Name: 보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 학습하세요 보완 고갈 기법을 이용한 T세포 고갈 방법을. 단클론 항체와 토끼 보완체를 사용하여 95-100%의 높은 순도로 면역 세포를 분리하는 효율적인 실험 기술입니다.

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나는 그림 1의 데이터를 제공 Sreemanti Basu 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 부여 AI069358 및 BloodCenter 연구 재단에 의해 부분적으로 지원되었다.

A. 래빗 보완 <ol><li> 주식 토끼 보완은 상온에서 해동 후 0.5 및 / 또는 1 ML 볼륨에 aliquoted과 ° C 장기 저장을위한 -20-80에서 냉동해야합니다. </li><li> 보완 각각의 많은 최적의 작업 농도를 결정하기 위해 titrated해야합니다. 일반적으로, 1시 10분에서 1시 20분까지의 희석이 최적입니다. </li><li> 토끼 보완은 항상 세포의 최종 사용에 따라 이전에 판매 presterilized 아니라, 보완은 aliquoted 때 소독 필터링 사전 세포 이외에 냉동하거나해야합니다. </li></ol> B. 항체 선택 <ol><li> 모든 항체 따라서 항체가 처음 활동에 대한 검사를해야하며, 보완 활성화에 효과적입니다. </li><li> 마우스 및 쥐 mAb 모두 보완 활성화에 효과적입니다. </li><li> IgM 항체는 IgG 다음 보완 유도된 세포 용해에 사용하기 위해 일반적으로 가장 효율적인 수 있습니다. 최고의 보완 활성화에 대한 IgG의 isotypes, 종족 간의 다릅니다. </li><li> 각 항체는 10 7 셀 / ML의 세포 밀도에 최적 사용하기 위해 titrated해야합니다. </li></ol> C. 기본 프로토콜 <ol><li> 5 시작 세포 인구를 조절 매체를 포함하는 열 inactivated FCS에서 X 10 7 세포 / ML. 세포의 최종 볼륨을 두 번 시작 볼륨 것입니다. 고갈을 계량 수 있도록 몇 가지 세포를 저장하는 기억하십시오. </li><li> 각 항체는 적절한 정해진 농도 또는 희석에 세포 현탁액에 추가되어 있어야합니다. 잘 역전하여 세포를 섞는다. </li><li> 필요한 보완의 양을 계산합니다. 상온에서 보완 주식을 녹여. 보완이 멸균되지 않은 경우, 그것이 낮은 단백질 바인딩 주사기 팁 필터를 사용하여 소독. 주사기하려면, 보완을 추가하기 전에 중간 여러 ML을 추가하고 세포와 항체가 들어있는 튜브에 직접 필터. </li><li> 세포는 1 X 10 7 셀 / ML에 있습니다 있도록 튜브의 마지막 볼륨을 조정합니다. </li><li> 15 분 간격으로 혼합 한 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 세포를 원심과 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 매체와 함께 두 번 씻으십시오. 세포 파편 폴리스티렌 튜브의 측면에 집중합니다. 죽은 세포와 부스러기는 셀 스트레이너 또는 밀도 기울기 원심 분리에 의해 제품을 사용하여 제거하실 수 있습니다. </li><li> 고갈 전후 관심의 세포 인구를 비교하여 세포 순결을 확인합니다. 유동세포계측법 및 immunohistochemistry는 세포 순도를 결정하는 두 가지 좋은 방법입니다. </li></ol> 대표 결과 한 라운드 후 보완, 세포 고갈을 활성화에 매우 효율적입니다 mAb를 사용하면하면 다음 95% 큽니다. 이것은 우리가 유동세포계측법에 의해 TCRβ 표현 (eBioscience, 샌디에고, CA)에 의해 감지와 같은 32.2 %의 αβ의 T 세포로 구성된 마우스 splenocytes 시작 그림 1에 표시됩니다. 우리는 mAb Thy1에 대한 구체적인 모든 T 세포에 의해 표현 단백질지만, 다른 건 못 leukocytes를 사용하여 T 세포를 고갈. 우리가 사용하는 항체는 Y - 19 쥐를 IgG2c이되었습니다. 설명된 절차에 따라, TCRβ 인구는 1.56 % 이상 95 % 감소로 감소했다. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. thy1의 고갈은 + 보완 활성화하여 지라 T 세포. 총 마우스 splenocytes는 RBC의 비장과 용해의 균질하여 얻을 수 있었다. 안티 thy1하고 사전에 정해진 농도의 아기 토끼 보완은 최종 세포 농도는 1 X 10 7 셀 / ML 것을 같은 splenocytes의 단일 세포 현탁액에 추가되었습니다. 37에서 1 시간 동안 배양 후 ° C, 세포가 두 번 씻어 및 세포 생존을위한 trypan 파랑 배제에 의해 평가되었다. 고갈의 효율 고갈 (왼쪽 패널) 전에 고갈 (오른쪽 패널) 이후 TCRβ + 세포의 비율을 비교 유동세포계측법에 의해 평가되었다. 수평 막대는 긍정적인 얼룩을 나타내며 막대 위에있는 숫자는 긍정 %입니다.

