Name: 지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: 학습하세요 정량적 인산화 단백질체학 방법으로 Saccharomyces cerevisiae의 세포 신호 전달 메커니즘을 연구하세요. 이 기법은 질량 분석을 통해 인산화 펩타이드를 정량 분석하여 신경과학 및 단백질체학 연구에 활용됩니다.

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우리는 질량 분석계 분석과 도움이 토론과 기술 지원 박사 서식 로저스 감사하고, DRS 것입니다. 롭 모리츠, 제프 Ranish, 그리고 도움이 토론에 대한 하미드 Mirzai. 이 작품은 우수의 NIH 센터 추진하는 사업.

세포 성장 및 미디어 <ol><li> 최소한의 효모 매체의 두 1리터 문화 (질산 황산이나 아미노산없이 0.17 %의 효모 질소베이스, 0.5 % 질산 황산)에 1.0 다음의 씨앗 OD 600-100 ML 리치 미디어에서 밤새 BY4742Δarg4Δlys1 세포의 단일 콜로니를 포함 (; Isotec 13 C 6 15 N 4)과 라이신 (13 C 6 15 N 2; Isotec) 20mg / isotopically 정상 또는 무거운 아르기닌의 L과 보충 아미노산의 완전한 보완합니다. </li><li> 세포는 1.8 OD 600, 18 시간 동안 성장했다. 이것은 세포가 표시된 동위 원소의 전체 결합을 달성하기 위해 최소한 9 세대를 통과 것이 중요합니다. 가벼운 예제 매체 (isotopically 정상 아르기닌과 리신, 0.2 % Oleate (시그마 화학)와 0.5 % 트윈 40 (시그마 화학))가 포함된 oleate에 reseeded 다른 85분에 대한 자극, 멸균 물을 씻어, pelleted했다. 이것은 아르기닌과 리신과 관련하여, isotopically 빛 수율, 샘플 및 isotopically 무거운 포도당 - 재배 참조 샘플을 oleate 자극. </li></ol> 세포 용해, 분리 및 펩티드의 분류 <ol start="3"><li> 원심 분리기 병의 무게를. 3 분 원심 분리하여 수확 샘플. 미디어를 제거하고 여분의 액체를 대기음. 펠렛 및 병 (일반적으로 1~2그램 간의 수율됩니다) 액화 질소에 다음 플래시 동결 나가는거야. 액체 질소 (인산 10% 글리세롤, 프로 테아제 억제제가 (SigmaFAST 프로 테아제 억제제의 알약, 시그마 (PBS, Gibco) 살린 버퍼)의 냉동 알약의 &#39;그라인딩&#39;버퍼의 펠렛 중량에 볼륨 상당을 추가하고 (써모 과학 인산 가수 분해 효소 억제제를 중단 )). </li><li> 액체 질소의 분쇄 용기를 고정. 액체 질소가 끓는 중단 때까지 기다리십시오. 냉동 볼 베어링과 함께 분쇄 용기에 펠렛을 전송합니다. </li><li> 3 분 방향 반전과 함께 1 분 20 초주기와 600 rpm으로 분쇄. 액체 질소의 연삭 함선을 Refreeze. 십오분 총 분쇄 시간을 4 번 더 반복합니다. </li><li> 50ml 팰컨 튜브 장소 드라이 아이스로 냉동 grindate를 수집합니다. 사용하기 -80에서 보관 ° C까지 준비. </li><li> 8M의 요소, 0.1M의 탄산수 소 암모늄, 0.1M 트리스 산도 8.6의 10ml 솔루션을 확인하십시오. 냉동 grindate 1 볼륨 (우레아 버퍼의 예제 3mls을위한 PBS 버퍼 1 ML과 1g 펠렛에 추가)에 요소 버퍼 3 볼륨을 추가합니다. 즉시 프로브 팁 sonicator (- 10초 펄스 2)와 혼합 sonicate. 솔루션의 거품 방지하기 위해 튜브의 아래쪽 끝 보관하십시오. grindate은 즉시 솔루션으로 가야한다. </li><li> 4 5 분 원심 분리하여 lysate을 해제 ° C. </li><li> 신선한 튜브에 뜨는 전송합니다. </li><li> 0.5M 트리스의 신선한 나누어지는 만들기 [2 - carboxyethyl] phosphine (TCEP). 5mM 최종 농도에 대한 1:100에서 샘플을 추가합니다. 37 품어 ° C를 한 H.