대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물학 및 면역학과의 Steven Helm 교수 연구실 소속 Marcus입니다. 오늘은 대형 삽입물 환경 라이브러리 구축 절차를 보여드리겠습니다. 오늘 실험에서는 San Lee 님이 파지 패키징과 라이브러리 숙주 e coli 감염을 담당하고, Elise Hawley 님과 Chin Yang 님이 콜로니 피킹을 도와주시겠습니다.

본 실험실에서는 해양 및 육상 환경의 미생물 군집 구조와 대사를 연구하기 위해 이 절차를 수행하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다. fosmid DNA 라이브러리 제작을 위한 이 프로토콜은 바이오매스 샘플로부터 게놈 DNA를 분리하고 셰어링(shearing)하는 과정 이후부터 시작되며, 해당 과정은 함께 제공되는 JoVE 논문에 상세히 기술되어 있습니다.

다음 몇 단계에서는 SHE DNA를 SMID 벡터 PCC one에 결찰하기 위한 준비 과정을 거칩니다. 첫 번째 단계는 SHE DNA 조각의 말단을 수선하고 인산화하는 것입니다. 5' 말단 수선에 필요한 모든 시약은 epicenter의 PCC one SMID 라이브러리 제작 키트에 포함되어 있습니다. 말단 수선 반응을 설정하려면 모든 시약을 얼음 위에서 해동한 다음, 말단 수선 버퍼, DNTP, 0.5 µg/µL 농도의 SHE 삽입 DNA를 최대 20 µg까지, 효소 혼합물 및 물을 추가하여 최종 부피가 80 µL가 되도록 혼합합니다. 튜브를 짧게 원심 분리하여 모든 액체가 바닥에 모이게 합니다.

말단 수복(end repair) 반응물을 상온에서 45분에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 70 °C에서 10분 동안 가열하여 효소를 불활성화합니다. 말단 수복 배양 과정 중에 다음 단계에 필요한 젤을 준비할 수 있습니다.

펄스장 젤 전기영동(Pulsed field gel electrophoresis) 또는 PFGE의 목적은 30에서 60 Kilobases 범위의 DNA 분자를 분리하는 것입니다. PFGE는 표준 전기영동 시 함께 이동하는 이러한 거대 단편들을 분해하기 위한 전기영동 방법입니다. 우선, 150 milliliters의 1X TAE running buffer에 low melting agarose를 사용하여 1% 젤을 준비하십시오.

80 µL의 end repair DNA 샘플과 로딩 버퍼 전체를 하나 또는 두 개의 웰에 넣을 수 있는 콤을 선택하십시오. 저융점 아가로스 겔은 겔이 응고되는 동안 매우 쉽게 깨질 수 있으므로 겔을 다룰 때 각별히 주의하십시오.

전기영동 챔버를 준비합니다. 챔버에 1X TAE 완충액 2.2 liters를 넣고 장치를 켜서 실행 완충액을 순환시킵니다. 냉각 장치를 14 °C로 설정하고 펌프를 70 RPM으로 설정합니다.

NEB에서 제공하는 중간 범위의 PFG 마커도 함께 포함하십시오. 겔을 너무 높게 자르는 것을 방지하려면, 겔 시린지에서 aros를 밀어내고 메스로 끝부분의 작은 플러그를 잘라냅니다. 이 플러그를 웰의 앞쪽에 배치하고 녹은 aros로 밀봉하십시오.

겔을 로딩하기 전, 러닝 버퍼가 14 °C로 식었는지 확인하십시오. 첫 번째 웰에 New England Biolabs Lambda Hindi 3 소화액 5 µL를 로딩합니다. 두 번째 웰에는 멸균수로 10 µL 희석한 Smid 컨트롤 크기 마커와 로딩 버퍼 혼합물 1 µL를 로딩합니다.

그다음 말단 수선 및 열 불활성화 처리된 혼합물과 로딩 버퍼를 로딩합니다. 덮개를 닫고 기기를 설정하십시오. 겔 전기영동은 밤새 또는 12시간 동안 진행됩니다.