<ol><li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immune+System+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).</li>
<li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li>
</ol>

세포 인구의 정화는 기능의 연구에 필요한 일반적인 절차입니다. 여기 우리는 항원 - 항체 및 구체적인 보완 고갈을 사용하여 셀 인구 파괴의 신속하고 효과적인 방법을 설명합니다. 보완 - 활성화 항체가 혈통 특정 마커를 사용할 경우 모든 세포 인구의 고갈이 형성될 수 있습니다. 여기에 우리가 Thy1에 대한 mAb를 사용하여 특정 T 세포의 고갈을 시연, 단백질은 본질적으로 모든 T 세포 집단에 의해 표시됩니다. 우리는 αβ T 세포의 95 % 이상 고갈 나머지 splenocytes는 68%에서 98 %로 증가했다. 세포 순결의이 수준은 외과와 ​​자석 구슬 분리 등 다른 정화 전략과 비슷합니다. 보완 고갈이 시작 셀 인구가 획득되면 1.5 시간에 수행할 수있는 빠른 방법입니다. 보완 고갈의 또 다른 장점은 고가의 장비와 시약을 필요로하지 않기 때문에 모든 실험실이 기법을 수행할 수있다는 것입니다. 필요한 장비의 유일한 주요 작품은 물 목욕과 원심 분리기입니다. 토끼 보완은 저렴한 비용으로 다양한 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다 (시약의 표 참조) 많은 mAb는 ATTC에서 구입하여 비용을 관리하는 로컬 성장하실 수 있습니다. 반면, 외과는 여섯 숫자와 비싼 찬란 태그 mAb의 비용 셀 정렬 용량 흐름 cytometer이 필요합니다. 마그네틱 비드 분리 알맞게 가격이지만, 치명타가 될 수 있습니다 자석과 자석 구슬의 구입이 필요합니다. 또한, 일부 자기 비드 분리 전략은 또한 컬럼의 구입이 필요합니다. 세포 고갈에 대한 보완의 사용에 가장 큰 걸림돌이 필요한 항원 특이성과 mAb를 활성화 보완의 가용성이다. 인간, 마우스 및 쥐 항체가 모두 보완 문제를 해결하는 능력을 가지고 있지만, 일부 isotypes 다른보다됩니다. 세 종 IgM은 보완을 고치에서 매우 효과이지만, IgG의 isotypes이 다릅니다. 따라서 모든 mAb 먼저 그 효과를 확인하기 위해 파일럿 연구에서 테스트해야합니다. 고효율되지 않은 항체 들어, 보완 고갈의 두 라운드가 남아있는 세포 집단의 생존에 영향을주지 않고 수행할 수 있습니다. 비용 절감으로 항체는 최적의 효과에 대한 titrated해야합니다. 또한, 사용되는 항체는 정화가 필요가 없습니다. 정화 어렵습니다 IgM 항체, 특히 편리합니다 마찬가지로 효과적으로 하이 브리 도마 supernatants 및 복수 유체 작업. 항체와 마찬가지로 그것은 보완이 파일럿 연구에서 titrated하는 것이 필수적입니다. 농도의 너무 높은가 아닌 타겟 세포 인구의 생존 능력의 손실을 초래합니다. 또한 중요 부화 시간이 60 분 초과하지 않는다는 것입니다. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 함께 항체와 보완을 공동 품어. 그러나, 세포는 15-30분에 대한 항체로 분류 사전 보완을 추가로 씻어 수 있습니다. 이 전략을 사용하는 경우와 같은 패치 및 상한 또는 수용체 국제화에 의해 일부 단백질과 발생, 세포 표면에있는 세포 항원의 손실을 방지하기 위해 얼음에 항체 incubations을 수행할 수 있는지 확인하십시오. 고효율이지만, 다른 방법에 비해 소모를 보완하기 위해 주요 단점은 그것이 긍정적인 선택에 사용할 수 없다는 것입니다. 그러므로 그것은 세포의 subpopulations를 얻을 어렵습니다. 예를 들어, 최고의 외과에 의해 수행 될 follicular의 B 세포에서 한계 영역 B 세포를 정화하기 어려운 것입니다. 이 상황에서, 보완 정품 인증이 정렬되는 세포의 수를 줄이기 위해 T 세포를 고갈하는 데 사용할 수 있습니다. 이 전략은 비용을 절감하는 것이있는, 정렬 시간을 줄일 것이며, 세포에 덜 거칠 것입니다. 특정 세포 집단의 정화는 일반적인 요구 사항이기 때문에 전략의 번호가 개발되었습니다. 보완 고갈 전략의 주요 장점은 경제성, 기술적 단순 및 시간 절감하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3-4주령 새끼 토끼 보체</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31061-3</td><td></td></tr><tr><td>항온수조</td><td>다양함</td><td>다양함</td><td>37 &amp;#x00B0;C로 설정된 인큐베이터를 사용할 수도 있습니다.</td></tr></tbody></table>