위한 </li><li> 감소 cysteine​​s의 알킬화. 실온으로 냉각하도록 허용합니다. 1M iodoacetamide의 신선한 나누어지는하십시오. (우리는 호일에 튜브를 줄 바꿈) 어둠 속에 보관. 20mM의​​ 최종 농도에 추가합니다. 실온에서 1 H에 대한 어둠 속에 품어. </li><li> 1 H. 위해 실온에서 1M 주식에서 20mM DTT와 iodoacetamide을 끄다 </li><li> 표준 브래드 또는 BCA 분석 (설명하지 않음)로 단백질을 정량. 아래 SDS 페이지로 분석을 위해 샘플을 가져가라. </li><li> 무거운 동위 원소의 결합을 확인하려면, 감소 및 alkylated lysate 100 μl를 사용합니다. DH 2 O와 1시 4분을 희석, sonicate 및 트립신에 50:1 단백질의 트립신을 추가합니다. C18 Ultramicrospin 열 (네스트 그룹)과 VAC 후 탈염하다 속도 다운 4 시간 최소 건조 시료에 대한 다이제스트. <ol><li> Acetonitrile 100 μl와 수화물 칼럼 </li><li> 200 μl 0.1 % TFA와 평형. </li><li> 200 μl 0.1 % TFA의 건조 표본을 Resuspend. 칼럼에로드합니다. ~ 200 XG 또는 열의를 통해 흐름에 필요한 최소한의 속도로 원심 분리기. </li><li> 200 μl 0.1 % TFA로 두 번 씻으십시오. </li><li> 50 μl 60 % Acetonitrile, 0.1 % TFA로 두 번과 Elute. </li><li> VAC 속도 건조 샘플. </li><li> 20 μl 0.1 %의 개미의 산이 Resuspend 샘플. 질량 분석계 2 μl를 실행합니다. isotopically 무거운 아르기닌과 각 M / Z 스펙트럼에서 10 8 돌턴 변화에 의해 라이신의 법인을 확인합니다. 98% - 각 아미노산에 대한 설립 96 사이 여야합니다. </li></ol></li><li> isotopically 무겁고 가벼운 샘플 이에 상응하는 금액을 (단백질의 MG) 섞는다. </li><li> 20 % 메탄올로 샘플 1시 4분을 희석. </li><li> 1:200에​​서 트립신을 추가합니다. 37 밤새 품어 ° C. </li><li> 그 소화는 SDS 페이지로 완료 갔어 확인하십시오. 2 4 predigestion 샘플의 μl 8를 실행게시물 트립신 다이제스트의 D 16 μl. 소화가 완료되는 쿠매시의 얼룩으로 시각화. 그것이 완료되지 않은 경우, 프로브 팁 sonicator의 잠시와 샘플을 sonicate하고 트립신로 다시 소화. </li><li> VAC 속도 샘플을 건조시킵니다. 건조 펠렛이 솔루션에 들어가기까지 필터링 DH 2 O와 와동 200 μl을 추가하면. VAC 속도 아래로 드라이 샘플. DH 2 O.로 다시 Resuspend 다시 샘플을 건조시킵니다. </li><li> 0.1 % Trifluoracetic 산이 Resuspend 펠릿 (TFA, 시그마). 산도가 산도 스트립을 사용하여 3시 경이되었는지 확인합니다. 10 % TFA와 시게하다 필요하면. </li><li> 어떤 침전물 밖으로 펠렛. </li><li> 워터스 9 월 박 VAC 500 MG C18 컬럼에서 샘플을 탈염하다. 이러한 열 과부하하지 마십시오. 최대 금액은 5 MG이지만 그것은 덜로드하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 여러 열 사이의 샘플을 나눕니다. <ol><li> 5 ML 100 % acetonitrile와 하이드 열. ~ 200 XG 또는 열의를 통해 흐름에 필요한 최소한의 속도로 원심 분리기. </li><li> 5ml 0.1 % TFA와 열 평형. 샘플을로드합니다. 흐름을 수집하고 다시로드합니다. </li><li> 5 ML 0.1 % TFA로 씻으십시오. 반복합니다. </li><li> 2ml 60 % Acetonitrile, 0.1 % TFA로 Elute. </li><li> VAC 속도 아래로 드라이 샘플. </li></ol></li></ol> Phosphopeptides의 펩타이드 분류 및 절연 <ol><li> 펩티드는 HILIC 컬럼에 fractionated 있습니다. 