하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 다음 날 콜로니 채취 단계에서 추가로 사용하려면 섭씨 37도의 인큐베이터에 있는 4개의 플레이트에 있는 클론 수를 세고 다음 단계에서 사용할 포장된 파지의 역가를 측정합니다.

냉동 EPI 300 T one 내성 글리세롤 스톡에는 라이브러리에 있는 다양한 플라스미드로 형질주입된 세포가 포함되어 있습니다. 다음으로, 각 smid의 바이러스 역가와 플레이트 크기에 따라 적절한 양을 펴 바릅니다. 2 45 x 2 45mm 정사각형에 복제합니다.

유리 구슬을 사용하여 클로람페니콜을 사용한 LB의 생물학적 분석 플레이트. 또한 접시에 소량의 LB 육수를 추가하여 세포가 고르게 펴 바릅니다. 글리세롤 스톡을 준비하면 세포가 추가로 약 5배 농축된다는 점을 명심하십시오.

콜로니 피킹 당일 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하고 LB 육수 웰당 200마이크로리터 또는 70마이크로리터로 채워진 96개 또는 3개의 84웰 플레이트를 준비합니다. 항생제 선택을 위해 육수 1ml당 12.5마이크로그램의 클로람페니콜을 보충하고 냉동을 위해 10%글리세롤을 보충합니다. 이 단계에서는 자동 qfi 3 플레이트 충전 시스템을 사용합니다.

다음 단계는 준비된 LB CHLORAMPHENICOL 플레이트에서 콜로니를 선택하여 동결을 위해 준비된 96 또는 3 84 웰 플레이트로 넣는 것입니다. 이 단계에서는 사용자 매뉴얼에 따라 클론 피킹 로봇 qix two를 사용하여 클론 피킹 영역 주변에 무균 환경을 조성합니다. UV 라이트가 켜져 있는 동안 30분 동안 UV 라이트를 켭니다.

500%표백제 1ml, 멸균 탈이온수 500ml, 80%에탄올 500ml를 준비합니다. 자외선이 꺼지면 라벨이 붙은 대로 트레이를 뒤에서 앞으로 채웁니다. 1%표백제를 채운 다음 전면 트레이에 탈이온수와 80%에탄올을 오토클레이브합니다.

충분한 세척액 없이는 따는 바늘을 제대로 씻을 수 없으므로 가득 찼는지 확인하십시오. 최적의 피킹을 위한 매개변수를 설정한 후 박테리아 플레이트와 LB로 채워진 96 또는 3개의 84 웰 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 Q 픽의 포스트 사이에 배치합니다. 작업 영역 플레이트는 피킹 중에 움직일 수 없도록 전면 오른쪽 모서리에 단단히 밀착되어야 합니다.

그런 다음 전면 패널을 닫습니다. 모든 매개변수가 설정되면 피킹 절차를 시작할 수 있습니다. 모든 피킹이 완료되면 브러시와 트레이를 탈이온수로 헹구고 벤치에 올려 말리십시오.

발생했을 수 있는 유출물을 청소하고 CICS의 내부를 80% 에탄올로 닦아냅니다. 모든 글리세롤 스톡 플레이트에 라벨이 부착되어 있는지 확인하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 24시간 동안 넣어 선택한 각 콜로니에서 배양액을 성장시킵니다. 인큐베이터에 인큐베이터에 인큐베이션된 플레이트의 날짜, 인큐베이션 시간, 제거 시간 및 이니셜이 포함된 메모를 남겨두십시오.

인큐베이션이 끝나면 라이브러리가 생깁니다. 각 웰에는 시작 샘플의 순전한 DNA 한 조각에 결찰된 PCC 1개 fo smid를 포함하는 하나의 박테리아 클론 배양액이 포함되어 있습니다. 장기 보관을 위해 접시를 섭씨 영하 80도에서 얼리고 잘한 일을

제시된 프로토콜은 주어진 서식지에서 미생물 군집의 유전적 내용을 포착하기 위해 환경 smid 라이브러리를 생성하는 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 샘플링된 환경의 유전적 함량을 대표하는 SMID 라이브러리를 생성해야 하며, 리더가 중요한 단계를 최적화할 수 있도록 해야 합니다. 전체 절차가 끝날 때 얻은 FO smid 클론의 양이 너무 적은 경우.

해수 샘플에서 파생된 게놈 DNA에서 FO SMID 라이브러리를 구성하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 고품질의 게놈 DNA부터 시작하는 것이 중요합니다. 시작하기 전에 모든 플레이트와 시약을 준비하고 이 다단계 프로세스를 위한 충분한 시간을 계획하십시오.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.