이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

안녕하세요, Cecilia Owens 연구실의 Hillary Kemp입니다. 그리고 저는 Cecilia Owens입니다. Hillary와 저는 시애틀에 위치한 Fred Hutchinson Cancer Research Center의 기초과학 부문에 소속되어 있습니다.

오늘은 유전적 모자이크라고도 알려진 키메라 제브라피쉬 배아를 만드는 기술을 보여드리겠습니다. 이 절차를 통해 우리는 발달 과정 중 유전자 기능의 세포적 기초를 평가할 수 있습니다. 특정 유전자가 돌연변이 표현형을 나타내는 세포 내에서 기능하는지(세포 자율적 기능), 아니면 해당 세포의 주변 환경 내에서 기능하는지(세포 비자율적 기능)를 확인할 수 있습니다.

우리는 blastula 단계 또는 초기 gastro 단계의 야생형 배아와 돌연변이 배아 사이에 세포를 이식하여 이러한 모자이크를 제작합니다. 이후 숙주 환경 내에서 공여체 유래 세포의 표현형과 유전형을 관찰함으로써 유전자 기능을 평가합니다. 그럼 시작하겠습니다.

프로토콜의 이 단계에서는 이식 후 공여자 유래 세포의 운명을 추적할 수 있도록 공여자 배아에 계보 염료(lineage dye)를 주입합니다. 이 기술을 사용하여 다양한 핵산을 주입할 수도 있으나, 배아 작업 전 DNA를 주입할 때는 표지(decoration) 단계를 생략하십시오. 페트리 접시의 가장 넓은 부분에 유리 슬라이드를 45도 각도로 삽입하여 주입용 접시를 준비합니다. 1.2% aros 및 pen strep이 포함된 배아 배지를 접시의 4분의 3 정도까지 채웁니다.

아가로스가 굳은 후 슬라이드를 제거하여 경사 진 홈을 만듭니다. 홈을 pen strep 배아 배지로 채웁니다. 이제 단일 세포 단계 배아의 효소 장식 과정을 진행하십시오.

1세포기 배아를 0.5 mg/mL Pronase 용액에서 1~5분 동안 배양하십시오. 탈피 과정을 면밀히 관찰하십시오.

난막이 눈에 띄게 수축하기 시작하자마자 배아를 시스템 워터에 담급니다. 이렇게 하여 모든 난막을 따라 흘려보내면, 배아들은 비커 곡선 바닥 부분에 그대로 남게 됩니다. 배아가 다시 한번 수면에 닿지 않게 하는 것이 매우 중요하며, 대부분의 배아는 난막이 제거된 상태입니다. 외곽에 일부 제거되지 않은 난막들이 소용돌이치며 떠다니고 있습니다.

만약 배아가 여전히 난막(corion)에 둘러싸여 있다면, 이와 같이 피펫팅하는 동작을 통해 배아를 밖으로 꺼내어 배아가 수면 표면에 닿지 않도록 방출할 수 있습니다. 코팅된 배아를 다룰 때는 가장자리를 매끄럽게 만들기 위해 화염 연마(fire polished) 처리를 한 피펫을 사용하는 것이 중요합니다. 넓은 구경의 화염 연마 유리 피펫을 사용하여 취약한 DEC 코팅 배아를 주입 접시의 홈으로 조심스럽게 옮기십시오.

그 다음, 단일 파일로 배아들을 트로프에 올립니다. 이제 정밀하게 보정된 화염 연마 유리 주입 피펫과 압력 주입 장치를 사용하여 배아에 계통 마커를 주입할 준비가 되었습니다. 바늘 끝을 자르는 데는 배아 배지가 가득 담긴 디쉬를 사용하고, 바늘을 보정하는 데는 오일이 가득 담긴 디쉬를 사용할 것입니다.