우리는 TOSOH 쯧 - 젤 아미드 - 80 4.6 mm X 25cm 경비원 컬럼 분석 컬럼.를 사용하여 이 단계를 사용하여 시간을 가지고, 다음 실행을 두 개의 빈 그라디언트는 샘플을 로딩하기 전에 90%에서 2 시간 동안 컬럼을 실행합니다. 이 크기는 XX 주변에있을 것으로 생각되는 열을 최대 부하, 우리는 일반적으로 실행 당 5 개 이상 MG를 로드할 수 없습니다. </li><li> 솔벤트 - 98% ACN/0.1 % TFA 솔벤트 B - 2퍼센트 ACN/0.1 % TFA 90%의 하중 20 &#39;, 90 % A 85%에 이상 5&#39;, 85 % A 60 % 40 &#39;, 60 % 0 % 5 이상&#39;, 0 % A 90 % 이상 5 &#39;를 보자. </li><li> 유속은 1ml/min이며 분수는 85% 60 % 기울기 시작하여 2 분 간격으로 수집되었다. </li><li> 10 분수의 수를 줄이기 위해 분수를 결합합니다. 증가 분수는 가능성 phosphoproteome의 큰 혜택을 얻을 것입니다. </li></ol> phosphopeptides의 농축 <ol><li> Phosphopeptides는 PHOS의 선택 철 선호도 젤을 사용하여 풍부하게하고 있습니다. 우리는 나누어지는 반복 동결 융해가되지 않도록하기 위해 아이맥 수지. 250 MM 초산, 30 % ACN 부하 솔루션 50 MLS하십시오. HCL로 산도 2.7 가져와. 부하 솔루션 500 μl의 알약을 Resuspend. 필요에 따라 HCL 또는 NaOH로 조정, 산도를 확인합니다. </li><li> 해당 항목에 아이맥 구슬 Prewash 200 μl. 우리는 Molbiotec 스핀 컬럼을 사용합니다. 각 분획에 50 % 슬러리 (솔루션을 로드할 젤) 15 μl를 추가하고, 최종 회전을 통해 최종 30에 대한 샘플을 &#39;품다. 분석을위한 흐름 유지. </li><li> 부하 솔루션 샘플 3 번 씻고 번 500 μl 필터 DH 2 O. </li><li> 2 Elute 펩티드 - 50 MM 나 2 HPO 4 (산도 8.4) 버퍼 400 μl로 3 분. 유리관에 전송. </li><li> 5 μl 100 % 개미의 산, 액체 질소에 플래시 동결하고, VAC 속도 건조 샘플 아래와 산도 3 시어지다. </li><li> 0.1 % TFA하고 위에 설명된대로 깨끗한 C18 200 μl에 Resuspend phosphopeptides. VAC 속도 eluted 샘플을 건조시킵니다. </li><li> 0.1 % 개미 산성 20 μl의 펩티드를 Resuspend. 이 질량 분석계 분석 μl 당 또는 필요에 따라 사용하십시오. </li></ol> 노트 많이 본 프로토콜의 여러분은 &#39;장님&#39;을 작동됩니다. 세포 용해는 서양의 모래 바닥과 브래드 또는 BCA assays, 그리고 트립신의 소화도 쉽게 평가 수에 의해 모니터할 수 있습니다. HILIC 컬럼이 하나와 유사한 추적을 준, 또는 다른 사람 [1, 2] 사용되는 액체 크로마 토그래피 시스템에 따라가 볼 것이다. 샘플은 대량 분석법에 의해 모니터링되며 이러한 높은 질량 정확도, 높은 해상도 머신에 높은 비용 분석 가기 전에 LCQs 또는 MALDIs로 저렴 컴퓨터에 샘플을 테스트합니다. 당신이 거기에 산이있는 샘플을 다운 건조 마지막 경우, 유리를 사용합니다.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

