Name: 높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 학습하세요 제브라피시 정자 고속 동결보존 및 체외수정 기법을. 100마리 수컷의 정자를 2시간 내에 처리하고 7년 이상 25% 평균 수정률을 유지하는 효율적인 방법입니다.

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이 작품은 NIH R01 HG002995 지원했다 &quot;Zebrafish 게놈 틸링 : 역방향 유전학 어프로치&quot;CBM으로합니다.

부품 A : 정자의 냉동 솔루션 1. 진스 버그 생선 링거스 (매 3 일마다 새로 만들어, 긴스버그, 1963) 참고 : 추가할 주문 석출을 방지하는 것이 중요합니다 450 년 ML 살균 ddH2O는 디졸브 : <ul><li> NaCl 3.25 g </li><li> KCl 0.125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0.175 g 다음 추가 : </li><li> NaHCO3 0.10 g </li></ul> 4 무균 ddH2O하고 저장 ° C. 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가지고 2. 냉동 매체 (신선한 매일 확인) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> 메탄올없이 <ul><li> 긴스버그 피시는 10 ML 링거스 (온도는 실온). </li><li> 가루 우유 밀크 1.5 GM </li></ul></li><li> 메탄올과 함께 참고 : 추가할 주문 석출을 방지하는 것이 중요합니다 <ul><li> 긴스버그 피시 9 ML (온도는 실온). 링거스 </li><li> 메탄올 1 ML </li><li> 가루 우유 밀크 1.5 g </li></ul> 동결 미디어를 조립 후, 20 분 잘 섞는다. 궤도 흔드는 또는 로커에서. 사용하기 전에, 1 ML eppendorf 튜브로 나누어지는, 표면 거품을 피하고. </li></ol> 파트 B : 정자 동결에 필요한 자료 정자 동결에 필요한 자료 <ol><li> 10 μl 일회용 pipettes (Fisherbrand 고양이 # 22-358697) </li><li> MESAB / Tricaine를 포함하는 물고기 물 250ml 비커 </li><li> 시계 안경 (Pyrex 고양이 # 9985-75) </li><li> P20 pipetman (또는 이에 상응하는 금액) 및 팁 </li><li> 스폰지 물고기 홀더 (압박하면서 남성을 개최) </li><li> 위의 무대 조명과 현미경을 해부 </li><li> 플랫 포셉 (예 : Millipore 타입) </li><li> 2.0ml 극저온 튜브 (코닝 고양이 # 430488) </li><li> 10X10 cryoboxes (Nalgene 고양이 # 03-337 - 7AA) </li><li> 스티로폼 용기는 잘게 조각 건조 ice1의 ~ 15cm로 가득 </li><li> 15 ML 원뿔 튜브 (팔콘 # 352099) </li><li> 액체 질소를 포함하는 듀어 플라스크 </li><li> 긴 집게 (예 : CMS 피셔 의료 고양이 # 10 - 316B) </li><li> Cryogloves </li><li> 남성에 대한 복구 탱크 </li><li> 한 eppendorf 튜브은 메탄올없이 냉동 미디어로 가득 </li><li> 한 eppendorf 튜브는 메탄올과 함께 냉동 미디어로 가득 </li><li> Cryofreezer (예 : 테일러 - 워튼 K - 시리즈) </li></ol> 한 잘게 조각 드라이 아이스를 만들기위한 간단한 방법은 수건에 싸서 망치로 그것을 격파하는 것입니다. 보다 효율적인 방법은 드라이 아이스 연삭기, 예를 들어 클로슨 모델 RE - 2를 사용하는 것입니다. 파트 C : 정자의 동결 방법 <ol><li> 모세관 튜브를 표시 : 전에 처음으로 (바닥에서 즉, 16.7 mm를, 그림 1.1을 참조하십시오.) 3.33 μl 수준의 연구소 펜으로 10μl 모세관 튜브를 표시합니다. </li><li> MESAB / tricaine은 ( &quot;Zebrafish 도서&quot;에 요리법) 생선 물에 희석 포함하는 비커에 플레이스 남성 (S) : 남자를 마취 </li><li> DRY 물고기 : 일단 anesthetized는 플라스틱 숟가락을 사용하여 마취의 물고기가 밖으로 들고 부드럽게 복부 측면을 건조하기 위해 특별한주의를 기울이고, 종이 타월에 마른 생선을 얼룩. 