Name: 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMP) 트리거된 식물의 내성 (PTI)에 대한 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 학습하세요 Nicotiana benthamiana에서 세포 사멸 기반 분석을 이용한 PAMP 유발 면역(PTI) 평가 방법을. 이 기법은 식물 면역 반응과 유전자 기능 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는 귀중한 토론 이완 - 숙 아, 조앤 모렐로와 앨런 Collmer, 식물 병리학과 식물 - 미생물의 생물학학과, 코넬 대학, 감사합니다. 우리는이 기사에 대한 의견을 제시 Munkvold 감사합니다. 기금은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 식물 게놈 프로그램에 의해 제공되었다, 보너스 번호 DBI - 0605059 (GBM).

1 부 : 식물의 성장 및 유지 보수 분석에 사용된 Nicotiana benthamiana 공장 약 7 주 된해야합니다. 그들은 모두 겨드랑 지점과 꽃을 제거하기 전에 분석 최소한 4~5일 손질하여야한다. 그것은 그들이 등장 후 식물보다 관리하기 위해 곧 겨드랑 지점을 제거하는 것이 좋습니다. 2 부 : 세균 문화 DAY 1 : <ol><li> 분석에 사용된 모든 변종에 대해 번호판이나 문화가 동시에 시작됩니다. 모나스 종하십시오. 이는 냉동 글리세롤 주식 (표 2)에서 적절한 항생제를 포함하는 KBM 접시에 2 inducers 3 도전 변종, 리크 박테리아를 포함합니다. 박테리아의 소량은 접시의 중앙에 전파해야합니다. 약 18~24시간 30 ° C에서 번호판을 품어. , 30 Agrobacterium 들어, 신선한 플레이트에서 2 ML의 LB에서 액체 문화를 시작하고 250 rpm으로 하룻밤 사이에 성장 ° C. </li></ol> DAY 2 : <ol start="2"><li> 모나스 들어, 박테리아 액체 KBM의 150-200 μl를 추가하고 멸균 유리 확장기를 사용하여 전체 판을 통해 그들을 확산. 다시 인큐베이터에있는 접시를 넣어 다른 20~24시간에 대한 성장하자. 좋은 성장을 나타내는 접시 다음날에 세균 잔디가 있어야합니다. Agrobacterium의 경우, 20 μm의의 acetosyringone로 약 50-10 ML의 LB에서 보조 문화를 시작하고 그것이 250 RPM, 30 하루 20 시간을 기르 ° C. </li></ol> 파트 3 : 분석을위한 준비 식물 DAY 2 : <ol><li> 분석 하루 전에는 식물이 22-24에서 객실로 이동해야 ° C ~ 35~40% RH 지속적인 조명. </li><li> 두꺼운 검은색 마커를 사용하여 직경이 최소 1.5 cm 아르 나뭇잎에 동그라미를 표시합니다. 두 시간 내지 네 동그라미는 잎 당 표시하실 수 있습니다. 동그라미가 잘 간격하고 선호 큰 정맥을 통과해서는 안됩니다. 잘 확장 나뭇잎을 선택합니다. 이전 나뭇잎이나 거친하거나 만지지 두꺼운 있으며 잎의 하단 부분에 동그라미를 표시하지 않도록 나뭇잎을 피하십시오. </li></ol> 마킹 원을 전에 실험에 하루 프로토콜에 필수되지 않습니다. 그러나, 그것은 assayed되는 식물의 큰 숫자가있다면 시간을 절약할 수 있으며, 쉽게 PTI의 유도 도전 예방 접종 사이의 정확한 타이밍을 달성할 수 있습니다. 4 부 : PTI의 유도 3 일 : <ol><li> P. fluorescens와 P. 10 MM MgCl 2 접시에서 세포를 수확 putida. Agrobacterium 들어, 세포를 수집하는 문화를 원심과 10mM MgCl 2 + 10 MM MES 산도 5.6에서 resuspend. MgCl 2 MES 솔루션의 원심 분리와 resuspend를 반복합니다. 600 NM에있는 세포의 광학 밀도 (OD)를 측정합니다. 최종 필요한 값을 표 2에서 설명한대로. 모나스가 드디어 10 MM에 MgCl 2 Agrobacterium을 resuspended되어야 MgCl 2 - MES 솔루션 ODS를 조정합니다. 25 ML의 총 부피는 약 40-50 반점을 예방하기 위해 충분하다. </li><li> 1 ML needleless 주사기를 사용하여 나뭇잎에 미리 표시된 원을에 PTI의 inducers을 침투. 식물이 침투 순서와 침투가 시작되었다 정확한 시간을 적어 두십시오. </li></ol> 제 5 부 : 도전 접종 <ol><li> P. 준비 syringae PV. 토마토 DC3000, 일부 4.1 및 표 2에서 설명한대로 도전 PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 PS PV. tabaci. </li><li> 유도가 끝났다고으로 7 시간 유도의 침투 후 식물의 순서에 도전 침투를 수행합니다. 일반적으로, 첫 번째 접종 원의 주변에있는 요점은 두 번째 접종 원의 중심으로 사용할 수 있습니다. 