에 잔 심장을 떠올리 Drosophila

성인 심장을 해부하기 위해 초파리에서 박동하는 심장을 시각화하기 위해 두 가지 기술이 여기에 제시됩니다. 먼저, 머리와 흉부는 표시된 선을 따라 한 번 절단하여 제거합니다. 다음으로 생식기를 제거하고 겸자를 사용하여 복부 체강을 열고 암컷 파리의 경우 난소를 제거합니다.

복부 3과 4 분절의 복부 지방체를 조심스럽게 빨아 들여 유충 심장을 고정시키기 위해 성인 심장을 노출시킵니다. 완충 용액에 넣은 단일 유충은 유충 머리 부위 주위에 먼저 histo acral 접착제를 적용하여 고정합니다. 유충은 부드럽게 펴지고 더 많은 접착제가 뒤쪽 끝에 적용된 다음 유충 체벽의 측면에 적용됩니다.

안녕하세요, 저는 GI Fler입니다. 안녕하세요, 저는 Karen입니다. 우리는 둘 다 Burnham Institute for Medical Research의 발달 및 노화 프로그램의 회원입니다.

오늘 우리는 Laval의 박동하는 심장과 성체 초파리를 시각화하기 위해 개발한 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 이 두 가지 제제를 초파리의 심장 박동 매개변수를 시각화, 검사 및 정량화하는 방법으로 사용합니다. 초파리. 시작하기 전에 먼저 인공 혈림프 용액을 준비합니다.

이 용액에는 자당 입구, helo가 포함되어 있으며, 이는 사용 직전에 냉장 재고 용액의 인공 혈림프에 첨가해야 합니다. 세균 오염을 방지하기 위해 인공 혈림프를 실온으로 가져오고 최소 15분 동안 공기 버블링으로 용액에 산소를 공급하십시오. 다음으로, 즉석에서 지방을 제거하는 데 필요한 표준 피펫 풀러를 사용하여 여러 개의 미세한 모세혈관을 당깁니다.

모든 준비가 끝나면 성충 파리는 마취해야 합니다. 이것은 2-5분 동안 낮잠을 자도록 짧은 노출을 사용하여 수행할 수 있지만 파리가 5분 이상 낮잠을 않도록 주의하십시오. 추위에 단기간 노출되는 것도 파리를 마취하는 데 사용할 수 있지만 이산화탄소는 심박수와 시력에 더 오래 지속되는 영향을 미치므로 권장하지 않습니다.

다음으로, 마취된 파리를 바셀린의 얇은 층으로 코팅된 페트리 접시에 등쪽이 아래로 향하게 놓습니다. 날개와 몸통의 소수성 큐티클은 젤리에 되돌릴 수 있게 달라붙어야 하지만 필요한 경우 파리의 위치를 변경할 수 있습니다. 초기 절단은 구부러진 스프링 가위를 사용하여 이루어집니다.

이것은 가위 날을 파리의 다리 아래에 놓고 목 근처의 등쪽 표면을 향해 각도를 낮추어 수행됩니다. 머리, 복부 신경삭 및 다리는 한 번 절단하면 제거됩니다. 그런 다음 제제를 스프링 가위를 사용하여 산소가 공급된 인공 혈 림프 용액에 담급니다.

복부 7분절과 8분절로 구성된 복부의 후단부는 한 번의 절단으로 제거됩니다. 이것은 복부의 양쪽 가장자리를 따라 측면 절단을 할 수 있는 접근성을 제공하고 후방 장과 복부 표피 사이의 연결을 절단하는 역할을 합니다. 가위의 날을 복부 끝의 작은 구멍에 삽입하고 큐티클을 옆으로 자릅니다.

이렇게 하면 복부 큐티클의 한쪽 가장자리가 자유로워집니다. 집게로 플랩을 잡고 복부의 반대쪽 측면 가장자리를 따라 비슷한 절단을 만듭니다. 이제 복부 복부 표피의 해방된 피판을 제거할 수 있습니다.

장 및 기타 복부 장기는 일반적으로 보석상의 집게와 부드러운 잡아당기기를 사용하여 단일 덩어리로 제거할 수 있습니다. 내부 장기를 제거하면 박동하는 심장관이 드러나는데, 이 심장관은 여전히 작은 통풍 근육에 의해 등쪽 표피에 부착되어 있고 지방체로 둘러싸여 있습니다. 당겨진 모세관은 플라스틱에 삽입되고 하나의 16인치 튜브가 진공 소스에 부착됩니다.

흡입력은 팁 직경에 비례하므로 팁이 직경이 40미크론보다 큰 피펫은 한 번 설정하면 안 됩니다. 이 흡입 시스템은 심장관 주변의 과도한 지방을 빨아들이는 데 사용됩니다. 또한 큐티클 주변에 쌓인 기포와 이물질을 제거하는 데 사용할 수 있습니다.

심장 자체를 만지지 않도록 각별한 주의를 기울여야 하며, 심장의 뒤쪽 부분은 매우 약하기 때문에 그 부위를 함께 피해야 합니다. 이제 성체 초파리 심장관이 노출되어 있으며 필요한 경우 박동해야 합니다. 큐티클과 부착된 심장은 바셀린에서 큐티클을 부드럽게 들어 올린 다음 조심스럽게 다시 아래로 밟아 재배치할 수 있습니다.