그것이 철저하게 배설강 주위에 건조하는 것이 중요하므로 물이 정자를 활성화합니다. 스펀지 홀더에 위치 물고기, 복부 측면 접속 (그림 1.2). 항문 지느러미 주변 지역은 여전히​​ kimwipe로 부드럽게 건조하고 습한 경우. 정자를 조기 천천히하는데주의를 기울여야! </li><li> 이곳은 모세 튜브와 함께 제공되는 고무 마우스 피펫 어댑터에 모세관을 표시했습니다. 어댑터 한 끝에 마우스 피스와, 다른 한편으로는 모세관 홀더를 가진 고무 호스입니다. 또는 모세관은 적절한 직경의 tygon 관의 짧은 조각을 통해 50μl 해밀턴 주사기에 연결될 수 있습니다. </li><li> 플레이스의 범위에 따라 남성과 조심스럽게 모세관 튜브의 끝 부분을 사용하여 분리 골반 지느러미를 확산하여 urogenital 개방을 폭로. </li><li> 정자를 수집합니다 부드럽게 부드러운 포셉 (예 : Millipore)와 물고기의 측면을 쓰다듬어하여 정자를 추방하거나 부드럽게 당신의 검지 손가락과 엄지손가락 사이의 물고기의 양면을 쥐어하여. 그것이 부드러운 흡입 (그림 1.2)를 사용하여 퇴학와 같이 모세관에 정자를 수집합니다. 정자와 함께 퇴학 수 있습니다 대변하지 마십시오. </li><li> μl 3.3에 정자 볼륨을 정상화 : 정자 도달의 볼륨 또는이 모세관 (예 : 16.7 mm 이상)에 펜으로 표시를 초과하는 경우 8 단계로 진행합니다. 정자 볼륨 대상 볼륨에 도달하지 않는 경우, 메탄올 (그림 1.3)없이 고정 매체를 사용하여 펜 표시 볼륨을 정상화. 허용됩니다 정자의 최소 금액은 정자의 품질에 따라 다릅니다. 좋은 정자 흰색 불투명합니다. 불쌍한 정자는 물 보입니다. 1 μl 좋은 정자 (또는 3분의 1 대상) 2 μl 가난한 정자 (또는 3분의 2 대상) : 일반적으로, 우리는 최소로 받아들입니다. 볼륨은 지금 3.3 μl로 정상화됩니다. </li><li> 정자에 CRYOPROTECTANT ADD : M과 함께 냉동 매체를 빨아오렌지 마르크 (.; 그림 1.4 약 총 볼륨이 현재 20 μl)로 에탄올. 거품을 소개하지 않도록 특별한주의를 기울이고, 시계 유리 청소 영역에 정자와 cryoprotectant 혼합물을 추방. 부드럽게 그리고 아래로 pipetting ~ 4 번 (거품을 도입하지 않도록)로 섞는다. </li><li> 이 CRYOVIALS의 각 INTO 10μl 정자 장소 : 정자의 피펫 10 μl : 관련 정보 (그림 1.5)으로 표시되었습니다 두개의 cryovials 하단에 cryoprotectant 솔루션입니다. 신속하게 캡 튜브를 이동하고 실내 온도 15 ML 팔콘 튜브 - 원 cryovial / 튜브 하단에 그들을 놓으십시오. 캡 팰컨 관과 조각 드라이 아이스로 cryovial 함유 팰컨 튜브의 쌍을 삽입합니다. </li><li> 20 분 정자 꼼짝마. DRY ICE ON : 드라이 아이스 괜찮 분말 형태가 아닌 알약에 있어야합니다. 튜브는 깊은 정도만이 자신의 모자가 (그림 1.6) 표시되는 드라이 아이스에 삽입해야합니다. 드라이 아이스에 튜브를 추적하기 위하여, 팰컨 튜브의 각 쌍의에게 1-20 사이의 숫자를 (뚜껑에 작성)을주고 그들이 드라이 아이스에 들어가 시간을 기록합니다. </li><li> 액체 질소 INTO 플레이스 CRYOVIALS이 :. 정자 20 분 드라이 아이스에 동결되고 나면, 액체 질소 함유 듀어 플라스크를 그들을 전송할 수 있습니다. 정자는 액체 질소 냉동고에 장소 시간까지 여기에 저장됩니다. 샘플가 가열되지 않도록 액체 질소의 목욕에있는 냉장고 상자에 배치, 장소 냉장고 상자. 듀어 플라스크에서 튜브를 복구하고 cryogloves로 처리하는 긴 금속 집게를 사용하십시오. 냉동고 박스 스티로폼 용기에 액체 질소에 보관 포장되어있는 경우 또는 cryovials는 냉동실 상자에 드라이 아이스에서 직접 전송하실 수 있습니다. </li><li> 극저온 액체 질소 냉동고에 저장 cryovials이 장기. 정자의 생존을 유지하기 위해서는 튜브는 액화 질소에 포장되어 저장하는 것이 중요합니다. 우리의 경험에서, 기상 위상에 저장된 튜브는 시간이 지남에 따라 경쟁력을 잃게됩니다. 