겔 전기영동이 완료되면, Cyber Gold 염색액을 희석하여 DNA를 시각화합니다. 1X TAE 250 mL에 희석한 용액에 겔을 넣고, 빛에 민감한 Cyber Gold의 특성을 고려하여 암소에서 1시간 동안 염색합니다. 겔을 염색하는 동안, 이어지는 겔 추출 단계를 위해 70 °C와 45 °C의 항온 수조를 준비합니다.

다음 단계는 절단 및 겔 추출입니다. 30에서 60 kb 사이의 원하는 크기 범위 내에서 DNA를 정제하십시오. 염색된 겔과 함께, 라벨이 부착되고 열려 있는 마이크로 튜브와 멸균 메스를 청색광 투과조명기로 가져가십시오.

젤의 교차 오염을 방지하기 위해 트랜스루미네이터(transluminator) 위에 플라스틱 랩을 씌웁니다. 보호 안경을 착용하고 청색광을 켭니다. 이제 말단 복구된 게놈 DNA와 FO smid 대조군 크기 마커를 확인할 수 있습니다. 메스를 사용하여 smid 대조군 크기 마커와 그 약간 윗부분까지 이동한 5~7mm 너비의 젤 조각을 절제합니다.

PFG 마커를 슬라이스의 상한 경계로 사용하십시오. 슬라이스를 멸균 튜브로 옮깁니다. 다음 단계를 진행하기 전까지 슬라이스를 -20 °C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.

이제 겔 정제 단계입니다. 절단된 겔 조각에서 DNA를 정제하십시오. 겔 조각이 들어 있는 튜브의 무게를 측정하고, 여기에서 튜브 자체의 무게(tear weight)를 빼서 겔 조각의 무게를 계산하십시오.

다음으로, 70 °C 항온수조에서 10~15분 동안 슬라이스를 녹입니다. 겔 슬라이스가 완전히 녹으면 튜브를 신속하게 45 °C 항온수조로 옮깁니다. 고체 겔 1 mg의 부피가 녹은 후 1 µL가 된다는 점에 유의하십시오.

녹인 aros 100 µL당 Jase 효소 제제 1 unit 또는 1 µL를 첨가합니다. 45 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 les를 2~4 µL 더 첨가하고 45 °C에서 1시간 더 가열 배양합니다.

가열 후 70 °C에서 10분 동안 겔을 불활성화합니다. 효소를 불활성화한 후, 튜브를 얼음에 10분 동안 두고, 이후 최대 속도인 13,000 RPM에서 15분 동안 원심분리하여 불용성 입자를 펠렛화합니다.

펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 정제된 DNA가 포함된 상층액을 제거하여 15 mL 팔콘 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 DNA를 세척하고 농축하기 위해 3 mL의 멸균수로 희석합니다.

15 mL Falcon 튜브에 담긴 용액을 ultra cell 10 막이 장착된 Ancon Ultra four 원심 분리 필터 유닛으로 옮깁니다. 50 mL Falcon 튜브를 어댑터로 사용하여 스윙 버킷 로터에 필터 유닛을 배치하고 4,000 xg에서 6~8분 동안 원심 분리합니다. 용액이 약 100~500 µL가 남을 때까지 원심 분리하십시오.

필터에 남겨두고 통과액은 버립니다. 그런 다음 빈 팰콘 튜브에 멸균수 3 mL를 추가로 넣습니다. 용액을 Amon 튜브로 옮기고 원심분리 단계를 반복합니다.

팔콘 튜브를 세 번째로 세척하고 필터에 수집된 최종 부피를 50~100 µL로 줄입니다. 샘플 손실에 대해 걱정할 필요는 없습니다. 필터는 장시간 원심분리 후에도 50 µL의 액체를 보유합니다.

AmCon 튜브에 남아 있는 DNA 용액을 미리 세척한 MicroCon YM 50 원심 여과 장치로 옮기고, AmCon 튜브를 50 µL의 멸균수로 추가 헹궈 모든 DNA를 회수합니다. MicroCon YM 50 원심 여과 장치를 마이크로 원심분리기에 넣고 여과지가 액체로 약간 덮여 있을 때까지 10,000 ×g에서 원심분리합니다. 매분마다 상태를 확인하십시오.