이것은 일반적인 표준 실험실 등급의 미네랄 오일입니다. 끝을 날카롭게 다듬은 시계 제작용 핀셋을 준비하고, 접안렌즈를 통해 적절한 크기를 확인하면서 핀셋을 니들의 양측에 배치한 다음, 칩을 조심스럽게 떼어냅니다. 이는 직접 보지 않고는 수행할 수 없는 작업입니다. 시작하기 전에 전달될 염료 또는 리보뉴클레오티드의 부피를 결정해야 합니다.

미네랄 오일이 담긴 디쉬에서 볼루스 크기를 측정합니다. 마이크로 인젝터의 1~2회 펄스로 1 nanoliter의 볼루스가 주입될 수 있도록 바늘 끝을 잘라내어야 합니다. 볼루스의 부피는 접안 마이크로미터로 측정한 직경을 통해 계산할 수 있습니다.

1~3% 농도의 형광 덱스트란 용액 1 nanoliter를 1~4세포기 사이의 코팅된 배아 난황에 직접 주입합니다. 배아를 바늘 바로 아래에 위치시킨 후, 바늘을 난황 중심부로 조심스럽게 찔러 넣고 풋 페달을 밟습니다.

주입 시, 염료가 세포 내로 운송될 수 있도록 난황 흐름(yolk streams)에 주입하는 것이 중요합니다. 이 정도의 주입량으로도 수일간의 발달 과정 동안 키메라 배아 내의 세포를 추적하기에 충분합니다. 이상적으로는 세포가 4세포기에 도달하기 전에 이 과정을 수행합니다. 주입된 배아는 신선한 pen strep 배아가 채워진 코팅된 페트리 접시에서 낮은 밀도로 배양하십시오.

주입된 배아는 발달 속도가 약간 느려지는 경향이 있으므로, 배아를 25, 28, 31°C의 서로 다른 온도에서 배양하여 발달 시기를 분산시키고 이식 수행 가능 시간대를 최대화하십시오. 제브라피쉬 포배기 세포 이식에 사용되는 장치는 드라이브 제어식 Hamilton 시린지로 구성되며, 이는 3방향 스톱콕을 통해 미네랄 오일 저장조 및 유연한 튜브로 연결된 마이크로 피펫 홀더와 결합되어 있습니다. 공기 방울은 흡입 및 압력 제어 능력을 저하시키므로 시스템 내의 모든 공기 방울을 제거하십시오.

최소 DX 배율 이상의 고품질 광학 렌즈가 장착된 실체 현미경을 사용하십시오. 마이크로 피펫 홀더와 바늘의 위치를 제어하기 위해 NARA shige 수동 마이크로 조작기 사용을 권장합니다. 진동이 이식물로 전달되는 것을 방지하기 위해 마그네틱 베이스를 사용하여 벤치에 단단히 고정하십시오.

이식용 바늘은 전극 폴러(electrode polar)에서 완만한 테이퍼 형태로 뽑아낸 유리 모세관 피펫으로 제작합니다. 해부 현미경 하에서 피펫을 뽑는 상세 방법은 Miriam Goodman 연구실의 JoVE 프로토콜을 참조하고, 뽑아낸 바늘의 끝부분을 제거하십시오. 포배기(blastula stage) 이식의 경우 바늘의 외경은 약 50~60 µm여야 하며, 낭배기(gastro stage) 이식의 경우 30~40 µm여야 합니다.

침투력을 높이기 위한 위 단계 전이(gastro stage transfer)를 위해, 먼저 마이크로 포지(micro forge)를 사용하여 바늘 끝에 날카로운 가시(barb)를 만들어야 합니다. 바늘 끝을 마이크로 포지의 필라멘트에 가까이 가져가 끝부분을 매끄럽게 다듬으십시오. 그 다음, 바늘의 베벨(bevel) 선단부가 필라멘트에 닿을 수 있도록 바늘을 돌리십시오. 바늘의 선단부가 필라멘트에 닿는 즉시, 빠르게 당겨서 가시를 형성합니다.