속도는 중요하다! cryoprotectant를 추가하고 (즉, 단계 6-10) 드라이 아이스에서 정자 튜브를 삽입 사이의 시간이 더 이상 30 초되어야합니다. </li></ol> 파트 D : Cryopreserved 정자를 사용하여 체외 수정의 방법 우리는이 두 사람과 가장 잘 작동 것을 발견했습니다. 다른 사람이 정자는 녹아서 동안 한 사람이 여성에서 달걀을 했군. <ol><li> 33 ° C.에 물 목욕을 설정 </li><li> 액체 질소 함유 해동 준비까지 듀어 플라스크를 액체 질소 냉동고 및 전송에서 cryovial 제거합니다. </li><li> 35mm 플라스틱 페트리 접시로 여성의 난자를 짜내. 가능하면, 계란 3 클러치를 얻는 하나의 그릇에 결합하려고합니다. 당신이 첫 번째 클러치 1 분 안에 3 좋은 클러치를 얻을 수 없다면 (한 좋은 클러치가 충분합니다) 4 단계로 진행합니다. 좋은 클러치의 정의 :&gt; 150 균일하게 잘보고 달걀 (예 : 노란, 열화 지표없이 하얀 잔해와 함께). 정자가 해동되는 동안 대상 음식 보관하십시오. </li><li> 액체 질소의 병을 제거하고 뚜껑을 제거합니다. 33 80-10 초에 대한 ° C 물 목욕으로 신속하게 담가 병에 ~ 1 / 2 방법입니다. </li><li> 신속하고 위아래로 pipetting하여 유리병과 혼합 70 μl 방 온도 행크스를 추가합니다. 즉시 계란에 추가하고 피펫 팁과 함께 부드럽게 섞는다. </li><li> 지체없이, 750 μl 물고기 물을 추가하여 정자와 난자를 활성화해야합니다. 섞어 소용돌이. 실온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 5 분 후, 28에서 생선 물 품어 요리와 요리를 기입 ° C. 2-3 시간 후, 개수 및 100mm 요리 (50/dish)에 비옥한 배아를 전송합니다. 수정 주파수가 결정 수 있도록 불임 계란을 계산합니다. </li><li> 애벌레 잘 부탁해! 처음 5 일 동안 매일 물을 변화와 죽은 태아를 제거합니다. 일 5 보육에 수영 bladders가있는 애벌레를 넣어. </li></ol> 부품 E : 대표 결과 우리는 년 2001 년에서 2003 년 사이 틸링에 대한 8600 냉동 정자 샘플 라이브러리를 만들기 위해이 crypreservation 방법론을 사용. 우리는이 샘플 106를 해동하고 불임을 결정했습니다. 다산은 냉동 정자와 함께 수정된되었습니다 계란의 총 수로 나눈에서 체외의 수정에서 생산 가능한 배아의 비율입니다. 신선한 (cryporeserved 비) 정자 일반적으로&gt; 95 %의 불임있다; cryopreserved 정자가 훨씬 낮은 불임을 가지고 : 29 % (N = 106 병)의 평균. 다산의 유리병 - 투 - 유리 변화는 1 % 미만 62 %로 높이에 이르는 대형이다. 이 변화는 그림에서 표준 편차를 나타내는 큰 오차 막대로 표시됩니다. 2. 그러나 우리가 한 번만 정자 샘플을 모두 0 % 불임을 경험하고 해당 틸링 변이를 복구하는 실패 날짜 해동 106 정자 샘플 인치 몇 년간의 과정을 통해 우리 도서관에서 정자 튜브를 해동하여 (2001년에서 2008년까지) 우리는이 방법으로 냉동 정자 샘플의 평균 불임 남아 것으로 나타났습니다안정 시간이 지남에 (그림 2). 2001 년 해동 냉동 정자 샘플의 평균 다산은 23.5 % (11 정자 샘플에 따라 이전) 2008 25 % (21 정자 샘플을 기반으로)되었습니다. 다른 조사의 숫자는 이제 실험실에서 정자 동결 프로토콜을 사용하고 있습니다. 일부는 우리가 관찰한 것을과 비슷한 불임 속도와 샘플 - 투 - 샘플 변화와 좋은 성공을보고있다. 기타 보도에 따르면이 프로토콜들은 손에 작동하도록하는 데 실패했습니다. 우리는 문제의 가능성이 소스가 생각 : <ol><li> ; 때 드라이 아이스로 냉각의 다른 속도로 이어지는, 우리가 프로토콜의 제안이 정확한 cryovials 또는 원뿔 튜브를 사용하지 않으면 </li><li> , 하위 최적의 냉각 속도로 이어지는, 분말 드라이 아이스를 사용하지 않으면 </li><li> 가난한 다산과 남성의 물고기를 사용 : 당신은 한 남성으로부터 정자 최소한 1 μl를해야합니다. 그것이 100 % 다산 접근하는 것은 매우 신선한 정자를 필요하기 때문에 당신은 또한 신선한 정자와 체외의 수정에를 수행하여 남성 불임을 테스트할 수 있지만이 오해하실 수 있습니다. </li><li> 에서 체외의 수정에 하위 표준 품질 계란을 사용합니다. 