병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMP) 트리거된 식물의 내성 (PTI)에 대한 분석

안녕하세요, 저는 Voice Thompson 식물 연구소의 Greg Martin 실험실 소속 Suma TI입니다. 오늘은 PAM 유도 면역(PTI)에 대한 세포 사멸 기반 분석법 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 특정 유전자가 PTI에 관여하는지 확인하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 실험 시작 4~5일 전부터 Nicotiana ANA를 약 7주령이 될 때까지 배양하여 절차를 시작하십시오.

PAM 유도 면역 또는 PTI 분석법. 식물의 모든 곁가지와 꽃을 제거하여 다듬습니다. 식물을 더 관리하기 쉽게 만들기 위해 곁가지가 나타난 직후에 제거하십시오.

식물 준비가 완료되면 박테리아 배양을 진행합니다. 이 절차에서는 challenge 박테리아를 사용하여 2차 접종을 하기 전, 식물 면역을 유도하기 위해 비병원성 박테리아를 사용하므로 분석에 사용되는 모든 박테리아의 배양을 시작합니다. 동시에, 각 pseudomonas 박테리아 스톡에 대해 동결된 glycerol 스톡을 사용하십시오.

적절한 항생제가 포함된 KBM 배지 중앙에 소량의 박테리아를 도말하고, 30°C에서 약 18~24시간 동안 배양합니다. 아그로박테리움(agrobacterium)의 경우, 이전에 준비한 신선한 배지를 사용하여 2 mL의 LB 배지에서 액체 배양을 시작합니다. 30°C에서 흔들어 주며 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 사용합니다.

슈도모나스(pseudomonas) 박테리아가 담긴 플레이트에 액체 KBM 150 내지 200 µL를 첨가합니다. 멸균된 spreader를 사용하여 박테리아를 플레이트 전체에 고르게 도포합니다.

플레이트를 인큐베이터에 넣고 20~24시간 동안 더 배양합니다. 아그로박테리움(agrobacterium)의 2차 배양을 위해 20 $\mu$M 아세톤이 포함된 LB 배지 5~10 mL를 사용합니다.

배양액을 30°C에서 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 박테리아 준비가 완료되면, PTI 분석을 수행하기 전날에 분석용 식물을 준비합니다. 박테리아 준비 후, 식물을 상대 습도 약 35~40%, 항시 조명이 유지되는 22~24°C의 방으로 옮깁니다.

다음으로, 굵은 검은색 마커를 사용하여 잎에 원을 표시합니다. 충분히 확장된 잎을 선택하고, 오래된 잎이나 만졌을 때 단단하거나 두꺼운 잎은 피하십시오. 잎의 하단 부분에는 표시하지 마십시오.

원형의 크기는 지름이 최소 1.5 cm여야 하며, 잎 하나당 2~4개의 원을 표시할 수 있습니다. 원들은 서로 충분한 간격을 두어야 하며, 가급적 큰 잎맥을 가로지르지 않도록 합니다. PTI 유도에 사용된 박테리아를 수확함으로써 PTI 분석을 시작합니다.

사용되는 pseudomonas 종은 양호한 성장을 나타내는 세균 층(bacterial lawn)을 형성해야 합니다. 멸균된 긴 나무 스틱으로 긁어내어 플레이트에서 수확한 후, agrobacterium 원심분리를 위해 약 20에서 25 milliliters의 10 millimolar 염화마그네슘 용액에 재현탁하십시오.

세포를 수집하기 위해 배양액을 원심 분리한 후, 10 mM 염화마그네슘과 10 mM MES(pH 5.6) 혼합액 약 20~25 mL에 다시 현탁합니다. 원심 분리 과정을 반복하고, 다시 염화마그네슘 및 MES 용액 약 20~25 mL에 현탁합니다. 이제 유도용 Pseudomonas 및 Agrobacterium 박테리아의 현탁이 완료되었습니다.

600 nm 파장에서 세 가지 배양액 모두의 광학 밀도를 측정하십시오. pseudomonas의 경우 염화마그네슘으로, agrobacterium의 경우 MES와 염화마그네슘 혼합액으로 세포를 희석하여 OD 값을 조정하십시오. 최종 요구 OD 값은 함께 제공된 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.

총 25 밀리리터의 박테리아 배양액이면 약 40~50개의 지점에 접종하기에 충분합니다. 이제 바늘이 없는 1 밀리리터 주사기를 사용하여 잎의 미리 표시된 원 안에 PTI 유도제를 침투시켜 분석을 시작하십시오. 식물에 침투시킨 순서와 유도 후 침투를 시작한 정확한 시간을 기록하십시오.

유도 접종 후 몇 시간이 지난 뒤에 공격 접종을 진행합니다. 유도 슈도모나스 균주에 대해 앞서 설명한 것과 동일한 방법으로 공격 접종에 필요한 박테리아 균주를 수확합니다. 다시 OD를 측정하고, 함께 제공된 GR 프로토콜에 따라 배양액의 농도를 조절합니다.

유도제 침투 7시간 후에 챌린지 접종을 시작하십시오. 다음의 유도제-챌린저 조합을 사용하십시오. 첫 번째 접종 원의 주변부의 한 점을 두 번째 접종 원의 중심으로 선택하십시오.

유도 단계와 동일한 식물 순서대로 챌린지 침투를 수행하십시오. 잎 하나에 여러 지점이 있는 경우, 침투 부위가 서로 겹치지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 분석에 사용된 모든 배양액을 단계별로 희석하여 적절한 항생제가 포함된 KBM 또는 LB 플레이트에 도말하십시오.

챌린지 접종 2일 후부터 PTI 반응을 평가하기 시작할 수 있습니다. 유도 및 챌린지 접종 2일 후에 PST DC 3000을 챌린지 접종한 부위에서 이펙터 유발 면역(ETI)으로 인한 세포 사멸이 나타나는지 확인하십시오. 침투 영역의 중첩 부위 내에서 세포 사멸이 발생한 것은 PTI의 붕괴를 나타내며, 이를 양성 표현형으로 기록해야 합니다. 유도 및 챌린지 접종 4~5일 후에 DC 3000 hop Q1 돌연변이체 또는 PS back high를 챌린지 접종한 부위에서 질병으로 인한 세포 사멸이 나타나는지 확인하십시오. 마찬가지로 침투 중첩 부위에서 질병으로 인한 세포 사멸로 나타나는 PTI의 붕괴 여부를 확인하십시오. PTI가 손상되지 않은 식물들이 침투 중첩 부위에서 세포 사멸을 보이기 시작할 때까지 식물 관찰을 계속하십시오.

FLS 2가 억제된 식물은 PFDC 조합을 접종한 지 2일 후에 PTI 기능이 저하됩니다. 중첩된 영역에서 세포 사멸이 관찰되는데, 이는 어떤 유전자도 억제되지 않은 PTI 대조군 식물의 제어 능력이 무너졌음을 나타냅니다. 대조군 식물 또한 PFDC 조합을 접종하였으며, 분석 수행 2일 후 검사한 결과, 정상적인 PTI 반응으로 인해 중첩 영역 외부에서는 세포 사멸이 관찰되었으나 내부에서는 관찰되지 않았습니다.

지금까지 본 절차를 통해 PAMP 유도 면역(PTI)에 기반한 세포 사멸 분석법을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 과정에서 권장하는 환경 조건으로 식물을 유지하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 습도가 높아지면 식물에 부정적인 영향을 미쳐 분석 과정이 더 빠르게 진행될 수 있습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.