September 9th, 2009
Nicotiana benthamiana 공장에서 PTI에 대한 세포 죽음 기반 분석을 설명합니다.
안녕하세요, 저는 Voice Thompson Institute for Plant Research의 Greg Martin 연구실에서 근무하는 Suma TI입니다. 오늘 우리는 PAM 유발 면역 또는 PTI에 대한 세포 사멸 기반 분석 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 PTI에 유전자가 관여하는지 확인합니다.
시작하겠습니다. 생후 약 7주가 될 때까지 Nicotiana ANA를 성장시키는 것으로 절차를 시작하십시오. 시작하기 4-5일 전.
PAM은 면역 또는 PTI 분석을 트리거했습니다. 식물을 다듬어 모든 겨드랑이 가지와 꽃을 제거합니다. 겨드랑이 가지가 자라자마자 제거해 보면 식물을 더 쉽게 관리할 수 있습니다.
식물을 준비한 후 박테리아를 성장시킵니다. 이 절차는 챌린지 박테리아에 대한 두 번째 접종 전에 식물 면역을 유도하기 위해 비병원성 박테리아를 사용하여 분석에 사용된 모든 박테리아의 성장을 시작합니다. 동시에 각 슈도모나스 박테리아 줄기에 슈도모나스 박테리아의 냉동 글리세롤 줄기를 사용하십시오.
적절한 항생제가 함유된 A KBM 플레이트의 중앙에 소량의 박테리아를 펴고 플레이트를 섭씨 30도에서 약 18-24시간 동안 배양합니다. 아그로박테리움의 경우 미리 준비된 새 플레이트를 사용하여 2ml의 lb에서 액체 배양을 시작합니다. 섭씨 30도에서 밤새 자라며 다음 날 흔들어 자랍니다.
150-200 마이크로리터의 액체 KBM을 슈도모나스 박테리아의 플레이트에 추가합니다. 박테리아를 접시 전체에 퍼뜨립니다. 멸균 인사를 사용합니다.
플레이트를 인큐베이터에 다시 20-24시간 더 넣습니다. 4개의 아그로박테리움. 20 마이크로몰 아세톤을 함유한 약 5-10밀리리터의 LB에서 2차 배양을 시작합니다.
쉐이킹과 함께 섭씨 30도에서 하룻밤 사이에 문화를 성장시킵니다. 박테리아를 준비한 후 PTI 분석을 수행하기 전날 분석을 위해 식물을 준비합니다. 박테리아를 준비한 후 식물을 약 35-40%의 상대 습도와 일정한 빛이 있는 섭씨 22-24도의 방으로 옮깁니다.
다음으로, 두꺼운 검은색 마커를 사용하여 잎에 원을 표시합니다. 잘 확장된 잎을 선택하고 오래된 잎이나 만졌을 때 거칠거나 두꺼운 잎은 피하십시오. 잎의 아래쪽 부분을 표시하지 마십시오.
원의 지름은 최소 1.5cm이며 잎 당 2-4 개의 원을 표시 할 수 있습니다. 원은 간격이 잘 유지되어야 하며 큰 정맥을 가로지르지 않는 것이 좋습니다. PTI 유도에 사용되는 박테리아를 채취하여 PTI 분석을 시작합니다.
사용 된 슈도 모나스 종은 좋은 성장을 나타내는 박테리아 잔디를 형성해야합니다. 멸균 된 긴 나무 막대기로 긁어 내서 접시에서 수확하고 10 밀리 몰 중 약 20-25 밀리리터에 다시 현탁시킵니다. agrobacterium 원심 분리기를 위한 염화 마그네슘 해결책.
세포를 채취하여 배양액을 약 20 내지 25 밀리리터의 10 밀리몰 염화마그네슘과 10 밀리몰로 현탁시킨다. MES pH 5.6, 원심분리를 반복하고 다시 약 20-25밀리리터의 염화마그네슘과 MES 용액을 현탁합니다. 이제 유도 슈도모나스(pseudomonas)와 아그로박테리움(agrobacterium) 박테리아가 다시 부유합니다.
