Lentivirus 제작

이 절차는 2 9 3 T 세포를 렌티바이러스, 플라스미드 및 바이러스 패키징 벡터로 transection하는 것으로 시작되며, 바이러스 상등액은 최소 48시간의 배양 기간 후에 수확됩니다. snat는 초원심분리 후 초원심분리기로 농축되도록 여과됩니다. 바이러스 펠릿을 PBS로 재현탁시켜 바이러스 역가를 얻고, 먼저 농축된 바이러스를 완전한 배지에서 희석한 다음 연속 희석을 수행하여 세포를 렌티바이러스로 감염시킵니다.

안녕하세요, 저는 샌프란시스코 캘리포니아 대학교 당뇨병 센터의 마이클 맥마너스 연구실의 셰인 웡입니다. 저는 마이클 맥마너스입니다. 오늘은 렌티바이러스 생산 절차를 소개해 드리겠습니다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 RNA 간섭에 대한 렌티바이러스를 만듭니다. 시작하겠습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 2 9 3 T 세포를 transfection할 DNA를 준비합니다.

먼저 30 마이크로리터 Fuji six와 600 마이크로리터 무혈청 배지를 혼합하여 1.5 밀리리터 튜브에 FU gene six transfection 시약을 희석합니다. Fuji를 5분 동안 매체 배양 실온으로 전달할 때 튜브 측면에 Fuji가 닿지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 튜브의 캡에 4마이크로그램의 렌티바이러스 플라스미드와 1.33마이크로그램을 혼합합니다.

각 3세대 바이러스 패키징 벡터. 렌티바이러스 플라스미드에는 DNA가 포함되어 있습니다. 바이러스는 모든 세포의 게놈에 삽입되어 감염되며, 포장 벡터에는 렌틸콩 바이러스가 뚜껑을 닫고 튜브를 몇 번 뒤집어 혼합하는 데 필요한 다른 모든 단백질에 대한 유전자가 포함되어 있습니다.

DNA와 transfection 시약을 실온에서 15-20분 동안 배양합니다. 이제 2 9 3 세포를 준비한 DNA로 transfection할 때입니다: 24시간 전에 도금하고 조직 배양 후드에서 50-70% co의 유창성에 도달한 세포를 준비한 모든 DNA를 플레이트를 앞뒤로 기울여 부드럽게 혼합된 2 9 3 플레이트에 피펫팅합니다. 세포를 인큐베이터로 되돌리고 수확 전 48-96시간 동안 바이러스 생산이 계속되도록 합니다. 배양 과정에서 2, 9, 3 세포는 렌티바이러스를 생성하며, 렌티바이러스의 게놈에는 관심 DNA의 RNA 사본이 포함되어 있습니다.

이제 바이러스를 수집할 때입니다. 인큐베이터에서 세포를 꺼냅니다. 조직 배양 후드에 0.4 또는 5미크론 주사기 필터, 일회용 10ml 주사기 및 UltraClear Beckman 원심분리기 튜브를 준비하십시오.

일회용 주사기를 사용하여 바이러스가 들어있는 상층액을 제거하십시오. 0.45미크론 주사기 필터를 팁에 부착하고 바이러스를 UltraClear Beckman 원심분리 튜브로 여과합니다. 필터는 세포가 아닌 바이러스만 통과시킨 후 폐기하고 모든 바이러스 생성 세포를 배양합니다.

배양 플레이트, 주사기 및 필터를 10% 표백제에 45분 동안 넣습니다. 바이러스를 수집하고 걸러냈으니 이제 먼저 초원심분리로 바이러스를 농축할 차례입니다. 무혈청 DMEM을 사용하여 바이러스를 포함하는 모든 튜브의 간격을 서로 0.2g 이내로 균형을 잡습니다.

다음으로, 밸런스 조정된 원심분리기 튜브를 SW 41 TI 또는 SW 28 로터 버킷에 로드합니다. 로터 버킷을 밀봉하여 닫고 로터에 걸어 넣습니다. 그런 다음 로터를 초원심분리기 내부에 놓습니다.

SW 41 TI 로터에서 섭씨 4도, 25, 000RPM, SW 28 로터에서 24, 000RPM으로 약 90분 동안 바이러스를 회전시킵니다. 원심분리 후 조직 배양 후드로 돌아가 튜브를 뒤집어 10% 표백제가 들어있는 용기에 SNAT를 붓습니다. Kim 와이프를 사용하여 펠릿 주변의 과도한 액체를 흡수하고 펠릿을 다시 현탁시킬 준비가 될 때까지 5분 이상 편리한 랙에서 튜브를 뒤집습니다.