나뭇잎의 여러 장소가있다면 다음 infiltrations가 중복되지 않도록 확인하십시오. </li><li> 정확한 CFU 번호를 확인하기 위해 적절한 항생제를 포함 KBM 또는 LB 접시에 분석에 사용된 모든 문화의 접시 시리얼 dilutions. </li></ol> 6 부 : PTI의 붕괴에 대한 점수 제 5 일 : <ol><li> PST DC3000 맡고 있던 장소에 따라 ETI에 세포 죽음의 모습을 찾아보십시오. 침투의 중복 영역 내부의 세포 죽음은 PTI의 고장을 나타내는 긍정적인 표현형으로 득점한다. </li></ol> 일 7 : <ol start="2"><li> PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 또는 PS PV 맡고 있던 장소에 의한 질병에 세포 죽음의 모습을 찾아보십시오. tabaci가 </em&gt;. 일부로 6.1에 설명된 같은 방식으로 긍정적인 표현형에 대한 점수. </li></ol> 컨트롤 식물 (PTI에 대한 타협해서는 안된다는)이 침투의 중복 영역에서 세포 죽음을 표시하기 시작하면, 더 이상 관찰하고 중지합니다. 7 부 : 대표 결과 그림 1은 분석 P.의 결과를 보여줍니다 fluorescens는 과제로 유도 및 PST의 DC3000로 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" /> 그림 1. P. fluorescens는 N.에 침투했다 benthamiana 나뭇잎 (블랙 서클)은 PTI를 유도하기 위해 7 시간 후에, 그 자리가 태평양 표준시 DC3000 (흰색 동그라미)와 함께 도전을했습니다. FLS2 위해 입을 식물 P. 지역의 PTI의 세부를 보여주 fluorescens는 세포 죽음으로 볼로, (A)에 침투했다. 침묵되지 않은 컨트롤 식물 PTI (B)의 유도에 의한 중복되는 지역에 세포 죽음을 보여주 없습니다. 빨간색 화살표가 부족하거나 침투의 중복 영역에서 세포 죽음의 존재를 나타냅니다. 사진은 2 일 infiltrations 후에 찍은. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> PTI의 유도 </td><td> 세포 죽음 - 도출 도전 </td><td> 세포 사망의 자연 </td><td> 암호 </td></tr><tr><td> 모나스 fluorescens 55 </td><td> 모나스 syringae PV 토마토 (PST). DC3000 6 </td><td> ETI </td><td> PF / DC </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> PST DC3000 </td><td> ETI </td><td> PP / DC </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 6 </td><td> 질병 </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> P. syringae PV. tabaci 11528R </td><td> 질병 </td><td> 농업 / Ptab </td></tr></tbody></table> 표 1 : PTI의 유도 및 세포의 조합 죽는 도출 PTI에 대한 세포 죽음의 분석에 사용되는 미생물. <table border="1"><tbody><tr><td> 박테리아 스트레인 </td><td> 선택 매체 </td><td> 최종 OD 실험에 사용 </td><td> 해당 CFU / ML </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> KBM 암피실린 (100 UG / ML) </td><td> 0.5 </td><td> 1 X 10 9 </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> KBM 암피실린 (100 UG / ML) </td><td> 0.5 </td><td> 1 X 10 8 </td></tr><tr><td> A. tumefaciens GV2260 </td><td> LB Rifampicin (100 UG / ML) </td><td> 0.5 </td><td> 5 X 10 8 </td></tr><tr><td> PST DC3000 </td><td> KBM Rifampicin (100 UG / ML) </td><td> 0.02 </td><td> 2 X 10 7 </td></tr><tr><td> PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 </td><td> KBM Rifampicin (100 UG / ML) </td><td> 0.1 100 배 희석 </td><td> 1 X 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae PV. tabaci 11528R </td><td> KBM Rifampicin (100 UG / ML) </td><td> 0.1 100 배 희석 </td><td> 1 X 10 6 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 문화 조건과 분석에 사용되는 inoculum 수준. OD와 해당 CFU 수준 spectrophotometers 서로 다른 브랜드 간의 차이가있을 수 있습니다.

