Name: 마우스 복막 구멍 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-28T16:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 배우세요 마우스 복막 구멍 세포 분리 방법으로 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용하세요. 이 기술은 B세포, 대식세포, 과립구, T세포를 정확하게 분리하여 다양한 면역 분석의 정확성을 높입니다.

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이 작품은 NIH 부여 AI069358 및 BloodCenter 연구 재단에 의해 부분적으로 지원되었다.

<ol><li> 프로세스를 시작하기 전에 다음 항목 수집 및 준비에 필요 : <ul><li> 얼음 </li><li> 27g 바늘로 5ml 주사기 </li><li> 25g 바늘로 5ml 주사기 </li><li> 스티로폼 블록 및 마우스를 장착을위한 핀 </li><li> 장착 블록 배치 수있는 트레이 </li><li> 가위와 집게 </li><li> 컬렉션 튜브 </li><li> 70 % 에탄올 </li><li> PBS로 3퍼센트 소태아 혈청 (FCS) (예약 얼음에 냉장 및 보관) </li></ul></li><li> 마우스를 안락사, 70 % 에탄올로 스프레이하고 뒷면에​​있는 스티로폼 블록에 탑재합니다. </li><li> 가위와 집게를 사용하면 복막의 바깥쪽 피부를 잘라 부드럽게 복막 구멍을 내벽 안쪽 피부를 노출 다시 가져옵니다. </li><li> 27g 바늘을 사용하여 복막 구멍에 얼음 차가운 PBS (3 % FCS 포함) 5 ML을 주사. 어떤 장기 조심하지 펑크로되는 복막에 천천히 바늘을 밀어. </li><li> 주입 후, 부드럽게 PBS 용액에 어떤 부착된 세포를 이동시키다하는 복막 마사지. </li><li> 복막에 5 ML의 주사기에 부착된, 25g 바늘, 베벨을 삽입하고 지방 조직이나 다른 기관에 의해 막히는 것을 방지할 수 부드럽게 바늘의 팁을 이동하면서 유체를 수집합니다. 가능한 한 많은 유체로 수집하고 주사기에서 바늘을 제거한 후에 얼음에 보관 튜브에 수집한 세포 현탁액을 입금. 옵션 : 4-6 단계를 반복 </li><li> 복막의 내부 피부에 절개를 만들고 포셉로 피부를 누른 상태 것은 구멍에서 남아있는 유체를 수집하는 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용합니다. </li><li> 단계에서 6, 7 볼 혈액 오염이 감지되면 다음 오염된 샘플을 폐기해야합니다. </li><li> 8 분 동안 1,500 RPM에서 수집된 세포 현탁액을 스핀 뜨는를 버리고 계산을 위해 원하는 미디어 또는 PBS에 세포를 resuspend. </li></ol> thioglycollat​​e를 얻는 다른 프로토콜 macrophages을 elicited : 이 방법은 macrophages 높은 수율을 얻을하는 데 사용됩니다. <ol><li> 3퍼센트 (W / V) 각 마우스의 복막 구멍에 브루어 thioglycollat​​e 미디어 (7) 5 ML을 주사. </li><li> 3~5일 기다려, 그리고 세포의 수집에 대한 위의 1 단계를 진행합니다. </li></ol> nonelicited 접근 방식에 비해 약 10 배 이상 macrophages가 수집하실 수 있습니다. 유일한 관심사는이 절차에 의해 얻은 macrophages 자신의 생리 특성의 일부가 다르다는 것입니다. 대표 결과 : unmanipulated 마우스, 5-10000000 복막 캐비티 세포는 좋은 격리 프로토콜로 구할 수 있습니다. 모든 생활 세포 가운데 50-60%는 B 세포 있으며, ~ 30 % macrophages 및 50~10%는 T 세포 (그림 1)입니다. <img src="/files/ftp_upload/1488/1488fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 복막 캐비티으로부터 격리 세포의 표현형. 복막 캐비티 세포들은의 다음과 같은 분리는 물들일되었습니다 방지 마우스 TCRβ - FITC, B220 - PE - 텍사스 빨강, CD11b 태평양 파랑, CD23 - PE - Cy7 및 CD5 - APC. 대표 흐름 cytometric 플롯은 B와 T 세포 (A), macrophages (B), B1과 B2 셀 (C)와 B1a 및 B1b 세포 (D)의 비율을 보여줍니다.