아무것도하지만 완벽한 클러치를 사용하면 항상 0 % 다산 가까운, 심지어 실제로 좋은 다산 (중복 유리병의 불​​임에 따라)가 정자 샘플에서 발생합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 정자 동결 방법론의 도식. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Cryopreserved 정자 불임 시간이지나면서 안정 남아있다. 비율 다산의 냉동 정자와 함께 수정된되었습니다 계란의 총 수로 나눈에서 체외의 수정에서 생산 가능한 배아의 번호입니다. &quot;N&quot;은 다산 해당 연도에 테스트되었습니다 cryopreserved 정자 튜브의 개수를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 정자 약병은 다른 남자의 것이므로, 병에 - 투 - 유리 변화가 관찰됩니다.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

다른 조사의 숫자는 이제 실험실에서 정자 동결 프로토콜을 사용하고 있습니다. 일부 유사한 불임 우리가 관찰이 동일한 샘플 - 투 - 샘플 변화를보고있다. 기타 보도에 따르면이 프로토콜들은 손에 작동하도록하는 데 실패했습니다. 우리는 문제의 가능성이 소스가 생각 : <ol><li> ; 때 드라이 아이스로 냉각의 다른 속도로 이어지는, 우리가 프로토콜의 제안이 정확한 cryovials 또는 원뿔 튜브를 사용하지 않으면 </li><li> , 하위 최적의 냉각 속도로 이어지는, 분말 드라이 아이스를 사용하지 않으면 </li><li> 가난한 다산과 남성의 물고기를 사용 : 당신은 한 남성으로부터 정자 최소한 1 μl를해야합니다. 그것이 100 % 다산 접근하는 것은 매우 신선한 정자를 필요하기 때문에 당신은 또한 신선한 정자와 체외의 수정에를 수행하여 남성 불임을 테스트할 수 있지만이 오해하실 수 있습니다. 더 크고 견고하게 색깔 남성은 일반적으로 더 높은 품질의 정자를 제공합니다. </li><li> 에서 체외의 수정에 하위 표준 품질 계란을 사용합니다. 아무것도하지만 완벽한 클러치를 사용하면 항상 0 % 다산 가까운, 심지어 실제로 좋은 다산 (중복 유리병의 불​​임에 따라)가 정자 샘플에서 발생합니다. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;l 일회용 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>시계 접시</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 극저온 보관 튜브</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>10 x 10 크라이오박스</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원추형 튜브</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>초저온 냉동고</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>예시</td></tr></tbody></table>

높은 처리량 zebrafish의 정자 cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

이것은 하비 방법 (하비 외., 1982)의 적응이다 zebrafish의 정자 cryopreservation위한 방법입니다. 우리는 모두 절차를 간소화하고 향상 샘플 균일성 원래 프로토콜 두 가지 변경 사항을 도입했습니다. 첫째, 우리는 cryoprotectant를 포함하지 않는 동결 미디어를 사용하는 모든 정자 볼륨을 정상화. 둘째, cryopreserved 정자 대신 모세관 튜브의 cryovials에 저장됩니다. (δ ° C / 시간)를 동결 융해 정자의 가격은 아마도이 프로 시저에서 제어하는​​ 두 가지 가장 중요한 변수이다. 이러한 이유로, 지정된들을 위해 다른 튜브를 대체하지 않습니다. 그것이 팀 작업하면 ~ 2 시간에 팀 당 100 남성의 정자를 동결 수 있습니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 25 % 다산의 평균을 가지고 (수정된 달걀의 총 수로 나눈 체외의 수정에에서 발생 가능한 배아의 숫자로 측정)이 %로 다산은 많은 년간 안정 cryopreserved.

