초기 압력에 의해 Gynogenetic의 Diploid의 Zebrafish 만들기

안녕하세요, 저는 오리건 대학교 신경과학 연구소의 Charles Kimmel 교수님 연구실 소속 Charlene Walker입니다. 그리고 저는 Fred Hutchinson 암 연구 센터 기초과학부의 Cecilia Moens 교수님 연구실에서 근무하고 있는 Gregory Walsh입니다.

오늘은 조기 가압법을 통해 삼배체 제브라피시를 만드는 절차를 보여드리겠습니다. 이 방법은 UV 조사된 정자로 수정된 난자의 미세소관을 정수압을 이용해 탈중합시키는 방식이며, 정확한 타이밍에 맞추어 수행되어야 합니다.

이렇게 하면 제2극체가 배출되는 것을 방지하여, 상동 염색체가 감수 분열 1기의 두 결과물인 이배체 배아를 생성하게 됩니다. 이 기술은 제가 오리건 대학교의 George Reisinger 연구실에서 근무하던 1970년대 초반에 고안되었습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 2세대 4유전 스크리닝에 활용하고 있습니다.

F1 돌연변이 유발 물고기의 생식세포를 직접 스크리닝하여, 동형접합 gyno 유전적 이배체 자손에서 발생 표형을 유발하는 열성 돌연변이를 확인할 수 있습니다. 제브라피시는 높은 유전적 간섭을 보이기 때문에, 이 방법을 사용하여 돌연변이의 염색체 위치를 매핑하고 이들 돌연변이가 중심립에서 얼마나 떨어져 있는지 추정할 수도 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 실험 전날 늦은 오후에, 압착할 암수를 분리하여 정자 수집을 준비하십시오. 이때 노령의 수컷은 유전 물질을 기여하지 않으므로 사용할 수 있습니다.

암컷은 몸집이 크고 배가 불룩해야 하며, 수컷은 노란색을 띠고 활발해 보여야 합니다. 다음 날 아침에 쉽게 꺼낼 수 있도록 수컷과 암컷을 각각 별도의 유지 탱크에 넣어 하룻밤 동안 보관하십시오. 실험 당일 아침에 Hank's 용액을 준비하고 탄산수소나트륨을 첨가하십시오.

얼음 버킷에 담아 어류 시설로 운반합니다. Hank's solution, trica, 타이머, 그리고 정자 수집용 튜브를 준비합니다. 마지막으로, 어류 시설에 도착하면 trica를 어류용수로 희석합니다.

이는 다음 단계에서 어류를 마취하는 데 사용됩니다. 정자 수집을 시작하려면, 얼음 위에 Hank's 용액이 담긴 투명한 바이알을 준비하십시오. 수컷 한 마리당 약 50 µL의 충분히 차가운 Hank's 용액을 준비하여, 한 번에 한두 마리의 수컷을 마취하십시오.

침지 및 트라이카(trica) 과정을 거친 후, 플라스틱 스푼을 사용하여 마취액에서 물고기를 건져냅니다. 수컷 물고기를 세척하고 종이 타월로 두드려 물기를 완전히 제거하십시오. 물은 정자를 활성화시키므로 이 과정은 매우 중요합니다.

물고기가 마르면, 낙사 조명을 갖춘 저배율 실체 현미경 하의 폼 홀더에 고정합니다. 핀셋으로 골반지느러미를 벌리고 정자를 수집하기 위해 모세관을 총배설강 입구에 위치시킵니다. 생식공에서 우윳빛 정자가 나오면 부드러운 밀 포어 핀셋으로 물고기의 옆면을 부드럽게 하지만 단단하게 쓸어내립니다. 부드러운 흡입력을 이용하여 모세관에 정자를 수집하고, 여러 마리의 수컷으로부터 수집한 정자를 얼음에 보관하며 추출합니다.