600나노미터의 파장에서 세 가지 배양 모두의 광학 밀도를 측정합니다. 세포를 슈도모나스(pseudomonas)에 대한 염화마그네슘(magnesium chloride)과 아그로박테리움(agrobacterium)에 대한 MES와 염화마그네슘으로 희석하여 ODS를 조정합니다. 최종 필수 OD 값은 함께 제공되는 서면 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.
총 25ml의 박테리아 배양량은 약 40-50개의 지점을 접종하기에 충분합니다. 이제 바늘이 없는 1ml 주사기를 사용하여 PTI 유도체를 잎에 미리 표시된 원에 침투시켜 분석을 시작합니다. 식물이 침투한 순서와 유도 후 침투가 시작된 정확한 시간을 기록하십시오.
유도 접종 후 몇 시간 후에 챌린지 접종을 진행합니다. 유도 슈도모나스 균주에 대해 이전에 보여준 바와 같이 챌린지 접종에 필요한 박테리아 균주를 수확합니다. 다시 말하지만, OD를 측정하고 수반되는 GR 프로토콜에 따라 배양물의 농도를 조정합니다.
챌린지 접종은 유도제 침투 7시간 후부터 시작합니다. 다음 인듀서 챌린저 조합을 사용하십시오. 첫 번째 접종 서클의 주변에 있는 점을 두 번째 접종 서클의 중심으로 선택합니다.
인덕션과 동일한 식물의 순서로 챌린지 침투를 수행합니다. 잎에 여러 반점이 있는 경우 침투가 겹치지 않도록 하십시오. 마지막으로, 적절한 항생제를 함유한 KBM 또는 LB 플레이트의 분석에 사용된 모든 배양물의 플레이트 연속 희석.
챌린지 접종 2일 후, 유도 접종 및 챌린지 접종 2일 후 PTI 반응을 평가하기 시작할 수 있으며, PST DC 3000 세포 사멸로 도전받은 부위에서 효과기에 의한 면역 또는 ETI로 인한 세포 사멸의 출현을 찾습니다. 겹치는 침투 영역 내에서 세포 사멸은 PTI의 붕괴를 나타내며 유도 및 챌린지 후 4-5일 후에 양성 표현형으로 점수를 매겨야 합니다. 접종은 DC 3000 hop Q1 돌연변이 또는 PS가 다시 높아지면서 문제가 된 반점에서 질병으로 인한 세포 사멸의 모습을 찾습니다. 중첩 침투 영역에서 질병으로 인한 세포 사멸로 표시되는 PTI의 분해를 찾습니다. PTI에 감염되지 않은 식물이 침투의 중첩 영역에서 세포 사멸을 보이기 시작할 때까지 식물을 계속 관찰하십시오.
FLS 2에 대해 침묵된 식물은 PFDC 조합으로 접종한 후 2일 후에 PTI에 대해 손상됩니다. 겹치는 영역에서 세포 사멸이 보이며, 이는 어떤 유전자에 대해서도 침묵하지 않은 PTI 제어 식물의 붕괴를 나타냅니다. 또한 PFDC 조합으로 접종하고 분석을 실시한 지 2일 후에 세포 사멸이 정상적인 PTI 반응으로 인해 겹치는 영역 외부에서는 보이지만 내부에서는 보이지 않기 때문에
검사했습니다.이 절차를 수행하는 동안 바지 유발 면역 또는 PTI에 대한 세포 사멸 기반 분석을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 우리가 권장하는 환경 조건에서 식물을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 습도 수준이 높으면 식물에 부정적인 영향을 미치고 분석이 더 빨리 진행됩니다.
그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
이 기사는 Nicotiana benthamiana 식물에서 PAM 유도 면역(PTI)에 대한 세포사멸 기반 분석을 설명합니다. 이 절차는 식물과 박테리아의 준비를 포함하며, 이어서 PTI 반응을 평가하기 위한 일련의 접종이 이어집니다.
This assay enables mechanistic de-risking of plant immune pathways by quantitatively linking PAMP recognition to downstream defense outputs. It supports target validation in agrochemical discovery by providing a reproducible readout for compounds that modulate PTI. The method enhances predictive confidence in early-stage screening for molecules that enhance or suppress plant immunity.
The assay fits within the discovery continuum from target engagement (PAMP-PRR binding) to functional validation (immune output) and phenotypic screening (compound library screening for immunomodulators).