이 방법은 양적 분석 수 phosphopeptides의 농축을 얻을 것입니다. 매개 변수의 숫자는이 프로토콜의 변경,하지만 기억에 가장 중요한 부분은 인산화를 보존하는 것입니다 수 있습니다. 당신이 그토록 ICAT와 같은 생체내, 태그에 전지를 라벨 수없는 경우 부량에 대한 세포의 준비는 예를 들어, 다른 여러 가지 방법으로 얻을 수 [3] 또는 ITRAC [4] differentially 부량 두 문화를 라벨에 게시물을 추출을 사용할 수 있습니다 목적. 분류에 대한 가장 일반적인 방법은 SDS PAGE [5, 6]에 의해 겔 분별화, SCX 크로마 토그래피 [7], 그리고 HILIC 크로마 토그래피 기초 [1, 2]. 아르 그것이 오히려 SCX하지만 다른 그룹은 다른 방법으로 좋은 성공을 이뤄 냈습니다 같이 그라디언트 앞에 eluting, 그라데이션이 끝날 때까지 펩티드​​를 유지하기 때문에 우리는 HILIC 선택했습니다. <p class="jove_...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginine-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lysine-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; 인산염 완충 식염수(PBS) 7.4 (10X) 액상</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFAST 프로테아제 억제제 정제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Halt 포스파타아제 억제제 칵테일</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Retsch PM100 볼 밀 그라인더</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Retsch 125 ml 스테인리스 스틸 그라인딩 자</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrospin C18 컬럼</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm 분석용 컬럼</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>HILIC 크로마토그래피 컬럼입니다.</td></tr><tr><td>가드 컬럼 4.6 mm ID x1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>HILIC 컬럼의 수명을 연장하기 위해 이 가드 컬럼을 사용할 것을 권장합니다.</td></tr><tr><td>PHOS-Select&amp;#8482; 철 친화성 겔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>IMAC 레진입니다. 소분하여 보관하십시오.</td></tr></tbody></table>

지방산의 정량 phosphoproteomics은 자극 saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

이 프로토콜은 isotopically 무거운 가벼운 S. cerevisiae의 세포의 지방산 oleate와, 성장과 자극을 설명합니다. 세포는 볼 밀 분쇄기 및 요소의 solubilization에 의해 솔루션으로 가져온 결과 grindate에 cryolysis 절차를 사용하여 접지합니다. 이 절차는 인산화을 보존하고 세포 용해 동안 phosphoproteome의 reorientation 방지, metabolically 비활성 상태에있는 세포의 용해를 위해 수 있습니다. 감소, 알킬화, 단백질의 트립신의 소화에 따라, 샘플은 C18 컬럼과 친수성 ​​상호 작용 크로마 토그래피 (HILIC)을 사용 분별화 감소 샘플 복잡 desalted 있습니다. HILIC 컬럼은 우선적으로 잘 phosphoproteomics 적합합니다 친수성 ​​분자를 유지합니다. Phosphorylated 펩티드가 아닌 phosphorylated 대응보다 색층 프로필 나중에 elute하는 경향이있다. 분별화 후, phosphopeptides은 인산 농축에 대해 요금을 부과 기반의 동질성에 의존 고정화 금속 크로마 토그래피를 사용하여 풍부하게하고 있습니다. 이 절차의 뒷부분에있는 샘플은 양적 질량 분광법으로 분석 준비가 된 것입니다.