세포 손상을 방지하려면 바브(barb)가 직선이어야 하며 바늘 끝이 휘어져서는 안 됩니다. 장치와 이식용 바늘이 준비되면 키메라 배아를 제작할 수 있습니다. 포배기 이식은 정밀한 운명 지도 정보가 필요하지 않을 때 배아 간에 세포를 이식하는 데 사용됩니다. 원시 생식 세포를 제외한 대부분의 세포는 일반적으로 이 단계에서 운명이 결정되지 않은 상태입니다.

포배의 운명 지도(fate map)를 통해 외배엽으로 발달할 세포와 중배엽으로 발달할 세포를 구분할 수 있습니다. 중배엽 및 내배엽 세포는 포배 단계 배아의 가장자리 근처에 위치하는 반면, 신경계와 표피로 발달할 외배엽 전구세포들은 배아의 가장자리에서 더 멀리 떨어져 위치합니다. 따라서 포배 단계의 배아에 세포를 이식할 때, 해당 세포들을 presumptive mesoderm(추정 중배엽) 또는 presumptive ectoderm(추정 외배엽) 부위로 표적화하여 이식할 수 있습니다.

하지만 우리는 어느 부위가 배아의 배측인지 알지 못하므로, 세포를 외배엽이나 중배엽의 특정 영역으로 표적화할 수 없습니다. 포배기 단계에서 배아의 배측 위치를 확인하십시오. 배아 배양액이 절반 정도 채워진 페트리 접시에 쐐기 모양의 돌출부가 쌍으로 배열된 플라스틱 몰드를 띄워 주입용 접시를 미리 준비합니다. 1.2% agarose가 응고되면 템플릿을 제거하여, 배아 하나가 겨우 들어갈 정도의 크기를 가진 삼각형 모양의 웰들이 열을 이루도록 합니다.

이식 몰드를 pen strep 배아 배지로 채우고, 화염 연마된 유리 피펫을 사용하여 포배기 배아를 각 웰에 개별적으로 넣습니다. 이제 배아를 이식 웰로 옮기고 처음에는 배아가 옆으로 눕게 둡니다. 공여 배아는 한 열에, 수용 배아는 인접한 열에 배치하여 정렬합니다.

이식 바늘이 배아에 진입할 때 바늘이 배아를 웰의 뒷벽 쪽으로 밀어내도록 스테이지 위에 디쉬를 배치하십시오. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 이식 바늘을 상당히 가파른 각도로 디쉬 안으로 내립니다. 이상적으로는 이식 바늘이 약 45도 각도로 배아에 진입해야 합니다.

바늘 끝이 배아 배지의 표면 아래로 들어가면, Hamilton 시린지를 제어하는 마이크로미터 드라이브를 돌려 소량의 배아 배지를 바늘 안으로 흡입합니다. 가장 정밀하게 제어하려면 미네랄 오일과 배아 배지의 계면이 바늘 끝에 너무 가깝지 않게, 바늘의 얇고 테이퍼진 부분에 유지되어야 합니다. 바늘을 이용해 공여 배아의 위치를 조심스럽게 잡은 다음, 바늘을 뒤로 뺐다가 원하는 위치의 배아 포배모(blastula cap)로 진입시킵니다.

빠르고 강하게 찌르면 배아가 굴러가지 않고 관통됩니다. 세포의 전단 응력을 방지하기 위해 공여 세포를 바늘 안으로 천천히 조심스럽게 흡입하십시오. 원하는 수의 세포를 채취한 후에는 난황이 바늘 안으로 들어가지 않도록 주의하십시오.