<ol><li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li>
<li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li>
<li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li>
<li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li>
</ol>

세포 죽음을 기반 분석은 PTI에있는 유전자의 참여를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 관심있는 유전자에 대한 손실 기능 돌연변이 분석을 사용하여 테스트하실 수 있습니다. 유도와 표 1에서 주어진 도전 예방 접종의 4 조합의 출력, 그것은 하나의 조합이 당신의 식물을 배경으로 표현형을 초래할 수도 있습니다. 우리는 FLS2에 대한 침묵 식물 PF / DC 및 유도 도전 예방 접종 (표 1) Pf/Q1-1 조합 PTI의 세부를 표시 것을 관찰했습니다. 그것은 분석을위한 환경 조건의 일부로 3.1에 ​​설명된 것과 가능한 한 가까운 것을 중요합니다. 낮은 습도는 점수에 대한 분석이 어렵게 너무 빨리 진행하기 위해 세포를 파괴됩니다. 우리 프로토콜에서 설명한 조건이 연구실에 작동하지 않는 경우, 유도 또는 도전의 접종 수준을 변경하십시오. 우리가 짧은 시간 간격은 분석이 통제 공장에서 너무 빨리 무너뜨리는 원인 것으로 나타났습니다하지만 수정할 수 있습니다 또 다른 매개 변수는 유도와 도전 사이의 시간 간격입니다. 우리는 적어도 4-5 식물 실험에 테스트하고 긍정적인 표현형 적어도 3-4 독립적인 실험으로 반복되어야하는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>1M stock으로 조제하여 pH를 조절하고 여과 멸균한다. 실온에서 보관한다.</td></tr><tr><td>Life Science UV/Vis 분광광도계</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

병원체 - 관련 분자 패턴 (pamp) 트리거된 식물의 내성 (pti)에 대한 분석

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

자신의 환경에서 잠재적인 병원체를 인식하기 위해, 식물은 패턴 인식 수용체 (PRRs)가 자신의 플라즈마 점막에있는 사용합니다. PRRs는 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs)라는 미생물 보존 기능을 인식하고이 감지 효과적으로 비 병원균의 1,2에 의해 식물 조직의 식민을 방지 PAMP - 트리거 면역 (PTI)에 연결됩니다. PTI에서 가장 잘 연구 시스템 FLS2 - 의존 경로 3입니다. FLS2은 박테리아 flagellin의 구성 요소입니다 PAMP flg22를 인식합니다. 성공적인 병원균은 독성 요인이나 PTI을 억제하고 병원균이 질병 1가 발생할 수 있습니다 effectors을 보유하고 있습니다. 차례로 일부 식물 effectors 또는 효과기 - 트리거 면역 (ETI) 2 리드 그들의 활동을 감지 저항 유전자를 보유하고 있습니다. 우리는 아와 Collmer 4 수정 PTI에 대한 세포 사망 기반의 분석을 설명합니다. 분석은 N.의 표준되었습니다 식물 병원체 상호 작용 5 연구의 모델 시스템으로 점차 사용되고 있습니다 benthamiana. PTI는 나뭇잎으로 비 병원성 박테리아 스트레인의 침투에 의해 유발됩니다. 세븐 시간 후에, 그 박테리아 변종도 질병의 원인이나 어느 ETI 원래 침투 영역을 중복 영역으로 가득 활성화됩니다. 최초의 침투에 의해 유도된 PTI는 두 번째 도전 침투에 의한 세포 사망의 모양을 지연 또는 방지하기 위해 수 있습니다. 반대로, 접종의 중복 영역에서 세포 죽음의 모습은 PTI의 고장을 나타냅니다. PTI 도전 예방 접종 inducers의 네 가지 조합 (표 1) 표준화되었습니다. 분석이 아닌 침묵 N.에서 테스트되었습니다 제어 및 PTI를 개발하는 능력에 손상 될 것으로 예측되었다 FLS2에 대한 입막음을 식물로 재직 benthamiana 식물.

Nicotiana benthamiana 공장에서 PTI에 대한 세포 죽음 기반 분석을 설명합니다.

병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMP) 트리거된 식물의 내성 (PTI)에 대한 분석

식물은 환경 내의 잠재적 병원균을 인식하기 위해 세포막에 존재하는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRRs)를 이용합니다. PRR은 ...