필터에 소량의 액체만 남아 있는 경우, 필터를 뒤집어 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 1000 g에서 3분 동안 2차 원심분리를 하여 DNA 용액을 회수하십시오. 결과적으로 얻어지는 총 부피는 10 내지 15 µL를 초과하지 않아야 합니다.

그렇지 않으면 DNA가 너무 희석되어 라이게이션(ligation)이 어려울 수 있습니다. NanoDrop 또는 Pico Green Assay를 통해 얻어진 DNA 용액의 농도를 확인하십시오. 회수 및 수선되었습니다.

이제 DNA를 PCC one FO SMID 클로닝 벡터에 라이게이션할 준비가 되었습니다. 라이게이션을 위해 모든 시약을 얼음 위에서 해동하십시오. 그런 다음 여기에 나열된 순서대로 혼합하며, 각 성분을 추가할 때마다 섞어줍니다. 먼저, 멸균수를 추가하여 반응 부피를 10 µL로 맞춥니다.

그런 다음 10x fast link ligation buffer, 10 millimolar A-T-P-P-C-C, 1 SMID vector 및 insert를 10:1 몰 비로 첨가합니다. 마지막으로 fast link DNA Ligase를 넣습니다. 튜브를 짧게 원심분리하여 모든 액체가 바닥에 모이도록 합니다.

튜브를 탭하고 다시 원심분리합니다. 연결 반응을 상온에서 2시간 동안 배양하고, 70 °C에서 10분 동안 가열하여 효소를 불활성화합니다. 이 단계에서 연결 반응물을 -20 °C에 보관하거나 바로 파지 패키징 단계로 진행할 수 있습니다.

다음 단계는 FO SMID 라이브러리를 E. coli에 도입하는 역할을 할 박테리오파지를 생성하는 것입니다. 파지 패키징 단계를 수행하기 2~3일 전에, 제공된 EPI 300 T1 내성 도말 균주를 일반 LB 플레이트에 스트리킹하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 단일 콜로니를 얻습니다. 이 플레이트를 밀봉하여 4°C에서 보관하며 추후에 사용할 수 있습니다. 패키징 반응 전날, Epi 300 플레이트의 단일 콜로니를 10 mM 황산마그네슘이 첨가된 50 mL LB 배지에 접종합니다. 225 RPM, 37°C에서 하룻밤 동안 진탕 배양합니다.

포장 반응 당일에 10 millimolar 황산마그네슘이 첨가된 신선한 50 milliliter LB 배지에 하룻밤 동안 배양한 배양액 5 milliliter를 접종합니다. 박테리아를 37 degrees Celsius에서 OD 600이 0.8에서 1.0이 될 때까지 배양합니다. OD 600이 1.0을 초과하지 않도록 주의하십시오.

분광광도계로 측정하기 전에 정확한 결과를 얻을 수 있도록 샘플을 희석하십시오. 준비가 될 때까지 또는 최대 72시간 동안 얼음 위나 4°C에서 보관하십시오. 이제 박테리아가 감염 준비가 되었으므로, 파지를 해동할 차례입니다.

max plaques Lambda Packaging extract를 얼음 위에서 해동합니다. 결찰 반응당 튜브 하나를 사용하여, 해동에는 약 10~15분이 소요됩니다. 그동안 반응당 튜브 하나를 사용하여 빈 1.5 milliliter 튜브를 얼음 위에서 다시 예냉합니다.

Lambda 패키징 추출물이 해동되면, 즉시 각 패키징 추출물 25 µL를 미리 냉각시킨 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 얼음 위에 둡니다. 남은 패키징 추출물은 -80 °C로 다시 옮깁니다. 해동된 패키징 추출물을 얼음 위에 너무 오래 두면 감염 효율이 떨어집니다.