압력을 약간 반대로 조절하여 흡입을 멈추고 바늘을 제거하여 호스트 배아를 적절한 위치로 가져옵니다. 이식 접시를 이동시키면, 난황을 건드리지 않도록 주의하면서 이식 바늘을 이용해 살살 돌림으로써 호스트 배아의 위치를 미세하게 조정할 수 있습니다. 공여 세포를 호스트 배아 내부로 배출할 때 난황이 함께 빨려 들어가지 않도록 주의하십시오. 이는 공여 세포를 손상시키고 사멸시킬 수 있기 때문입니다. 세포 전이가 완료된 후에는 단일 공여 배아로부터 얻은 세포를 여러 호스트에 이식할 수 있습니다.

공여자와 수용자 쌍을 코팅된 24웰 플레이트의 웰로 옮겨 배양을 계속합니다. 포배기 단계에서 세포들이 특정 운명으로 결정되지 않는다는 규칙의 유일한 예외는 원시 생식 세포입니다. 원시 생식 세포는 발생 초기 단계에 매우 빠르게 지정되며, 원시 생식 세포 상태의 운명으로 결정됩니다.

매우 초기 단계부터 원시 생식 세포는 포배와 낭배 단계 배아의 가장자리 근처에 위치합니다. 따라서 이식 실험의 목적이 원시 생식 세포를 이식하는 것이라면, 공여 배아의 어느 부위에서 세포를 가져오는지가 매우 중요하며, 숙주 배아의 어느 부위로 세포가 들어가는지는 중요하지 않습니다. 반면 체세포의 경우, 숙주 배아의 어느 부위로 이동하는지가 그 세포의 운명을 결정하므로 이동 위치가 중요하다는 규칙이 적용됩니다.

원시 생식세포의 경우, 이들의 운명이 이미 결정되어 있기 때문에 공여자 배아의 어느 부위에서 유래했는지가 중요합니다. 원시 생식세포를 이식하는 것이 목적이라면, 공여자 배아의 가장자리 부분에서 세포를 채취해야 합니다. 이 세포들은 배아의 이 단계, 즉 구형기(sphere stage) 또는 초기 발달 단계에서 배아 가장자리 근처에 각각 3~4개의 세포로 구성된 4개의 작은 군집 형태로 위치합니다. 이때 난황을 실수로 함께 흡입하지 않도록 매우 조심스럽게 채취해야 합니다.

좋습니다. 지금까지 진행한 과정은 여기까지이며, 이제 숙주 배아로 옮기겠습니다. 원시 생식 세포는 어떤 배아에 있든 생식 능선 영역으로 스스로 이동합니다. 따라서 이 원시 생식 세포들을 가장자리에 이식할 필요 없이, 세포들이 스스로 그곳까지 이동하게 됩니다.

따라서 저는 단순히 배아 후기 단계의 적당한 위치에 세포들을 다시 이식하고 있습니다. 다른 모든 종류의 이식과는 완전히 대조적으로, 생식 세포 이식의 핵심은 공여 세포가 어디에서 유래했는지가 중요하다는 점입니다. 낭배기 단계의 호스트에 세포를 이식하면, 배아 쉴드(embryonic shield)가 나타날 때 형성되는 제브라피시 운명 지도(fate map)를 실험자가 활용할 수 있게 됩니다.

서로 다른 조직 유형뿐만 아니라 추정 중추신경계 내의 도메인을 구분하는 것이 가능해집니다. 낭배기 단계의 배아 간에 세포를 이식할 때 프로토콜에 약간의 차이가 있을 수 있으나, 일반적인 절차는 포배를 고정하여 낭배를 다루는 과정과 유사합니다. 먼저 유리 오목 슬라이드의 오목한 부분에 메틸셀룰로오스를 수직 줄무늬 형태로 펴 바른 다음, 화염 연마된 피펫 전송기를 사용하여 충분한 양의 pen strep 배아 배지를 채웁니다.

공여체 하나와 차폐기 단계(shield stage)의 수혜체 셋을 함몰 슬라이드로 옮깁니다. 수혜체보다 약간 어린 공여체 배아를 선택하십시오. 가스트로스 글루(gastros glue)를 조작하기 위해 새로운 도구가 필요한데, 짧은 길이의 2파운드 테스트 낚시줄 끝을 모세관 튜브 끝에 넣어서 만듭니다.