보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

면역 세포 집단의 정화는 종종 자신의 고유의 기능을 연구하기 위해 필요합니다. 이러한 실시간 PCR과 microarray 분석 등 특히, 분자 접근법에서 고순도로 세포 인구의 격리를 필요로합니다. 일반적으로 사용되는 정화 전략은 형광 활성 세포 분류 (외과), 마그네틱 비드 분리 및 보완 고갈을 포함합니다. 세 전략, 보완의 고갈은 빠르고 저렴, 세포가 높은 세포 수율에 부드러운되는 장점을 제공합니다. 보완 시스템이 활성화되면 세포 사망의 결과 세포 표면에 기공을 형성하는 멤브레인 - 공격 복잡한 형성에 culminating proteolytic 층계를 시작 플라즈마 단백질의 다수로 구성되어 있습니다<sup&gt; 1</sup&gt;. 고전 경로는 IgM과 IgG 항체에 의해 활성화되며 첫 살해 박테리아를위한 메커니즘으로 설명했다. 단클론 항체 (mAb)의 세대, 보완 층계는 항원에 특정한 방식으로 모든 세포 인구를 lyse하는 데 사용할 수 있습니다. 보완 층계에 의해 세포의 고갈은 보완의 고정 항원에 특정한 항체를 시작 셀 인구 토끼 보완의 추가에 의해 이루어진다. 세포 ° C와 lysed 세포 세척 후 두 라운드에 의해 제거 37 한 시간 동안 incubated 수 있습니다. 보완의 고정을위한 고효율 MAb은 일반적으로 타겟 세포 인구의 95-100%를 고갈. 대상 세포 인구를위한 정화 전략에 따라 보완 고갈은 세포 정화 또는 다음 추가 후속 방법으로 정화 수있는 세포 집단의 강화에 사용될 수 있습니다.

효과적으로 정화가 자주 필요한 면역 세포 집단의 기능을 연구합니다. 보완 고갈은 고순도와 면역 세포 인구의 격리를위한 신속하고 저렴한 방법입니다.