다음으로, 공기 방울이 유입되지 않도록 용액을 여러 번 피펫팅하여 혼합하면서, 해동된 25 µL의 추출물 각각에 10 µL의 연결 반응액을 얼음 위에서 첨가합니다. 짧게 원심 분리하여 모든 액체를 튜브 바닥으로 모은 후, 패키징 반응액을 30 °C 항온수조에서 90분 동안 배양합니다. 배양 80분이 경과한 후, 남은 패키징 추출물을 얼음 위에서 해동합니다.

90분간의 패키징 반응이 완료되면, 남은 25 µL의 패키징 추출물을 각 반응 튜브에 첨가합니다. 반응물을 30 °C에서 90분 동안 추가로 배양합니다. 2차 배양 후, 각 패키징 튜브에 준비된 파지 희석 버퍼 100 µL를 넣고 가볍게 섞은 다음, 각 튜브에 클로로포름 5 µL를 첨가합니다.

이제 튜브의 총 부피는 165 µL가 되어야 합니다. 클로로포름 첨가 후 점성 침전물이 형성될 수 있습니다. 파지 입자를 피펫팅할 때 이 침전물과 유기 클로로포름 층이 섞이지 않도록 주의하십시오.

이 시점에서 필요한 경우 패키징된 파지 입자를 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있으나, 최적의 결과를 위해 갓 준비한 파지를 사용하십시오. 이제 파지 패키징 단계 동안 배양해 온 숙주 세포에 패키징된 파지를 감염시킬 준비가 되었습니다. OD 600 0.8에서 1.0인 EPI 300 T one 내성 숙주 세포에 패키징된 파지를 첨가합니다. 이때 파지 입자 10 µL당 EPI 300 T one 내성 세포 400 µL의 비율로 첨가하십시오.

패키징된 파지 튜브 바닥의 클로로포름이 피펫팅되는 것을 방지하기 위해, 패키징된 파지 입자 125 µL와 준비된 epi 300 T one 내성 숙주 세포 5 mL를 사용해 부드럽게 혼합한 후 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 다음 단계는 패키징된 파지의 타이터를 측정하는 것입니다. 이는 감염된 박테리아를 배지에 도말하여 감염된 세포를 선택함으로써 수행합니다.

그 후 생성된 콜로니 수를 세고, 이를 도말한 박테리아에 첨가한 파지의 부피로 나눕니다. C one SMID는 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하고 있습니다. 따라서 감염된 클론을 선별하기 위해 박테리아를 클로람페니콜이 포함된 LB 플레이트에 도말하십시오.

파지에 감염된 EPI 300 T one 내성 세포 50 µL 두 개와 10 µL 두 개를 각각 4개의 서로 다른 플레이트에 도말하고, 콜로니가 형성될 때까지 37 °C 인큐베이터에 뒤집어 16~24시간(최대 48시간 이내) 동안 배양합니다. 그동안, 5 mL 감염액에서 4 °C, 3,500 ×g로 10분간 원심분리하여 잔류 EPI 300 T one 내성 세포를 회수합니다. 상층액은 제거합니다.

튜브의 resus에 20% glycerol이 포함된 LB 1 mL를 추가하십시오. 세포 펠렛을 현탁하고 2 mL 크라이오 바이알 튜브 두 개에 각각 100 µL씩 분주한 뒤 즉시 냉동하여 -80 °C에서 보관하십시오. 다음 날 콜로니 피킹 단계에서 사용하기 위해, 37 °C 인큐베이터 내의 플레이트 4개에서 클론 수를 측정하여 다음 단계에서 사용할 패키징된 파지의 타이터(titer)를 결정하십시오.

냉동된 EPI 300 T one 내성 글리세롤 스톡은 라이브러리에 포함된 모든 서로 다른 플라스미드가 형질도입된 세포를 포함하고 있습니다. 다음으로, 각 smid의 바이러스 역가와 플레이트 크기에 따라 적절한 양을 도말하십시오. 2 45 by 2 45 밀리미터 정사각형 플레이트에 클로닝하십시오.