cryolysis, 요소의 solubilziation, HILIC 분류 및 phosphorylated 펩티드의 아이맥 농축을 사용하여 양적 인산화 과정에 대한 설명.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

본 프로토콜은 동위원소 중표지 및 경표지 *S. cerevisiae* 세포의 배양과 지방산인 올레산(oleate)을 이용한 자극 방법을 설명합니다. 세포를 분쇄하여...

인산화는 단백질 국소화부터 DNA 전사까지의 과정을 조절하는 핵심 세포 신호 전달 기전이며, 질량 분석법을 통해 인산화 단백질만을 연구하는 것은 신호 전달 및 프로테오믹스 연구 모두에서 흥미로운 새로운 발전입니다. 서로 다르게 표지된 세포들을 볼 밀 그라인더(ball mill grinder)로 용해시킨 후, 환원, 알킬화, 혼합 및 소화를 진행합니다. 소화된 펩타이드를 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)로 분획하고, 각 분획에서 iMac 농축법을 통해 인산화 펩타이드를 농축합니다.인산화 펩타이드 농축 분획은 이후 msm을 통해 확인합니다. 안녕하세요, 저는 Institute Persistence Biology의 E 그룹 소속 Ramsey Celine입니다. 오늘은 대사성 표지된 인산화 펩타이드 추출 절차를 보여드리겠습니다.본 연구실에서는 fossa 프로테옴을 정량적으로 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 이 절차는 동위원소 가벼운 효모 세포와 무거운 효모 세포를 배양하는 것부터 시작합니다.먼저 100 milliliters의 rich media에 효모 세포 단일 콜로니를 접종합니다. 이 배양액을 OD 600이 1.0이 될 때까지 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 이를 사용하여 아미노산이 모두 포함되어 있고 20 milligrams per liter의 isotopically가 보충된 1 liter 용량의 minimal medium 배양액 두 개를 시딩합니다.일반 또는 동위원소로 표지된 중아르기닌(arginine)과 라이신(lysine)이 포함된 배지에서 1L 배양액을 18시간 동안 OD 600이 1.8이 될 때까지 배양합니다. 표지된 동위원소가 완전히 통합되려면 세포가 최소 9세대를 거치는 것이 매우 중요합니다. 세포에 표지된 동위원소가 완전히 통합되면, 일반 아르기닌과 라이신이 포함된 배지에서 배양한 세포를 원심분리합니다.세포 펠릿을 얻으려면, 펠릿을 멸균수로 세척한 후 동위 원소적으로 일반적인 arginine과 lysine이 포함된 medium 및 oleate에 현탁하여 85분 동안 자극합니다. 이렇게 하면 동위 원소적으로 가벼운 oleate 자극 시료가 생성됩니다. 동위 원소적으로 무거운 arginine과 lysine이 포함된 media에서 배양한 다른 배양물은 oleate로 자극하지 않으며, 이는 동위 원소적으로 무거운 glucose 성장 참조 시료로 사용됩니다.1리터를 수집하기 위해, 배양액을 250밀리리터 원심분리 병 4개에 나누어 담습니다. 원심분리 후, 배지를 100밀리리터만 남기고 제거한 뒤 세포를 재현탁하여 다음 튜브로 옮기는 과정을 반복함으로써 세포를 하나의 튜브에 수집합니다. 마지막으로, 수집된 하나의 큰 펠렛을 4,000 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다.배지를 제거한 후, 원심분리 병과 펠릿의 무게를 빈 원심분리 병의 무게와 비교합니다. 원심분리 후 배지를 제거하고 병에서 과잉 액체를 흡입하여 제거한 다음 펠릿의 무게를 측정하며, 일반적인 수득량은 1~2g 사이입니다. 다음으로, 펠릿을 액체 질소로 급속 냉동시키고 프로테아제 및 포스파타아제 억제제가 포함된 분쇄 버퍼를 펠릿에 첨가합니다.첨가하는 분쇄 버퍼의 부피는 펠릿의 무게와 동일해야 합니다. 