심장 조직과의 접촉을 피하십시오. 이 시점에서, 제제를 목욕시키는 용액은 새로운 인공 혈림프로 교체해야합니다. 이 제제는 조작하기 전에 산소화와 함께 20-30분 동안 평형을 이루도록 해야 합니다.

제제를 60분 이상 유지해야 하는 경우 신선한 인공 혈림프를 재관류해야 합니다. 이 준비는 이제 광학 기록에 사용할 준비가 되었으며 전기 생리학적 기록 또는 조직학적 조작에도 사용할 수 있습니다. 유충 내에서 박동하는 심장을 시각화하기 위해서는 다른 기술이 필요합니다.

우선, 시술 전날의 커버 슬립을 준비합니다. 이것은 이쑤시개를 사용하여 약 50-70 마이크로 리터의 Sard 용액을 22 x 22 밀리미터 커버 슬립으로 옮김으로써 수행됩니다. 실 가드를 하룻밤 사이에 섭씨 65도에서 굳히십시오.

다음으로, Brody and Bates 완충액이 준비되면 부분 표본을 섭씨 영하 20도에서 보관하고 필요할 때 해동할 수 있습니다. 마지막으로 histo acral 접착제를 적용하는 데 필요한 도구를 준비합니다. 먼저 여러 개의 미세한 모세관을 당깁니다.

다음으로, 1.5ml 피펫 팁을 직경이 약 32인치인 작은 플라스틱 튜브에 연결합니다. 작은 쪽 끝을 튜브에 삽입하여 다른 쪽 끝에 넓은 구멍이 있는 모세관을 삽입합니다. 설정이 완료되면 모세관을 접착제 한 방울에 담그고 플라스틱 팁으로 부드럽게 흡입하여 모세관에 히스토 접착제를 로드합니다.

접착제로 작업할 때는 접착제 모세관 끝에서 과도한 접착제를 제거하기 위해 두 번째 유리 모세관을 준비해야 합니다. 접착제는 완충된 식염수와 접촉할 때까지 액체이며 몇 초 안에 굳어집니다. 그러나 일반적으로 접착제 모세관 팁에서 제거하거나 시편에 적용하는 동안 제거할 수 있을 만큼 충분히 오랫동안 플라스틱으로 남아 있습니다.

이제 유충의 고정을 시작하려면 실 가드의 각 모서리 가까이에 히스토 아크랄 접착제 한 방울을 놓습니다. 커버 슬립은 접착제 방울에 50마이크로리터의 B 및 B 버퍼를 추가하면 즉시 경화되어 접착된 부분 사이의 공간을 b와 b로 채웁니다. 접착제는 슬라이드의 버퍼를 유지합니다.

떠돌이 L 세 마리의 유충을 얼음 위의 젖은 티슈 조각에 2분 동안 올려 놓습니다. 이렇게 하면 이동 속도가 느려집니다. 다음으로, 유충을 완충 장치로 옮기고 등쪽이 위로 향하도록 방향을 지정합니다.

이것은 동일한 벨트가 없는 유충의 측면입니다. 헤드 영역과 실 가드 사이에 약간의 접착제를 빠르게 바르십시오. 접착제는 매우 빨리 굳어지고 유충의 머리가 움직이는 것을 방지합니다.

집게를 사용하여 동물의 뒤쪽 반짝임을 조심스럽게 잡고 부드럽게 펴십시오. 뒤쪽 절반에서 유충의 양쪽을 따라 접착제를 바르면 이 위치에서 유충을 고정합니다. 체벽 근육에 의한 큐티클의 움직임을 더 줄이려면 동물의 옆구리에 접착제를 더 많이 바르십시오.

이제 유충이 이 위치에 고정됩니다. 커버 슬립은 인공 혈림프로 채워진 작은 페트리 접시에 넣을 수 있으며, 이제 체벽 움직임의 간섭 없이 PBS 심장 박동을 기록할 수 있습니다. 반쯤 손상되지 않은 성인 초파리 심장은 산소가 공급된 신선한 인공 혈림프에서 유지될 때 해부 후 몇 시간 동안 리드미컬하게 박동합니다.

대표적인 예가 여기에 나타나 있으며, 여기에 표시된 별 유충의 3번째 하트에서 한 개의 심장이 있으며, 엘로 후 1-3주 후에 일반적으로 1-3주 사이의 비율로 규칙적인 심장 박동을 보이는 어린 파리는 일반적으로 3주 이상의 파리는 일반적으로 더 부정맥이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 심장은 산소가 공급된 인공 혈림프 심장에서 여전히 몇 시간 동안 자발적으로 박동할 수 있으며, 박리 절차로 인해 손상된 성충 파리는 일반적으로 이완할 수 없고 종종 통제할 수 없는 극도의 수축 부위를 보여줍니다. 1 헤르츠보다 느린 심장 박동은 생후 3주 미만의 파리에서 거의 관찰되지 않습니다.

결과적으로, 이러한 제제는 손상된 것으로 간주되어 폐기됩니다. 우리는 광학 이미징을 위해 레벨 및 성인 초파리 심장을 준비하는 방법을 시연했습니다. 반쯤 손상되지 않은 제제를 만들 때 심장 자체를 만지지 마십시오.

그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.