안녕하세요, 저는 Voice Thompson 식물 연구소의 Greg Martin 실험실 소속 Suma TI입니다. 오늘은 PAM 유도 면역(PTI)에 대한 세포 사멸 기반 분석법 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 특정 유전자가 PTI에 관여하는지 확인하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. 실험 시작 4~5일 전부터 Nicotiana ANA를 약 7주령이 될 때까지 배양하여 절차를 시작하십시오.PAM 유도 면역 또는 PTI 분석법. 식물의 모든 곁가지와 꽃을 제거하여 다듬습니다. 식물을 더 관리하기 쉽게 만들기 위해 곁가지가 나타난 직후에 제거하십시오.식물 준비가 완료되면 박테리아 배양을 진행합니다. 이 절차에서는 challenge 박테리아를 사용하여 2차 접종을 하기 전, 식물 면역을 유도하기 위해 비병원성 박테리아를 사용하므로 분석에 사용되는 모든 박테리아의 배양을 시작합니다. 동시에, 각 pseudomonas 박테리아 스톡에 대해 동결된 glycerol 스톡을 사용하십시오.적절한 항생제가 포함된 KBM 배지 중앙에 소량의 박테리아를 도말하고, 30°C에서 약 18~24시간 동안 배양합니다. 아그로박테리움(agrobacterium)의 경우, 이전에 준비한 신선한 배지를 사용하여 2 mL의 LB 배지에서 액체 배양을 시작합니다. 30°C에서 흔들어 주며 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 사용합니다.슈도모나스(pseudomonas) 박테리아가 담긴 플레이트에 액체 KBM 150 내지 200 µL를 첨가합니다. 멸균된 spreader를 사용하여 박테리아를 플레이트 전체에 고르게 도포합니다.플레이트를 인큐베이터에 넣고 20~24시간 동안 더 배양합니다. 아그로박테리움(agrobacterium)의 2차 배양을 위해 20 $\mu$M 아세톤이 포함된 LB 배지 5~10 mL를 사용합니다.배양액을 30°C에서 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 박테리아 준비가 완료되면, PTI 분석을 수행하기 전날에 분석용 식물을 준비합니다. 박테리아 준비 후, 식물을 상대 습도 약 35~40%, 항시 조명이 유지되는 22~24°C의 방으로 옮깁니다.다음으로, 굵은 검은색 마커를 사용하여 잎에 원을 표시합니다. 충분히 확장된 잎을 선택하고, 오래된 잎이나 만졌을 때 단단하거나 두꺼운 잎은 피하십시오. 잎의 하단 부분에는 표시하지 마십시오.원형의 크기는 지름이 최소 1.5 cm여야 하며, 잎 하나당 2~4개의 원을 표시할 수 있습니다. 원들은 서로 충분한 간격을 두어야 하며, 가급적 큰 잎맥을 가로지르지 않도록 합니다. PTI 유도에 사용된 박테리아를 수확함으로써 PTI 분석을 시작합니다.사용되는 pseudomonas 종은 양호한 성장을 나타내는 세균 층(bacterial lawn)을 형성해야 합니다. 멸균된 긴 나무 스틱으로 긁어내어 플레이트에서 수확한 후, agrobacterium 원심분리를 위해 약 20에서 25 milliliters의 10 millimolar 염화마그네슘 용액에 재현탁하십시오.세포를 수집하기 위해 배양액을 원심 분리한 후, 10 mM 염화마그네슘과 10 mM MES(pH 5.6) 혼합액 약 20~25 mL에 다시 현탁합니다. 원심 분리 과정을 반복하고, 다시 염화마그네슘 및 MES 용액 약 20~25 mL에 현탁합니다. 이제 유도용 Pseudomonas 및 Agrobacterium 박테리아의 현탁이 완료되었습니다.600 nm 파장에서 세 가지 배양액 모두의 광학 밀도를 측정하십시오. pseudomonas의 경우 염화마그네슘으로, agrobacterium의 경우 MES와 염화마그네슘 혼합액으로 세포를 희석하여 OD 값을 조정하십시오. 최종 요구 OD 값은 함께 제공된 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.총 25 밀리리터의 박테리아 배양액이면 약 40~50개의 지점에 접종하기에 충분합니다. 이제 바늘이 없는 1 밀리리터 주사기를 사용하여 잎의 미리 표시된 원 안에 PTI 유도제를 침투시켜 분석을 시작하십시오. 식물에 침투시킨 순서와 유도 후 침투를 시작한 정확한 시간을 기록하십시오.유도 접종 후 몇 시간이 지난 뒤에 공격 접종을 진행합니다. 유도 슈도모나스 균주에 대해 앞서 설명한 것과 동일한 방법으로 공격 접종에 필요한 박테리아 균주를 수확합니다. 다시 OD를 측정하고, 함께 제공된 GR 프로토콜에 따라 배양액의 농도를 조절합니다.유도제 침투 7시간 후에 챌린지 접종을 시작하십시오. 다음의 유도제-챌린저 조합을 사용하십시오. 첫 번째 접종 원의 주변부의 한 점을 두 번째 접종 원의 중심으로 선택하십시오.유도 단계와 동일한 식물 순서대로 챌린지 침투를 수행하십시오. 잎 하나에 여러 지점이 있는 경우, 침투 부위가 서로 겹치지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 분석에 사용된 모든 배양액을 단계별로 희석하여 적절한 항생제가 포함된 KBM 또는 LB 플레이트에 도말하십시오.챌린지 접종 2일 후부터 PTI 반응을 평가하기 시작할 수 있습니다. 유도 및 챌린지 접종 2일 후에 PST DC 3000을 챌린지 접종한 부위에서 이펙터 유발 면역(ETI)으로 인한 세포 사멸이 나타나는지 확인하십시오. 침투 영역의 중첩 부위 내에서 세포 사멸이 발생한 것은 PTI의 붕괴를 나타내며, 이를 양성 표현형으로 기록해야 합니다. 유도 및 챌린지 접종 4~5일 후에 DC 3000 hop Q1 돌연변이체 또는 PS back high를 챌린지 접종한 부위에서 질병으로 인한 세포 사멸이 나타나는지 확인하십시오. 마찬가지로 침투 중첩 부위에서 질병으로 인한 세포 사멸로 나타나는 PTI의 붕괴 여부를 확인하십시오. PTI가 손상되지 않은 식물들이 침투 중첩 부위에서 세포 사멸을 보이기 시작할 때까지 식물 관찰을 계속하십시오.FLS 2가 억제된 식물은 PFDC 조합을 접종한 지 2일 후에 PTI 기능이 저하됩니다. 중첩된 영역에서 세포 사멸이 관찰되는데, 이는 어떤 유전자도 억제되지 않은 PTI 대조군 식물의 제어 능력이 무너졌음을 나타냅니다. 대조군 식물 또한 PFDC 조합을 접종하였으며, 분석 수행 2일 후 검사한 결과, 정상적인 PTI 반응으로 인해 중첩 영역 외부에서는 세포 사멸이 관찰되었으나 내부에서는 관찰되지 않았습니다.지금까지 본 절차를 통해 PAMP 유도 면역(PTI)에 기반한 세포 사멸 분석법을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 과정에서 권장하는 환경 조건으로 식물을 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 습도가 높아지면 식물에 부정적인 영향을 미쳐 분석 과정이 더 빠르게 진행될 수 있습니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 사는 박테리아에 stomatal 응답을 액세스하는 간단하고 재현성 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 표피 껍질의 사용에 비해 잎사귀의 입힐 수있는 총알과 조작​​은 이전에 보고된 최소화합니다.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

