마우스 복막 구멍 세포의 분리
2010년 1월 28일
포유류의 복막 캐비티는 타고난 면역 반응에 중요한 다른 면역 세포 인구가 포함되어 있습니다. 효율적인 분리 방법은 이러한 세포의 생화 학적 및 기능적 분석이 필요합니다. 여기서 우리는 마우스의 복막 공동 세포의 격리를위한 포괄적인 방법을 제공합니다.
복강 세포의 분리는 안락사시킨 마우스를 등으로 눕혀 고정하는 것으로 시작합니다. 복막의 외피를 절개하고 조심스럽게 젖혀 내피를 노출시킵니다. 3% FBS가 포함된 PBS를 복강 내에 주입하고 복막을 부드럽게 마사지합니다. 복강 세포가 포함된 액체를 수집하여 얼음 위에 놓인 15 milliliter 튜브에 담습니다.
세포를 한 번 세척한 후 헤모사이토미터(hemo cytometer)로 수를 측정합니다. 안녕하세요, 저는 위스콘신 혈액 센터 혈액 연구소의 Dr.Bon 실험실 소속 Oji입니다. 오늘은 마우스의 복강에서 세포를 분리하는 절차를 보여드리겠습니다.
본 실험실에서는 다양한 표현형, 생화학 및 면역학적 분석에 사용할 세포를 얻기 위해 이 절차를 사용합니다. 주로 저희는 복강 B 세포 집단에 관심을 두고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.
복강에서 면역 세포를 분리하기 시작하기 전, 필요한 모든 재료를 준비하십시오. 먼저 아이스 버킷, 27 gauge 바늘이 장착된 5 mL 시린지, 25 gauge 바늘이 장착된 5 mL 시린지, 스티로폼 블록, 그리고 마우스 고정용 핀을 준비합니다. 해부 전, 고정 블록을 받칠 트레이, 가위, 포셉 및 수집 튜브를 준비하십시오.
3% fetal calf serum가 포함된 PBS를 미리 냉각합니다. 마취제 투여 및 적절한 안락사 후, 실험 전 과정 동안 이를 수집 튜브와 함께 얼음 위에 보관하십시오. 마우스에 70% ethanol을 분무하고 스티로폼 블록이나 해부 패드 위에 등을 대고 눕혀 고정합니다. 포셉과 가위로 복막의 외피를 절개합니다.
피부를 부드럽게 당겨 복강을 둘러싸고 있는 내측 피부를 노출시킵니다. 장기를 찌르지 않도록 주의하며 27 gauge 바늘을 복막으로 천천히 삽입합니다. 복강 내에 얼음처럼 차가운 PBS 5 mL를 주입합니다.
이제 복막을 부드럽게 마사지하여 세포가 복막벽에서 떨어져 PBS 용액으로 유입되도록 유도합니다. 그다음, 베벨(bevel) 부분이 위를 향하도록 25게이지 바늘을 장착한 5mL 시린지를 준비하여 바늘을 복막에 삽입합니다. 세포 회수율을 높이기 위해 가능한 한 많은 양의 액체를 수집하십시오.
이 과정을 수행하는 동안, 지방 조직이나 다른 장기가 바늘을 막지 않도록 팁을 부드럽게 움직여 주십시오. 바늘을 제거하고 세포 현탁액을 폴리프로필렌 수집 튜브에 비웁니다. 복막의 내피를 절개하여 체강에 남아 있는 액체를 수집하십시오.
포셉을 사용하여 피부를 벌린 상태에서 플라스틱 후방 피펫을 이용해 남은 액체를 모두 수집합니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 1500 RPM에서 8분 동안 원심 분리하고, 상층액을 제거한 후 세포를 5 mL의 PBS에 재현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.
트리판 블루 배제법(trypan blue exclusion)을 사용하여 세포 수를 결정할 수 있습니다. 일반적으로 조작되지 않은 마우스의 복강에서 500만에서 1,000만 개의 복강 세포를 분리할 수 있습니다. 전체 세포 집단의 50~60%는 B 세포입니다.
약 40%는 대식세포와 과립구이며, 5~10%는 T 세포가 될 것입니다. 지금까지 마우스의 복강 세포를 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 사용할 때는 마우스를 주의 깊게 안락사시키고 복강 내의 어떤 장기도 찌르지 않음으로써, 복강 세포 집단 내의 혈액량을 제한하는 것이 중요합니다.
혈액으로 오염된 샘플은 반드시 폐기하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.
개요
이 논문은 면역 반응 연구에 필수적인 마우스의 복강 세포 분리 방법에 대해 상세히 제시합니다. 본 절차는 후속 분석을 위해 세포 집단의 무결성을 보장하도록 설계되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 세포생물학
- 생화학
배경
- 복강에는 다양한 유형의 면역 세포가 존재합니다.
- 이러한 세포들은 선천 면역 반응에서 필수적인 역할을 합니다.