분쇄 용기를 액체 질소에 넣어 냉각시키십시오. 액체 질소의 끓음이 멈췄을 때.스캐풀라(scapula)를 사용하여 펠렛을 떼어낸 후, 냉동된 볼 베어링이 들어 있는 분쇄 용기로 옮깁니다. 600 RPM에서 1분 간격의 22초 사이클과 3분 간격의 방향 전환을 설정하여 펠렛을 분쇄합니다. 분쇄 용기를 액체 질소에 넣어 다시 냉동합니다.분쇄 과정을 4회 더 반복하여 총 15분 동안 수행합니다. 두 샘플 모두 분쇄가 완료된 시점의 분쇄 시간을 기록합니다. 냉동된 분쇄물을 50 milliliter falcon 튜브에 수집하고, 액체 질소 또는 드라이아이스를 이용하여 냉동 상태를 유지합니다.분쇄된 날짜를 사용 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. 펩타이드의 분리 및 분획은 알킬화 작업부터 시작됩니다. 첫 번째 단계는 urea 용액에 샘플을 가용화하는 것입니다.냉동된 분쇄 시료 1부피당 3부피의 요소 버퍼를 추가하여 각 분쇄 시료를 용해시킵니다. 예를 들어, 1 g 펠릿에 3 mL의 RIA 버퍼를 추가합니다. 1 mL의 PBS 버퍼와 함께 사용합니다.프로브를 사용하여 혼합물을 즉시 초음파 처리하십시오. 팁 초음파 처리(Tip sonicate)를 수행합니다. 용액의 거품 발생을 방지하기 위해 팁을 튜브 바닥 근처에 유지하십시오.분쇄된 조직은 즉시 용액에 넣어야 합니다. 6,000 RPM에서 5분간 원심분리하여 용해물을 투명하게 만듭니다. 4°C에서 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.환원 반응을 시작하려면, 각각의 샘플에 갓 조제한 0.5 M Tris와 1:100 희석 농도의 TCEP를 첨가하십시오. 최종 TCEP 농도가 5 mM이 되도록 샘플을 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. 37 °C 배양 후, 샘플을 실온까지 식히십시오.그 다음, 갓 준비한 1 M iodoacetamide를 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가하고 상온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간의 배양 후, 20 mM DTT를 사용하여 iodoacetamide 반응을 정지시킵니다. 상온에서 1시간 동안 그대로 둡니다.환원 및 알킬화된 용해물은 이제 트립신 소화 준비가 완료되었습니다. 이 시점에서 용해물 샘플을 사용하여 단백질 정량, 세포 용해 여부 확인을 위한 SDS page 분석 및 중동위원체 도입 확인을 위한 질량 분석을 수행할 수 있습니다. 트립신 소화를 시작하려면 동위원체 중쇄 및 경쇄 샘플을 동일한 양으로 혼합하십시오.샘플을 20% methanol로 4배 희석하고, trypsin을 200배 희석하여 첨가합니다. 샘플을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. SDS page와 kumasi 염색을 통해 완전한 소화를 확인한 후, speed vac으로 샘플을 건조시킵니다.필터링된 증류수 200 µL를 가하고 펠렛이 용해될 때까지 볼텍싱합니다. 스피드백(speed vac)으로 샘플을 건조시킨 후 증류수로 다시 현탁합니다. 샘플을 건조한 후, 펠렛을 0.1% Trifluoroacetic acid(TFA)로 다시 현탁하며, 필요한 경우 pH 시험지를 사용하여 pH가 3 정도인지 확인합니다. 10% TFA로 산성화하여 침전물을 펠렛화합니다.트립신으로 소화된 시료를 Waters Set Pack VAC 500 mg C18 컬럼을 사용하여 탈염합니다. 먼저, 5 mL의 100% 아세토니트릴로 컬럼을 하이드레이션하며, 약 200 ×g 또는 컬럼을 통해 액체가 흐르는 데 필요한 최소 속도로 원심분리합니다. 다음으로, 5 mL의 0.1% TFA로 컬럼을 평형화한 후 시료를 로딩합니다.