보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈

보체 고갈법은 면역 세포 집단을 정제하는 빠르고 효과적이며 저렴한 방법입니다. 보체 고갈은 단클론 IgM 또는 IgG 항체를 세포 집단에 첨가하여 특정 세포 유형을 표적함으로써 시작됩니다. 본 예시에서는 T-세포를 표적으로 하여 고갈시키는 과정을 다룹니다.

그 후 보체 시스템을 첨가하여 단백질 분해 폭포 반응을 유도함으로써 T세포의 사멸을 이끌어냅니다. 이후 세포 집단을 원심 분리하여 세척하고 여과하여 죽은 세포와 잔해물을 제거합니다. 이 보체 제거법을 통해 일반적으로 표적 세포 집단의 95~100%가 제거됩니다.

안녕하세요, 저는 밀워키에 위치한 위스콘신 혈액 센터 혈액 연구소의 연구원 보니 디틀(Bonnie Dittle)입니다. 오늘은 특정 세포 집단을 제거하기 위한 빠르고 경제적인 방법인 보체 제거 기술(complement depletion)을 소개해 드리겠습니다.

저희 실험실에서는 이 기술을 사용하여 면역 세포 집단을 고도로 농축하며, 이렇게 농축된 세포를 세포 활성 및 단백질 발현 분석을 포함한 다양한 생물학적 분석(bioassay)에 활용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 실험을 시작하기 전, 토끼 보체(rabbit complement)를 0.5 또는 1 mL씩 분주하여 -20°C 또는 -80°C 냉동고에 보관하십시오.

보체(complement)를 1:10에서 1:20 사이의 최적 희석 배수로 적정하시기 바랍니다. 본 절차에서 저희가 일상적으로 사용하는 우수한 상용 보체 공급원은 Pereze biologicals입니다. 일반적으로 마우스 및 토끼 단클론 항체는 보체 활성화에 효과적이지만, 모든 항체가 적합한 것은 아닙니다. 일반적으로 IgM 항체가 보체 유도 세포 용해에 가장 효율적입니다.

IgG 항체는 두 번째로 효율적이며, 대부분의 단클론 항체가 IgG이므로 일반적으로 사용됩니다. 각 항체를 최적의 상태로 사용하기 위해 역가를 측정하며, 이는 경험적으로 결정된 10⁷ cells/mL의 세포 밀도에서 수행합니다. 대부분의 항체는 0.1에서 10 µg/mL 범위 내에서 사용됩니다. 비장 T 세포의 제거를 위해, TH1에 특이적인 단클론 항체를 사용합니다.

보체 제거를 시작하려면 5% 열불활화 태아 송아지 혈청이 포함된 세포 배양 배지를 사용하여 세포를 희석하여, 초기 세포 수가 mL당 2 × 10⁷ cells이 되도록 합니다. 예를 들어, 5 × 10⁷ cells은 2.5 mL의 배지에 희석해야 합니다. 이 세포 부피는 최종 부피의 절반이며, 따라서 보체 제거 중에 사용될 세포 농도인 1 × 10⁷ cells/mL의 두 배가 됩니다.

이 단계에서, 실험 종료 시 고갈 정도를 정량화할 수 있도록 최대 10⁶개의 세포를 저장하십시오. 또한, 필요한 양의 보체를 실온에서 해동하십시오. Pereze Biologicals의 토끼 보체를 5×10⁷개의 세포에 사용할 경우 1:15 희석 배율이 적절하며, 냉동된 Eloqua 1.5 mL가 충분한 것으로 확인되었습니다.

이제 세포 현탁액에 적절한 양의 항체를 추가하고 혼합합니다. 보체를 멸균하려면 단백질 결합력이 낮은 시린지 팁 필터를 사용하십시오. 시린지에 1~2 mL의 배지를 채웁니다.

5 × 10⁷개의 세포에 보체를 추가하기 전, 1:15 희석을 위해 340 mL의 보체가 필요합니다. 그 다음, 세포와 항체가 들어 있는 튜브에 보체를 직접 여과하여 넣습니다. 이제 튜브 내의 최종 부피를 조절하여 세포 농도가 1 × 10⁷ cells/mL가 되도록 합니다.

다음으로, 세포를 워터배스에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다. 15분마다 가볍게 뒤집어 세포를 혼합해 줍니다. 배양이 끝나면 세포의 생존능에 영향을 주지 않는 속도로 원심분리합니다.

그런 다음 다시 후드 내에서 상층액을 제거합니다. 이어서 10 milliliters의 배지로 세포를 두 번 세척합니다. 세포 잔해물이 모이면서 일부가 폴리스티렌 튜브 벽면에 달라붙는 것을 확인하십시오.

마지막 세척 후, 70 micron 멸균 나일론 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다. 마지막으로, 결핍 유세포 분석 전후의 표적 세포 집단을 비교하여 세포 순도를 확인합니다.

세포 분석법(Cytometry)과 면역조직화학법은 실험 전 세포 순도를 결정하는 데 선호되는 방법입니다. 보체 활성화 효율이 매우 높은 단일클론 항체를 사용할 경우, 1차 보체 제거 과정에서 세포의 95% 이상이 제거됩니다. 예를 들어, 유세포 분석법을 사용하여 마우스 비장 세포 준비물 내의 alpha beta T 세포 비율을 측정한 결과, 모든 T 세포에서 발현되지만 다른 백혈구에서는 발현되지 않는 anti five one을 이용해 보체를 제거한 후 alpha beta T 세포의 비율이 32.2%임을 확인했습니다. TCR beta 집단은 95% 감소하여 최종 농도가 1.56%가 되었습니다.

보체 결핍을 이용해 항원 특이적 항체로 특정 세포 집단을 빠르게 효과적으로 고갈시키는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 실험을 시작하기 전, 파일럿 실험을 통해 각 항체의 효능을 테스트하고 보체의 농도를 적정해야 함을 기억하십시오. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.