이렇게 하여 작은 루프를 만듭니다. 루프를 사용하여 공여체 배아와 수용체 배아를 Methylcellulose 스트립 상단으로 부드럽게 굴려 올린 다음, 고정될 때까지 Methylcellulose 안으로 밀어 넣습니다. 표적 영역이 가장 위로 오도록 배아들을 굴려 위치시킵니다.

이식 과정에서 바늘이 난황(ylk)을 손상시키지 않고 공여 세포를 전달하기 위해 배아에 접선 방향으로 진입하게 됩니다. 위장(Gastro) 단계의 이식은 고정 단계의 복합 현미경에서 수행하는 것이 가장 좋습니다. 마이크로 매니퓰레이터의 컨트롤러를 사용하여 이식 바늘의 끝을 초점에 맞추십시오.

마이크로 파이펫 홀더와 바늘을 상당히 낮은 각도로 배치하여, 슬라이드의 오목한 가장자리가 허용하는 범위 내에서 바늘이 최대한 수평에 가깝게 위치하도록 합니다. 그다음 공여 배아를 찌릅니다. 배아가 적절하게 고정되었다면, 배아가 너무 오래되어 바늘이 쉽게 침투하지 못하는 경우가 아닌 한, 이식 바늘이 들어갈 때 배아가 굴러가지 않을 것입니다.

난황을 찌르는 것을 방지하기 위해, 바늘은 EDL보다 약간 더 깊은 초점 평면에서 배아로 진입해야 합니다. 일단 천자되면, 공여체로부터 다량의 세포를 추출하여 최대 3회의 수용체 세포 주입에 사용할 수 있습니다. 세포를 흡입할 때, 필요에 따라 바늘을 움직여 가며 난황이 함께 흡입되지 않도록 주의하십시오.

세포를 숙주에 주입하기 전, 동일한 바늘을 사용하여 더 많은 세포를 얻기 위해 추가 배아를 채취할 수 있습니다. 숙주 배아로 세포를 주입할 때는 세포를 한 곳에 뭉쳐서 배치하는 대신, 바늘을 목표 영역으로 끌어당기면서 세포를 배출하십시오. 이렇게 하면 공여 세포가 원하는 조직에 기여할 가능성이 높아집니다. 세포 이식이 완료되면 슬라이드 전체를 페트리 접시에 넣고 pen strep embryo Medium으로 조심스럽게 채우십시오.

다음 몇 시간 동안 메틸셀룰로오스가 용해되면서 배아가 방출됩니다. 이식되는 세포 수는 실험의 구체적인 목적에 따라 달라집니다. 단일 공여자의 세포는 이식 다음 날 아침에 3~4마리의 수용체에 이식될 수 있습니다.

공여 세포 타겟팅이 성공적이었는지 확인하기 위해 호스트를 검사할 수 있습니다. 포배기 단계의 원시 생식세포가 성공적으로 이식되면, 형광 표지된 세포들이 ylk와 ylk extension 사이의 접합부 근처 배측에 위치하게 됩니다. 지금까지 낭배기 및 포배기 단계의 이식 방법을 살펴보았습니다.

이 기술을 수행할 때는 세포로 표적화하고자 하는 대상 조직에 적합한 이식 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 따라서 blastula 단계의 이식은 세포가 중배엽으로 가는지 아니면 외배엽으로 가는지 결정하는 데 충분합니다. 또한, 이 기술을 사용하여 원시 생식 세포를 표적화할 수도 있습니다.

더욱 정밀한 매핑을 원하신다면, 이미 등쪽(dorsal side)이 결정된 gastros 연령의 이식편을 사용하는 것이 좋습니다. 이 기술을 통해 신경계의 다양한 부위, 특히 전뇌, 중뇌, 후뇌 및 척수의 세포들을 표적화할 수 있습니다. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 모든 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.