이 논문은 면역 점구체에 노출 된 후 애기장대에서 방어 반응을 정량화하는 두 가지 방법, 즉 일시적인 산화 파열 및 모종 성장 억제에 대해 설명합니다.

애기장대에서 패턴 트리거 산화 버스트와 모종 성장 억제 어세

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

모종 홍수 분석은 슈도모나스 주사기 박테리아에 대한 저항성을 위한 야생 토마토 접근물의 신속한 스크리닝을 용이하게 한다. 이 분석법은, 모종 세균 성장 분석과 함께, 박테리아에 대한 근본적인 저항성을 더욱 특성화하는 데 도움을 줄 수 있으며, 저항의 유전적 기초를 결정하기 위해 매핑 인구를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

여기에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 박테리아 침입에 대한 기공 반응을 직접 관찰하고 자동으로 측정하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 휴대용 기공 영상 장치와 장치에서 캡처한 잎 이미지를 위해 설계된 이미지 분석 파이프라인을 활용합니다.

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

이 프로토콜은 동일 시료 내에서 식물 이온 누출, 과산화효소 활성, 칼로스 생성을 평가하는 고처리량 접근법을 설명합니다.

고처리량 형식을 이용한 미생물 2차 대사산물에 대한 잎 반응 평가

학습하세요 Nicotiana benthamiana에서 세포 사멸 기반 분석을 이용한 PAMP 유발 면역(PTI) 평가 방법을. 이 기법은 식물 면역 반응과 유전자 기능 연구에 필수적인 도구입니다.

병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMP) 트리거된 식물의 내성 (PTI)에 대한 분석

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