- 분리 방법은 기능적 및 생화학적 연구에 있어 매우 중요합니다.
- 이 세포들을 이해하는 것은 면역학 연구에 도움이 될 수 있습니다.
연구 목적
- 복강 세포를 분리하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 마우스 내 면역 세포 집단 연구를 용이하게 합니다.
- 후속 면역 분석의 정확도를 높입니다.
사용된 방법
- 마우스 안락사 및 해부 준비.
- 3% FBS가 포함된 PBS를 복강 내에 주입.
- 복강 세포가 포함된 액체 수집.
- 원심분리 및 분리된 세포 수 측정.
주요 결과
- 500만에서 1,000만 개의 복강 세포를 성공적으로 분리하였습니다.
- 분리된 세포의 50-60%가 B 세포임을 확인하였습니다.
- 약 40%는 대식세포와 과립구입니다.
- 세포의 5-10%는 T 세포입니다.
결론
- 이 방법은 복강에서 면역 세포를 분리하는 데 효과적입니다.
- 혈액 오염을 방지하기 위해 세심한 안락사와 해부가 매우 중요합니다.
- 이 절차는 다양한 면역학 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
복강 면역 세포를 분리하면 표현형이 정의된 B 세포 및 대식세포 하위 집합에 접근할 수 있어 초기 단계의 타겟 검증이 가능해집니다. 이는 기능적 분석을 위한 재현 가능한 일차 세포 입력을 제공함으로써 발굴 파이프라인에서의 기전적 위험 제거(de-risking)를 지원합니다. 이 방법은 면역 조절 약물 스크리닝과 관련된 면역 세포군을 표준화된 방식으로 회수함으로써 리드 화합물 식별의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 자가면역 및 감염 모델에서 치료 가설 검증을 위해 B1a 및 B1b 세포 하위 집단을 분석할 수 있게 합니다.
- 과학적 가치: 선천 면역 반응 연구에서 경로 규명을 위한 미분화 조직 상주 대식세포를 제공합니다.
- 운영적 가치: 타겟 결합 스크리닝을 위해 면역 세포군을 일관되게 분리함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 유세포 분석 및 생화학적 분석을 통한 표현형 분석을 위해 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 운용적 가치: 제어된 세포 수율(마우스당 5–10 million cells)을 통해 분석의 표준화와 재현성을 보장합니다.
- 운용적 가치: B 세포(50–60%), 대식세포(40%) 및 T 세포(5–10%)의 정량적 회수를 통해 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 자가 반응성 B1 세포 및 조절 IL-10 생성 서브셋을 분리함으로써 질병 관련 시스템 모델링을 지원합니다.
- 운용적 가치: 천연 IgM 분비 B1 세포의 분리를 통해 중개 바이오마커 정렬을 용이하게 합니다.
- 운용적 가치: 질병 모델에서 기전 후속 연구를 위한 일차 면역 세포를 제공하여 전임상 연속성을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 타겟 검증, 분석법 개발 및 전임상 기전 연구를 위한 일차 면역 세포를 제공함으로써 초기 발견 워크플로우에 통합됩니다.
- 발견 생물학: 정의된 B 세포 및 대식세포 하위 집단의 분리를 통해 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 세포 분리 및 생존 가능한 면역 세포군 회수를 통해 분석 준비 상태를 제공합니다.
- 분석: 혈구계수기 계수 및 생존율 배제법을 사용하여 세포 하위 집단의 정량적 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 자연 면역 및 조절과 연관된 B1 세포 분리를 통해 발견 단계와 전임상 검증을 연결합니다.
- 기업 내 재사용: 면역학 및 종양학 발견 프로그램 전반에서 면역 세포 공급원을 확보할 수 있는 재사용 가능한 역량을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 표현형이 특성화된 면역 서브셋에 대한 접근을 통해 타겟 검증의 예측 신뢰도 향상.
- 운영적 가치: 정의된 세포 수율 및 서브셋 분포를 통한 표준화 및 재현성 확보.
- 전략적 가치: 면역 조절제 스크리닝 시 기전적 모호성을 줄여 고/저(go/no-go) 결정 프로세스 개선.
- 포트폴리오 영향: 기능적 분석 패널을 위한 신뢰할 수 있는 일차 세포 입력을 통해 리스크 조정 우선순위 설정.
실행 시 고려 사항
- 장기 천공 및 혈액 오염을 방지하기 위해 마우스 해부 및 무균 조작 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 세포 처리 및 계수를 위해 주사기, 바늘, 원심분리기, 혈구계수기 등의 장비가 필요합니다.
- 일관성을 보장하기 위해 PBS/FBS 준비 및 콜드체인 취급에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 복강 내 세포 밀도를 변화시키는 질병 모델에 적용할 때 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 시료의 무결성을 저해하는 혈액 오염을 피하기 위해 세심한 안락사 및 해부가 필요하다는 제약이 있습니다.