이것은 zebrafish에 대한 높은 처리량 정자 cryopreservation 프로토콜입니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 이후의 체외 수정에 25 % 다산의 평균을 가지고 있으며, 수년 동안 안정 cryopreserved.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

본 방법은 Harvey 방법(Harvey et al., 1982)을 응용한 제브라피시 정자 냉동 보존법입니다. 당사는 ...에 대해 두 가지 변경 사항을 도입하였습니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 분자 및 세포 생물학과에서 온 Bruce Draper입니다. 그리고 저는 시애틀에 있는 Fred Hutchinson 암 연구 센터 기초 과학 부문의 Cecilia Moans입니다. 오늘 저와 Cecilia는 Brian Harvey의 원본 프로토콜을 수정한 제브라피쉬 정자 동결 보존 프로토콜을 시연하고자 합니다. 저희는 두 명씩 팀을 이루어 작업하면 2시간 이내에 100마리의 개별 수컷 정자를 동결 보존하는 것이 가능하다는 점을 보여드릴 것입니다.해동 후 가임력의 범위는 매우 다양하지만, 평균적으로 25%의 가임력을 얻고 있으며, 이는 7년 이상 냉동 보존된 라이브러리 결과입니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 이 절차를 수행하기 전, 먼저 정자 동결 용액을 제조하십시오.Ginsburg Fish ringer 용액은 3일마다 새로 조제하며, 동결 매질은 메탄올 포함 여부에 따라 매일 새로 조제합니다. 이 용액들의 조성은 본 프로토콜에 수반되는 온라인 보충 정보에서 확인할 수 있습니다. 이 절차에 사용되는 재료들은 동결 및 해동 속도에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 결과적으로 동결 정자의 수태능력에 영향을 줄 수 있습니다.이러한 이유로 권장 재료 목록이 온라인 보충 정보로 함께 제공됩니다. 정자는 드라이아이스 펠렛보다는 곱게 부순 드라이아이스 위에서 냉동하는 것이 가장 좋습니다. 드라이아이스를 부수는 간단한 방법 중 하나는 수건으로 감싼 뒤 망치로 가루 내는 것입니다.더욱 효율적인 방법은 claws and model RE two와 같은 드라이아이스 그라인더를 사용하여 제브라피쉬 정자를 동결하는 것입니다. 먼저 실험실용 펜을 사용하여 10 µL 모세관 튜브의 3.33 µL 지점 또는 바닥에서 약 16.7 mm 높이에 표시합니다. 수컷을 마취시키기 위해 trica가 희석된 어류용수에 수컷 2~4마리를 비커에 넣습니다. 해당 처방은 제브라피쉬 도서에서 확인할 수 있습니다.마취가 완료되면 플라스틱 스푼을 사용하여 물고기를 마취액에서 건져내고 페이퍼 타월 위에서 부드럽게 닦아 물기를 제거합니다. 특히 복부 쪽을 닦는 데 주의를 기울이십시오. 물은 정자를 활성화시키므로 유두(ika) 주변을 철저히 건조시키는 것이 매우 중요합니다.물고기의 배 쪽이 위로 향하도록 스폰지 홀더 위에 놓습니다. 배지느러미 주변 부위가 여전히 젖어 있다면, Kim wipe로 부드럽게 닦아 건조시킵니다. 표시된 모세관을 모세관과 함께 제공된 고무 마우스 피펫 어댑터에 끼웁니다.어댑터는 한쪽 끝에 마우스피스가 있고 다른 쪽 끝에 모세관 홀더가 있는 고무 호스입니다. 