바이러스 펠릿을 재현탁시키려면 필터 팁을 사용하여 100마이크로리터의 사전 여과된 멸균 PBS를 튜브에 추가합니다. 그런 다음 약 20 회 위아래로 피펫을 만듭니다. 하룻밤 동안 바이러스를 4도로 두면 완전히 부유할 수 있습니다.

바이러스 조제제는 4도에서 약 1주일 동안, 영하 80도에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 모든 빈 튜브는 버리기 전에 10% 표백제로 처리하는 것을 잊지 마십시오. 바이러스 제제를 일주일 이상 사용할 계획이라면 냉장고에 보관합니다.

향후 실험을 위해 5 - 20 마이크로리터의 최소 부분 표본을 만들고 적정 동결을 위해 3 - 5 마이크로리터의 부분 표본 1개를 만들고 약 마이너스 80에서 부분 표본을 보관합니다. 다음 단계는 바이러스 역가를 측정하는 것입니다. 렌티바이러스 플라스미드에 형광 리포터 유전자를 포함시킨 경우, 감염된 세포는 형광을 발하고 유세포 분석을 사용하여 바이러스 역가를 측정할 수 있습니다.

먼저 3마이크로리터의 농축된 바이러스를 웰에서 1-6개의 완전한 배지 1.5ml로 희석합니다. 96 웰 플레이트의 단일 행에서. 100마이크로리터의 완전한 DM.To 6개의 웰 모두에 대해 다음과 같은 연속 희석을 수행한 첫 번째 웰에 바이러스가 없는 100마이크로리터의 배지를 추가합니다.

이것은 당신의 더럽혀지지 않은 통제입니다. 두 번째에 희석 된 바이러스 100 마이크로 리터를 세 번째에 첨가하십시오. 글쎄, 두 번째 우물에서 네 번째 우물까지 100 마이크로 리터의 혼합물을 추가하십시오.

세 번째 우물에서 다섯 번째 우물로 100 마이크로 리터를 추가하십시오. 네 번째 우물에서 여섯 번째 우물에 100 마이크로 리터를 추가하십시오. 다섯 번째에서 100 마이크로 리터를 추가하십시오.

마지막으로 여섯 번째 우물에서 100마이크로리터를 꺼내 버리고 표백제를 사용하여 DMEM으로 모든 우물의 총 부피를 200마이크로리터로 만듭니다. 희석할 때마다 바이러스 농도가 절반으로 감소합니다. 이는 제안된 희석액일 뿐이며, 대부분의 농축된 바이러스를 적정하는 데 효과적입니다.

바이러스의 역가가 낮거나 농축되지 않은 경우 희석량을 조정해야 할 수 있습니다. 사용하지 않은 희석된 바이러스는 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리기 전에 45분 동안 10% 표백제로 처리합니다. 대략 15, 000의 건강한 활발하게 6개의 우물의 각각에 2개의 9개의 3개의 T 세포를 분할하는 추가하십시오.

단일 96 웰 플레이트를 사용하여 16개의 바이러스 분취제를 역가하고, 웰을 200마이크로리터로 채우고, 세포를 인큐베이터로 되돌리고, 최소 48시간 동안 감염이 진행되도록 할 수 있습니다. 배양 후 유세포 분석기를 사용하여 세포 형광을 분석합니다. 웰당 형광 세포의 백분율을 사용하여 추가된 바이러스의 밀리리터당 감염성 바이러스 입자의 수 또는 역가를 결정할 수 있습니다.

흐름을 해석할 때 다음 공식을 사용하여 밀리리터당 감염 단위 수를 계산합니다. 세포분석기 결과. 감염된 세포가 세포당 하나 이상의 바이러스 통합을 받지 않은 경우에만 정확한 역가 계산을 달성할 수 있습니다.

이 경우 감염률이 15% 미만인 셀을 계산에 사용하십시오. 감염률이 높은 세포는 세포당 여러 개의 바이러스 인테그르를 투여받았을 가능성이 높습니다. 2단계에서 제안한 희석으로 이 감염 범위 내에서 여러 샘플이 생성되어야 합니다.

이상적으로는 여러 샘플을 사용하여 최종 titer를 계산할 수 있는 적정 플롯을 생성하는 것이 좋습니다. 피팅된 선형 선의 계산된 공식을 사용하여 바이러스 역가를 계산할 수 있지만 필요한 경우 단일 표본을 사용하여 역가를 계산할 수 있습니다. 비농축 바이러스의 경우 밀리리터당 7번째 형질주입 단위의 10배, 농축된 바이러스의 경우 밀리리터당 10에서 8번째 형질주입 단위의 10배의 역가를 기대할 수 있습니다.

지금까지 이 과정을 수행할 때 렌티바이러스를 생성하는 방법을 보여드렸습니다. 모든 생물 안전 규정을 준수하고 폐기물을 적절하게 처리하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.