<ol><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2008).</li>
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<li>O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly-1+B+%28B-1%29+cells+are+the+main+source+of+B+cell+derived+interleukin+10%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10.</a> Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).</li>
<li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica%3A+Defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).</li>
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</ol>

복막 캐비티 세포의 격리는 다른 면역 세포, 주로 macrophages 및 구체적인 B 세포 하위 집합의 연구를위한 중요한 기술이다. 이 간단한 과정이지만, 관련된 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 수집된 샘플의 혈액을 오염의 존재는 순수 복막 캐비티 세포 인구를 얻을 피해야한다. 자궁 경부 전위에 의해 안락사는 복막에 고인 혈액 오염을 피하기 위해 신중하게 이루어져야합니다. 또는 CO 2를 사용할 수 있습니다. 또한, 프로 시저 적절한 치료 도중 복막 구멍에있는 방광이나 다른 장기 펑쳐링 않도록 주의해야한다. 주입 액의 대부분을 복구하면 세포 수율하는 것이 중요합니다. 이 절차는 널리 주민의 중간 번호부터 대식 세포 생물학을 연구하는 데 사용됩니다, unstimulated macrophages 쉽게 대식 세포 콜로니 자극 인자 (8을 사용하여 체외에서 성숙 macrophages에 골수양 전구 세포를 차별 힘드는 작업과는 달리, 복막 캐비티에서 얻을 수 있습니다 , 9). thioglycollat​​e 사용이 macrophages (7)의 생리적 특성을 변경할 수도 있지만 복막 캐비티에서 대식 세포 수율은 thioglycollat​​e의 이끌어 냄 메서드를 사용하여 향상시킬 수 있습니다. B 세포는 타고난과 적응 면역 모두에 중요한 역할을 우리 면역 체계의 중요한 부분입니다. 다른 B 세포 subpopulations 중에서 B1 세포는 타고난 면역, autoimmunity 및 면역 조절에 관여 B 세포의 고유한 하위 집합을 구성. B1 세포는 주로 복막 캐비티에 위치하고 있으며 자체 replenishing입니다. 그들은 바이러스의 번호와 박테리아 (10-12)에 대한 보호의 첫 번째 라인을 제공하고 자연 IgM의 주요 생산자 중 하나이다. B1 세포는 또한 면역 조절에 관여하는 중요한 시토킨는 IL - 10 (6)의 주요 원천입니다. 여러 연구가 B1 세포와 함께 추진되고 있지만, 아직 특별히 자신의 대조 기능을 추가로 평가를 위해 규제의 역할 범위가있다. 복막 캐비티 세포 분리 방법은 B1 세포의 기능을 연구하는 독특한 기회를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>티오글리콜레이트 배지, 브루어 수정형</td><td>BD Biosciences</td><td>211716</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 복막 구멍 세포의 분리

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

복막 구멍은 간, 비장, gastro - 창자 및 기타 내장의 대부분을 포함하고 포유류의 막 - 바운드와 유체 가득한 복강입니다. 그것은 macrophages, B 세포와 T 세포를 포함한 면역 세포의 숫자를 항구. 복막 캐비티에 순진한 macrophages 높은 숫자의 존재는 순진 조직 주민 macrophages (1)의 수집을 위해 선호하는 사이트를 만듭니다. 복막 캐비티도 있기 때문에 기존의 B2 셀에 이외에 지하 1 층 세포로 알려진 독특한 복막 캐비티 상주 B 세포 부분 집합의 존재의 B 세포의 연구에 중요합니다. B1 세포는 CD11b와 CD5의 표면 표현으로 구분할 수 B1a하고 B1b 세포로 세분화됩니다. B1 세포가 병원균 (2-4)의 다양한 초기 보호를 제공하는 자연 IgM의 중요한 소스입니다. 이러한 세포는 자연 (5)에 autoreactive 있지만, 그들이 autoimmunity을 방지하기 위해 관리하는 방법은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 반대로, CD5에<sup&gt; +</sup&gt; B1a 세포는 IL - 10 생산 용량 (6)을 가진 일부 규제 속성을 보유하고 있습니다. 따라서 복막 공동 B1 세포 때문에 그들의 다양한 기능과 개발 및 규제와 관련된 여러 unaddressed 질문 연구에 흥미로운 세포 인구입니다. 복막 캐비티 주민 면역 세포의 분리 때문에 복막 캐비티 내부에 정의된 구조의 부족 까다롭습니다. 우리 프로토콜은 다음 유동세포계측법에 의해 및 다른 생화 학적 및 면역 assays에 대한 phenotypic 분석을 위해 사용할 수있는 생쥐의 복막 캐비티에서 현실적인 면역 세포를 얻기위한 절차를 설명합니다.

포유류의 복막 캐비티는 타고난 면역 반응에 중요한 다른 면역 세포 인구가 포함되어 있습니다. 효율적인 분리 방법은 이러한 세포의 생화 학적 및 기능적 분석이 필요합니다. 여기서 우리는 마우스의 복막 공동 세포의 격리를위한 포괄적인 방법을 제공합니다.

복강은 포유류의 막으로 둘러싸여 있고 액체로 채워진 복부 강으로, 간, 비장 및 대부분의 위장관을 포함하고 있습니다.