또는 모세관을 50 µL Hamilton 시린지에 연결할 수도 있습니다. 적절한 직경의 짧은 Tigon 튜브를 사용하여 수컷을 현미경 아래에 두고, 골반지느러미를 조심스럽게 벌려 비뇨생식공을 노출시킵니다.모세관의 끝부분을 사용하여, 매끄러운 핀셋으로 물고기의 측면을 부드럽게 쓸어내리거나 검지와 엄지로 물고기의 측면을 살짝 눌러 정자를 배출시킵니다. 정자가 배출될 때 부드럽게 흡입하여 모세관에 수집하십시오. 정자와 함께 배출될 수 있는 분변이 섞이지 않도록 주의하십시오. 정자의 목표 수집량은 3.3 µL입니다.허용 가능한 최소 정자 양은 정자의 품질에 따라 다릅니다. 상태가 좋은 정자는 흰색이며 불투명한 반면, 품질이 낮은 정자는 묽게 보입니다. 일반적으로 허용 가능한 최소 정자 양은 양질의 정자인 경우 1 µL 또는 목표량의 1/3이며, 품질이 낮은 정자인 경우 2 µL 또는 목표량의 2/3입니다.정자 부피가 목표 부피인 3.3 µL에 도달하지 않은 경우, 메탄올이 포함되지 않은 동결 매질을 사용하여 펜 표시선까지 부피를 정규화해야 합니다. 정자의 부피가 이미 모세관의 펜 표시선에 도달했거나 초과한 경우에는 다음 단계로 진행하십시오. 이제 정자에 동결보존제를 첨가합니다.메탄올이 포함된 동결 매질을 주황색 표시선까지 흡입합니다. 이때의 대략적인 총 부피는 20 µL입니다. 정자와 동결보호제 혼합물을 시계 유리(watch glass)의 깨끗한 영역에 분출한 후, 피펫팅을 약 4회 반복하여 부드럽게 혼합하며 이때 기포가 생기지 않도록 주의합니다.라벨이 부착된 각 크라이오 바이알 바닥에 정자 동결보존액 10 µL를 피펫팅하여 정자를 두 개의 크라이오 바이알로 분주합니다. 신속하게 바이알의 캡을 닫고, 각 크라이오 바이알을 각각 별도의 15 mL 팰컨 튜브에 넣습니다. 실온에서 팰컨 튜브의 캡을 닫고 고운 가루 형태의 드라이아이스에 삽입합니다.falcon tube를 식별할 수 있도록 캡 부분만 보이게 튜브를 충분히 깊게 삽입해야 합니다. 각 튜브에 번호를 매기고 드라이아이스에 넣은 시간을 기록하십시오. 정자가 드라이아이스에서 20분 동안 동결되도록 둡니다.정자를 동결한 후, 두 개의 cryo vial을 액체 질소가 들어 있는 듀어 플라스크(dewar flask)로 옮깁니다. 일시적인 보관을 위해, 샘플이 가열되지 않도록 냉동 보관 박스를 액체 질소 배스(bath)에 넣으십시오.긴 금속 집게를 사용하여 듀어 플라스크에서 바이알을 꺼내고, 극저온 장갑을 착용하여 취급하십시오. 또는, 크라이오 바이알을 드라이아이스에서 냉동고로 직접 옮길 수도 있습니다. 장기 보관을 위해 스티로폼 용기에 담긴 액체 질소에 냉동고 박스를 계속 침전시켜 두는 경우, 크라이오 바이알을 극저온 액체 질소 냉동고에 보관하십시오.정자의 생존력을 유지하기 위해서는 바이알을 액체 질소에 침지하여 보관하는 것이 매우 중요하며, 기상(vapor phase)에 보관된 바이알은 시간이 지남에 따라 생존력이 저하될 수 있습니다. 또한 정자 생존력 유지에는 속도가 매우 중요합니다. 동결보호제를 첨가한 후 정자 바이알을 드라이아이스 위에 놓기까지의 시간은 30초 이내여야 합니다. 체외 수정.냉동 보존된 정자를 사용할 때는 두 사람이 함께 작업하는 것이 가장 효율적입니다. 한 사람은 암컷으로부터 난자를 짜내고, 다른 한 사람은 정자를 해동합니다. 항온수조를 33 °C로 설정하십시오.