컬럼에 과부하가 걸리지 않도록 주의하고, 필요한 경우 샘플을 여러 컬럼으로 나누어 분주하십시오. 흘러나오는 액체는 폐액 용기에 수집하고, 필요한 경우 컬럼을 다시 로드한 후 0.1% TFA 5 mL로 세척하십시오. 이 세척 과정을 반복한 후 60% Aceto nitrile 0.1% TFA 2 mL로 용출하십시오. EEU는 원심분리를 통해 수집해야 합니다.Speed vac을 사용하여 샘플을 건조시킨 후, 건조된 샘플을 200 µL의 용매 B에 재부유시킵니다. 이제 재부유된 샘플을 펩타이드 분획화에 사용할 수 있습니다. 가드 컬럼이 장착된 TSK gel AMIDE 80 분석 컬럼에서 펩타이드를 분획합니다. 각 단계를 신중하게 수행하십시오.컬럼을 90% solvent A 상태에서 2시간 동안 작동시킨 후, 샘플을 로딩하기 전 블랭크 그래디언트를 2회 수행하십시오. 일반적으로 이 크기의 컬럼에서는 회당 5 mg 이상의 샘플을 로딩하지 않으며, 이는 최신 장비와 구형 액체 크로마토그래피 장비 모두에 해당됩니다. 장비를 통해 샘플 자동 주입, 분획 수집, 유속 제어 및 그래디언트 혼합을 수행할 수 있습니다.이 설정들은 설명된 대로 런(run) 시작 시에 지정합니다. 20분 동안 90%A를 로딩하고, 5분 동안 90%A에서 85%A로, 40분 동안 85%A에서 60%A로, 5분 동안 60%A에서 0%A로, 그리고 5분 동안 0%A에서 90%A로 변경합니다. 유속은 분당 1mL로 설정하고 2분 간격으로 분획을 수집합니다.85%A에서 60%A까지의 구배를 시작으로, 분획 수를 줄이기 위해 분획들을 병합하십시오. 분획 수가 많아지면 인산화 단백질체(phospho proteome)의 커버리지가 더 높아질 가능성이 큽니다. 인산화 펩타이드는 고정 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal chromatography)를 통해 농축됩니다. iMac 수지로 phos select iron affinity gel을 사용합니다.먼저 500 µL의 로딩 용액(load solution)에 펠렛을 현탁합니다. 다음으로, 각 분획에 50% 슬러리 15 µL를 첨가하고 상하 회전(end over end rotation) 방식으로 30분 동안 샘플을 배양합니다. 분석을 위해 유량을 유지하십시오.샘플을 로드 용액으로 3회 세척하고, 세척 후 500 µL의 여과된 증류수로 1회 세척합니다. 400 µL의 50 mM sodium phosphate buffer를 사용하여 2~3분 동안 펩타이드를 용리시킵니다. 용리된 펩타이드를 유리 바이알로 옮깁니다. pH 3으로 산성화하기 위해 펩타이드에 5 µL의 100% formic acid를 첨가합니다. 인산화 펩타이드를 200 µL의 0.1% TFA에 재현탁하고, 앞서 설명한 대로 C 18 컬럼을 사용하여 다시 탈염합니다. 용리된 샘플을 speed vac으로 건조시킵니다.마지막으로 인산화 펩타이드를 20 µL의 0.1% formic acid에 재현탁합니다. 이제 샘플을 질량 분석법으로 정량 분석할 준비가 되었습니다. 여기 H-I-L-I-C 크로마토그래피를 이용한 전체 세포 펩타이드 분획의 크로마토그램 트레이스가 표시되어 있습니다.이 트레이스에서 포스포펩타이드가 용출 프로파일 전반에 걸쳐 발견되지만, 인산화된 잔기의 대부분은 용출 프로파일의 끝부분에 가까워질 때까지 유지됨을 관찰할 수 있습니다. 지금까지 세포 분쇄, 단백질 소화, 펩타이드 분획 및 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 포스포펩타이드 농축 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 인산화를 유지하고 완충 용액의 pH를 확인하는 것이 중요합니다.여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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