면역 세포 집단의 고유한 기능을 연구하기 위해서는 흔히 해당 세포군을 정제하는 과정이 필요합니다. 특히, ...와 같은 분자 생물학적 접근법은

보체 고갈법은 면역 세포 집단을 정제하는 빠르고 효과적이며 저렴한 방법입니다. 보체 고갈은 단클론 IgM 또는 IgG 항체를 세포 집단에 첨가하여 특정 세포 유형을 표적함으로써 시작됩니다. 본 예시에서는 T-세포를 표적으로 하여 고갈시키는 과정을 다룹니다.그 후 보체 시스템을 첨가하여 단백질 분해 폭포 반응을 유도함으로써 T세포의 사멸을 이끌어냅니다. 이후 세포 집단을 원심 분리하여 세척하고 여과하여 죽은 세포와 잔해물을 제거합니다. 이 보체 제거법을 통해 일반적으로 표적 세포 집단의 95~100%가 제거됩니다.안녕하세요, 저는 밀워키에 위치한 위스콘신 혈액 센터 혈액 연구소의 연구원 보니 디틀(Bonnie Dittle)입니다. 오늘은 특정 세포 집단을 제거하기 위한 빠르고 경제적인 방법인 보체 제거 기술(complement depletion)을 소개해 드리겠습니다.저희 실험실에서는 이 기술을 사용하여 면역 세포 집단을 고도로 농축하며, 이렇게 농축된 세포를 세포 활성 및 단백질 발현 분석을 포함한 다양한 생물학적 분석(bioassay)에 활용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 실험을 시작하기 전, 토끼 보체(rabbit complement)를 0.5 또는 1 mL씩 분주하여 -20°C 또는 -80°C 냉동고에 보관하십시오.보체(complement)를 1:10에서 1:20 사이의 최적 희석 배수로 적정하시기 바랍니다. 본 절차에서 저희가 일상적으로 사용하는 우수한 상용 보체 공급원은 Pereze biologicals입니다. 일반적으로 마우스 및 토끼 단클론 항체는 보체 활성화에 효과적이지만, 모든 항체가 적합한 것은 아닙니다. 일반적으로 IgM 항체가 보체 유도 세포 용해에 가장 효율적입니다.IgG 항체는 두 번째로 효율적이며, 대부분의 단클론 항체가 IgG이므로 일반적으로 사용됩니다. 각 항체를 최적의 상태로 사용하기 위해 역가를 측정하며, 이는 경험적으로 결정된 10⁷ cells/mL의 세포 밀도에서 수행합니다. 대부분의 항체는 0.1에서 10 µg/mL 범위 내에서 사용됩니다. 비장 T 세포의 제거를 위해, TH1에 특이적인 단클론 항체를 사용합니다.보체 제거를 시작하려면 5% 열불활화 태아 송아지 혈청이 포함된 세포 배양 배지를 사용하여 세포를 희석하여, 초기 세포 수가 mL당 2 × 10⁷ cells이 되도록 합니다. 예를 들어, 5 × 10⁷ cells은 2.5 mL의 배지에 희석해야 합니다. 이 세포 부피는 최종 부피의 절반이며, 따라서 보체 제거 중에 사용될 세포 농도인 1 × 10⁷ cells/mL의 두 배가 됩니다.이 단계에서, 실험 종료 시 고갈 정도를 정량화할 수 있도록 최대 10⁶개의 세포를 저장하십시오. 또한, 필요한 양의 보체를 실온에서 해동하십시오. Pereze Biologicals의 토끼 보체를 5×10⁷개의 세포에 사용할 경우 1:15 희석 배율이 적절하며, 냉동된 Eloqua 1.5 mL가 충분한 것으로 확인되었습니다.이제 세포 현탁액에 적절한 양의 항체를 추가하고 혼합합니다. 보체를 멸균하려면 단백질 결합력이 낮은 시린지 팁 필터를 사용하십시오. 시린지에 1~2 mL의 배지를 채웁니다.5 × 10⁷개의 세포에 보체를 추가하기 전, 1:15 희석을 위해 340 mL의 보체가 필요합니다. 그 다음, 세포와 항체가 들어 있는 튜브에 보체를 직접 여과하여 넣습니다. 이제 튜브 내의 최종 부피를 조절하여 세포 농도가 1 × 10⁷ cells/mL가 되도록 합니다.다음으로, 세포를 워터배스에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다. 15분마다 가볍게 뒤집어 세포를 혼합해 줍니다. 배양이 끝나면 세포의 생존능에 영향을 주지 않는 속도로 원심분리합니다.그런 다음 다시 후드 내에서 상층액을 제거합니다. 이어서 10 milliliters의 배지로 세포를 두 번 세척합니다. 세포 잔해물이 모이면서 일부가 폴리스티렌 튜브 벽면에 달라붙는 것을 확인하십시오.마지막 세척 후, 70 micron 멸균 나일론 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다. 마지막으로, 결핍 유세포 분석 전후의 표적 세포 집단을 비교하여 세포 순도를 확인합니다.세포 분석법(Cytometry)과 면역조직화학법은 실험 전 세포 순도를 결정하는 데 선호되는 방법입니다. 보체 활성화 효율이 매우 높은 단일클론 항체를 사용할 경우, 1차 보체 제거 과정에서 세포의 95% 이상이 제거됩니다. 예를 들어, 유세포 분석법을 사용하여 마우스 비장 세포 준비물 내의 alpha beta T 세포 비율을 측정한 결과, 모든 T 세포에서 발현되지만 다른 백혈구에서는 발현되지 않는 anti five one을 이용해 보체를 제거한 후 alpha beta T 세포의 비율이 32.2%임을 확인했습니다. TCR beta 집단은 95% 감소하여 최종 농도가 1.56%가 되었습니다.보체 결핍을 이용해 항원 특이적 항체로 특정 세포 집단을 빠르게 효과적으로 고갈시키는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 실험을 시작하기 전, 파일럿 실험을 통해 각 항체의 효능을 테스트하고 보체의 농도를 적정해야 함을 기억하십시오. 이것으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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