복강 세포의 분리는 안락사시킨 마우스를 등으로 눕혀 고정하는 것으로 시작합니다. 복막의 외피를 절개하고 조심스럽게 젖혀 내피를 노출시킵니다. 3% FBS가 포함된 PBS를 복강 내에 주입하고 복막을 부드럽게 마사지합니다. 복강 세포가 포함된 액체를 수집하여 얼음 위에 놓인 15 milliliter 튜브에 담습니다.세포를 한 번 세척한 후 헤모사이토미터(hemo cytometer)로 수를 측정합니다. 안녕하세요, 저는 위스콘신 혈액 센터 혈액 연구소의 Dr.Bon 실험실 소속 Oji입니다. 오늘은 마우스의 복강에서 세포를 분리하는 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 다양한 표현형, 생화학 및 면역학적 분석에 사용할 세포를 얻기 위해 이 절차를 사용합니다. 주로 저희는 복강 B 세포 집단에 관심을 두고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.복강에서 면역 세포를 분리하기 시작하기 전, 필요한 모든 재료를 준비하십시오. 먼저 아이스 버킷, 27 gauge 바늘이 장착된 5 mL 시린지, 25 gauge 바늘이 장착된 5 mL 시린지, 스티로폼 블록, 그리고 마우스 고정용 핀을 준비합니다. 해부 전, 고정 블록을 받칠 트레이, 가위, 포셉 및 수집 튜브를 준비하십시오.3% fetal calf serum가 포함된 PBS를 미리 냉각합니다. 마취제 투여 및 적절한 안락사 후, 실험 전 과정 동안 이를 수집 튜브와 함께 얼음 위에 보관하십시오. 마우스에 70% ethanol을 분무하고 스티로폼 블록이나 해부 패드 위에 등을 대고 눕혀 고정합니다. 포셉과 가위로 복막의 외피를 절개합니다.피부를 부드럽게 당겨 복강을 둘러싸고 있는 내측 피부를 노출시킵니다. 장기를 찌르지 않도록 주의하며 27 gauge 바늘을 복막으로 천천히 삽입합니다. 복강 내에 얼음처럼 차가운 PBS 5 mL를 주입합니다.이제 복막을 부드럽게 마사지하여 세포가 복막벽에서 떨어져 PBS 용액으로 유입되도록 유도합니다. 그다음, 베벨(bevel) 부분이 위를 향하도록 25게이지 바늘을 장착한 5mL 시린지를 준비하여 바늘을 복막에 삽입합니다. 세포 회수율을 높이기 위해 가능한 한 많은 양의 액체를 수집하십시오.이 과정을 수행하는 동안, 지방 조직이나 다른 장기가 바늘을 막지 않도록 팁을 부드럽게 움직여 주십시오. 바늘을 제거하고 세포 현탁액을 폴리프로필렌 수집 튜브에 비웁니다. 복막의 내피를 절개하여 체강에 남아 있는 액체를 수집하십시오.포셉을 사용하여 피부를 벌린 상태에서 플라스틱 후방 피펫을 이용해 남은 액체를 모두 수집합니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 1500 RPM에서 8분 동안 원심 분리하고, 상층액을 제거한 후 세포를 5 mL의 PBS에 재현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.트리판 블루 배제법(trypan blue exclusion)을 사용하여 세포 수를 결정할 수 있습니다. 일반적으로 조작되지 않은 마우스의 복강에서 500만에서 1,000만 개의 복강 세포를 분리할 수 있습니다. 전체 세포 집단의 50~60%는 B 세포입니다.약 40%는 대식세포와 과립구이며, 5~10%는 T 세포가 될 것입니다. 지금까지 마우스의 복강 세포를 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 사용할 때는 마우스를 주의 깊게 안락사시키고 복강 내의 어떤 장기도 찌르지 않음으로써, 복강 세포 집단 내의 혈액량을 제한하는 것이 중요합니다.혈액으로 오염된 샘플은 반드시 폐기하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

이 비디오에서는 수확된 마우스 Peyer's patch에서 림프구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 림프구는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer's Patch

이 비디오는 성체 마우스의 복막강에서 성숙한 결합 조직형 비만 세포를 분리하기 위한 복막 세척 방법을 보여줍니다. 복막강에서 1차 면역 세포의 혼합물을 분리한 후, 적절한 배양 조건에서 비만 세포의 선택적 증식을 수행합니다.

쥐 복막강에서 일차 비만 세포를 분리하는 기술

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

여기서는 쥐 복막 대식세포를 분리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 절차 다음에는 RNA 추출을 수행하여 Toll-like receptor 자극에 대한 유전자 발현 분석을 수행합니다.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

Enterochromaffin (EC) 셀 위장 상피 세포의 작은 하위 집합으로 구성 됩니다. EC 셀 전기 고르기가 고 아직 경작 하 고 EC 셀 식별 어려움 생리 연구 제한 세로토닌을 출시. 여기에 제시 된 방법 전기 생리학에 의해 의무가 단일 EC 셀의 기본 문화 모델을 설정 합니다.

기본 교양된 Murine Enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

여기에서 우리는 텔로세포를 포함한 쥐의 장 중간엽을 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이들은 마우스 또는 인간 유래 오가노이드와의 공동 배양과 같은 여러 응용 분야에 사용하여 성장을 지원하고 원래 조직의 상황을 더 잘 반영할 수 있습니다.

쥐 장 중간엽의 분리로 텔로세포의 높은 수율

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

배우세요 마우스 복막 구멍 세포 분리 방법으로 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용하세요. 이 기술은 B세포, 대식세포, 과립구, T세포를 정확하게 분리하여 다양한 면역 분석의 정확성을 높입니다.

마우스 복막 구멍 세포의 분리

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