액체 질소 냉동고에서 크라이오 바이알을 꺼내 해동 준비가 될 때까지 액체 질소가 담긴 듀어(Dewar) 또는 플라스크로 옮깁니다. 마취된 암컷 제브라피시로부터 알을 짜내어 35 millimeter 플라스틱 페트리 접시에 담습니다. 이 과정은 제브라피시에 대해 자세히 설명하고 있는 Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure라는 제목의 JoVE 프로토콜에 상세히 기술되어 있습니다.체외 수정 시, 양질의 난자 뭉치(clutch)는 균일하고 황색을 띠는 난자가 150개 이상 포함되어 있어야 합니다. 흰색 부유물이 보인다면 이는 퇴화되었음을 나타냅니다. 가능하다면 세 뭉치의 난자를 확보하여 하나의 배양 접시에 합치십시오.첫 번째 클러치 이후 1분 이내에 양호한 클러치 3개를 얻지 못한 경우, 다음 단계로 진행하십시오. 정자가 해동되는 동안 디쉬의 덮개를 닫아 두십시오. 그동안 바이알을 액체 질소에서 꺼내 캡을 제거합니다.바이알을 33°C 항온수조에 8~10초 동안 빠르게 절반만 담급니다. 실온의 Hank's buffered salt solution 70 µL를 바이알에 빠르게 가하고 피펫팅으로 혼합한 후, 즉시 페트리 접시에 담긴 난자에 첨가하고 피펫 팁으로 부드럽게 섞어줍니다. 그런 다음 어항수 750 µL를 가하여 정자와 난자를 즉시 활성화하고, 소용돌이 모양으로 섞어 실온에서 5분 동안 배양합니다.5분 후, 디쉬에 물고기와 물을 채우고 28°C에서 배양합니다. 2~3시간 후, 생존 가능한 배아의 수를 세어 100mm 디쉬로 디쉬당 50개씩 옮깁니다. 또한 정자 샘플의 수정 능력을 결정할 수 있도록 수정란의 수도 세어 줍니다.정자 수정능은 체외 수정을 위해 사용된 전체 난자 수 대비 생존 배아의 비율입니다. 난자는 체외 수정 후 2시간에서 6시간 사이 언제든지 분류할 수 있습니다. 수정되지 않은 난자는 투명하고 분할되지 않은 상태이므로 생존 배아와 쉽게 구별할 수 있습니다.실체 현미경의 투과 조명으로 관찰했을 때, 냉동 보존된 정자의 평균 수정률은 매우 다양하게 나타납니다. 하지만 수년 동안 안정적으로 평균 25%의 수정률을 유지하는 것이 가능해야 합니다. 이 그래프는 2001년에서 2003년 사이에 냉동되었다가 최근 2008년까지 사용된 정자의 평균 수정률 백분율을 보여줍니다.본 영상에서는 제브라피쉬 정자의 고효율 동결 보존 방법을 시연하였습니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 권장되는 모든 플라스틱 소모품과 장비를 사용하는 것이 중요하며, 드라이아이스 펠릿보다는 분쇄된 가루 형태의 드라이아이스를 사용해야 합니다. 매우 우수한 품질의 정자와 난자를 사용하는 것이 필수적이며, 특히 체외 수정을 위해 정자를 해동하여 난자에 처리할 때, 최종적으로 얻게 될 수정란의 수를 늘리기 위해 가능한 한 많은 수의 난자를 사용하는 것이 중요합니다. 이를 위해 3~4마리의 암컷이 필요할 수 있습니다.프로토콜의 또 다른 핵심 요소는 속도입니다. 수컷으로부터 정자를 추출하여 드라이아이스에 넣기까지 약 1분 이상 걸려서는 안 됩니다. 이것으로 모두 마친 것 같습니다.실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

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