유리 구슬을 이용한 chloramphenicol 함유 LB 바이오어세이 플레이트입니다. 또한, 세포를 고르게 도포하기 위해 플레이트에 소량의 LB 배지를 추가하십시오. 글리세롤 스톡을 준비하는 과정에서 세포가 약 5배 더 농축된다는 점에 유의하십시오.

콜로니 피킹 당일에 37 °C에서 24시간 동안 배양하고, 웰당 200 µL 또는 70 µL의 LB broth를 채운 96웰 또는 384웰 플레이트를 준비합니다. 항생제 선택을 위해 mL당 12.5 µg의 chloramphenicol을 첨가하고, 냉동 보관을 위해 10% glycerol을 첨가합니다. 이 단계에서는 자동화된 qfi three 플레이트 충전 시스템을 사용합니다.

다음 단계는 준비된 LB CHLORAMPHENICOL 플레이트에서 콜로니를 선택하여 냉동 보관용으로 준비된 96 또는 384 웰 플레이트에 옮기는 것입니다. 이 단계에서는 사용자 매뉴얼에 따라 클론 피킹 로봇 qix two를 사용하여 클론 피킹 구역 주변에 멸균 환경을 조성합니다. UV 램프를 켜고 30분 동안 유지하십시오.

1% 표백제 500 milliliters, 멸균 탈이온수 500 milliliters 및 80% 에탄올 500 milliliters를 준비합니다. UV 램프가 꺼지면, 표시된 대로 트레이를 뒤에서부터 앞으로 채웁니다. 1% 표백제를 채우고, 그다음 오토클레이브 멸균 탈이온수를 채우며, 가장 앞쪽 트레이에 80% 에탄올을 채웁니다.

충분한 세척액이 없으면 피킹 니들을 제대로 세척할 수 없으므로, 세척액이 가득 찼는지 확인하십시오. 최적의 피킹을 위한 파라미터 설정을 마친 후, 박테리아 플레이트와 LB가 채워진 96-well 또는 384-well 플레이트의 덮개를 열고 Q picks의 포스트 사이에 배치하십시오. 작업 영역의 플레이트는 피킹 중에 움직이지 않도록 오른쪽 앞 구석에 밀착시켜야 합니다.

그 다음 전면 패널을 닫습니다. 모든 파라미터 설정이 완료되면 피킹 절차를 시작할 수 있습니다. 모든 피킹이 완료되면 브러시와 트레이를 탈이온수로 헹구고 벤치 위에 올려 건조시킵니다.

발생했을 수 있는 모든 유출물을 닦아내고 CICS 내부를 80% ethanol로 닦으십시오. 모든 glycerol stock 플레이트에 라벨이 부착되었는지 확인하고, 선택된 각 콜로니로부터 배양물을 성장시키기 위해 37 degrees Celsius 인큐베이터에 24시간 동안 보관하십시오. 인큐베이터에 날짜, 배양된 플레이트 수, 배양 시간, 꺼내는 시간 및 본인의 이니셜이 포함된 메모를 남기십시오.

배양 후, 라이브러리가 완성됩니다. 각 웰에는 시작 시료에서 얻은 전단 DNA 조각 하나와 PCC one fo smid가 연결된 하나의 박테리아 클론 배양액이 들어 있습니다. 장기 보관을 위해 플레이트를 -80 °C에서 냉동하고, 성공적으로 작업을 마친 것을 축하하시기 바랍니다.

본 프로토콜은 주어진 서식지 내 미생물 군집의 유전적 내용을 포착하기 위한 환경 smid 라이브러리 구축 절차를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 샘플링된 환경의 유전적 내용을 대표하는 SMID 라이브러리를 생성할 수 있으며, 독자가 중요 단계를 최적화할 수 있도록 지원합니다. 전체 과정 끝에 얻어진 FO smid 클론의 양이 너무 적은 경우에 대비하여 설명합니다.

해양수 샘플에서 유래한 genomic DNA로부터 FO SMID 라이브러리를 구축하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 고품질의 genomic DNA로 시작하는 것이 중요합니다. 시작 전 모든 플레이트와 시약을 준비하고, 이 다단계 공정에 충분한 시간을 계획하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.