5~10마리의 수컷으로부터 얻은 냉각된 Hanks 염화나트륨 용액 내 정자는 20~30마리의 암컷 난자를 수정시키기에 충분합니다. 냉각된 Hanks 용액에 보관된 정자는 수 시간 동안 효율적으로 난자를 수정시킬 수 있습니다.

정자를 UV 불활성화하기 위해 탁한 현탁액을 만들 수 있을 만큼의 충분한 정자를 수집합니다. 먼저 유리 페트리 접시 바닥에 얼음을 채웁니다. 접시 속 얼음 위에 시계 유리를 올려놓습니다.

다음으로, 피펫을 사용하여 시험관에서 정자를 시계접시로 옮깁니다. 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하면서 가능한 한 많은 양의 정자를 피펫에 취하십시오. 정자에 기포가 생기지 않게 하는 것이 매우 중요하며, 정자를 시계접시 위에 얇고 고르게 펴서 분사한 후 피펫을 폐기하십시오.

정자를 옮긴 후, 페트리 접시를 UV 가교기(crosslinker)에 넣습니다. 에너지 설정값이 900 JUULs를 전달하도록 가교기를 켭니다. 가교 후, 깨끗한 피펫을 사용하여 시계 유리(watch glass)에서 정자를 제거하고, 'UV sperm'이라고 표시된 펜도르 튜브(fendor tube)로 옮긴 후 얼음에 둡니다.

난자 채집을 시작하기 위해 먼저 암컷 두 마리를 한 번에 마취합니다. Trica의 경우, 장시간 마취는 물고사를 유발할 수 있으므로 물고기를 Trica에 너무 오래 두지 않는 것이 매우 중요합니다. 그다음, 물고기를 사육수로 헹구고 종이 타월로 가볍게 눌러 물기를 제거합니다.

과도한 수분은 알을 팽창시켜 수정을 방해하므로 이 과정은 매우 중요합니다. 젖었지만 축축하지 않은 손가락을 사용하여 암컷을 35 millimeter 플라스틱 Petri dish에 옮기십시오. 복부를 부드럽지만 단단하게 누릅니다.

암컷이 산란할 준비가 되었다면 알이 쉽게 배출됩니다. 스패튤라를 사용하여 알을 수집하고 암컷을 다시 물에 넣으십시오. 건강한 알은 노란색을 띠며 반투명하지만, 암컷의 체내에 너무 오래 머문 알은 흰색이며 수분 함량이 높습니다. 양질의 알을 얻으려면 어류 시설의 조명이 켜진 후 첫 2시간 이내에 수집하고, 알이 마르지 않도록 덮어 보관하십시오.

난자를 수집한 후, UV 정자 현탁액 30~50 µL를 난자에 첨가하고 피펫 팁으로 부드럽게 섞어줍니다. 즉시 물 1 mL 정도를 첨가하고 타이머를 시작합니다. 이 시점에서 발달하도록 둔 난자는 haplo가 됩니다.

다음 단계들은 수정 후 90초 이내에 완료되어야 합니다. 물을 첨가하여 난자가 활성화되는 시점에 타이머를 시작하십시오.

감수 분열 1기의 중기 진입 시점은 온도에 따라 달라집니다. 압력 인가 및 해제 타이밍은 28.5 °C에 최적화되어 있습니다. 타이머를 시작한 후 잠시 기다렸다가, 물을 더 추가하고 난자를 접시 중앙으로 흔들어 모읍니다.

끝을 자르고 다듬은 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 필요한 경우 수정란을 가압 바이알로 옮기고, 바이알의 루프 부분에 물방울이 맺힐 정도로 수정란 보존액을 거의 넘치게 추가합니다. 그다음, 물방울 위에 고무 캡을 덮고 그 위에 플라스틱 뚜껑을 씌워 고정합니다.

바이알을 압력 실린더에 거꾸로 세워 넣고, 난백수를 더 추가합니다. 실린더를 채우기 위해 실린더 상단을 단단히 닫습니다. 폐쇄가 완료되면 플런저가 위를 향하도록 실린더를 프레스에 넣고 8,000 pounds per square inch의 압력을 가합니다.

활성화 시점으로부터 6분이 경과할 때까지 실린더를 프레스에 그대로 두어, 총 4.5분 동안 가압합니다. 활성화 6분 후, 프레스에서 실린더를 꺼냅니다. 실린더에서 바이알을 꺼내고, 배아가 냉각되지 않도록 주의하여 건조시킵니다.

실린더를 초기화하고 난수(egg water)를 다시 채웁니다. 필요에 따라 다음 바이알에 난수를 부분적으로 채워 준비합니다. 모든 난 배치에 대해 이 단계들을 반복합니다.

실린더에는 한 번에 최대 두 개의 바이알을 넣을 수 있으므로, 트리카(trica) 내에 이미 있는 다른 암컷들이 알을 낳는지 확인하기 위해 난자의 수정을 1~2분 정도 지연시키는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 한 번에 더 많은 배치를 처리하여 속도를 높일 수 있습니다. 또한, 프레스가 사용 중일 때 물고기를 짜내면, 프레스를 다시 사용할 수 있는 수정 24시간 후까지 시간이 흐르는 동안 알이 너무 말라 생존 능력을 상실할 수 있습니다. 반수체 제브라피시 배아는 몸집이 짧고 통통하며, 꼬리가 짧고 뇌 형성이 덜 뚜렷한 특징을 보입니다.

그럼에도 불구하고 이들은 모두 체절(somites), 신경삭(no cord), 눈, 귀와 같은 동일한 신체 부위를 갖게 됩니다. 이배체(diploids), 반배체(haplos), 이배체 모두 24시간 무렵에 제약 없는 굴곡 운동을 보입니다. 수정 후, EP 이배체 형제들은 긴 꼬리와 잘 형성된 뇌를 가지며, 생존율은 약 60%에서 70% 정도여야 합니다.

이들은 처리하지 않은 배치 대조군과 매우 유사해 보입니다. 일반적으로 합생 배아 묶음에는 외관이 양호한 배아, 죽은 배아, 그리고 그 사이의 모든 상태의 배아가 섞여 있습니다. 결함이 있는 배아 대비 외관이 양호한 배아의 비율은 암컷 게놈에 내포된 유해 유전자를 반영합니다.

이러한 배경지식이 있다면 동일한 특성 표현형을 가진 개체가 최대 50%까지 나타나므로 돌연변이를 비교적 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 방법으로 생성된 배아가 실제 OID인지 확인하는 것이 중요합니다. 대조군으로서, UV 불활성화를 거치지 않은 정자의 일부를 따로 보관하여 정상적인 이배체 난자 무리를 생성하고, EP 과정을 거치지 않고 UV 처리된 정자로 수정된 난자 무리를 따로 보관하여 반배체 배아 무리를 생성하십시오. 반배체 배아는 2~3일 후에 생존하지 못합니다. EP 전개 배아는 정상적인 이배체와 유사한 모습이어야 합니다.

일부 불규칙한 EP 몬스터가 발생할 수 있지만, EP 이배체 클러치는 약 70에서 90% 정도로 대체로 생존 가능해야 합니다. EP 배치 클러치에 반배체가 존재한다는 것은 EP 과정에 실패했음을 시사합니다. 예를 들어, 프레스가 압력을 유지하지 못한 경우가 이에 해당합니다. 반배체 클러치에 이배체가 존재한다는 것은 정자 불활성화가 불완전했음을 시사하며, 예를 들어 가교제의 결함이 원인이 될 수 있습니다.

지금까지 제브라피쉬의 체외 수정 방법과 제2 극체 분열을 억제하여 유전적 2배체 제브라피쉬 배아를 만드는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 초기 가압 시점이 매우 정밀해야 하며 처리 과정 전반에 걸쳐 압착기가 8,000 pounds per square inch의 압력을 유지해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 압착기의 교정 상태를 반드시 확인하시기 바랍니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에서 좋은 결과 얻으시길 바랍니다.