Name: Lentivirus 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 학습하세요 293T 세포를 이용한 렌티바이러스 제작 방법을. DNA 벡터 전사, 바이러스 상청액 수확, 형광 발현을 통한 바이러스 역가 측정까지 포함된 효율적인 유전자 전달 기술입니다.

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샌들러 천식 기초 연구 센터 (세이버) 샌들러 재단

1 부 : Lentiviruses 생산 HEK 293 세포의 Transfection * 24시간 50~70% 다음날의 confluency에 10cm 접시에 transfection, 플레이트 2.5 X 10 6 세포 전에. <ol><li> 하나는 나중에 바이러스를 하나의 세포를 transfect 것입있는 DNA를 준비하여이 절차를 시작합니다. 첫째, FuGENE 6 Transfection 시약 로체, 세포가 DNA를 잡으 지질 시약을 희석. 1.5 ML 튜브에 피펫 30μl FuGENE 6 600ul 혈청없는 매체로 (SFDMEM). 그것이 매체에 전달로 FuGENE은 튜브의 측면을 건드리지 못하게하는주의하십시오. 이 FuGENE 5 분 실온에서 SFDMEM 믹스와 부화하자. </li><li> 튜브의 뚜껑에서 4 μg 각 제 3 세대 바이러스성 포장 벡터 (pMDL, pRSV 및 pVSV - G)와 플라스미드 lentiviral 4 μg를 섞는다. lentiviral 플라스미드는 DNA 포장 벡터가 lentivirus하기 위해 필요한 다른 모든 단백질에 대한 유전자를 포함하는 동안 바이러스가, 그것이 감염 모든 세포의 게놈에 삽입됩니다 포함되어 있습니다. </li><li> 반전 튜브 몇 배 뚜껑과 믹스를 닫습니다. </li><li> 실온에서 15-20분을 품어. </li><li> 293 판에 튜브의 피펫 전체 내용. 앞뒤로 기울이기 판으로 가볍게 섞는다. </li><li> 인큐베이터에 세포를 반환하고 바이러스 생산 수확하기 전에 48~96시간 위해 계속하실 수 있습니다. </li><li> 부화 기간 동안, 293 세포는 lentiviral 구조의 RNA 사본을 만드는, lentiviral 플라스미드에서 관심의 DNA를 고쳐 쓰다. 그들은 또한 녹음 및 바이러스 단백질로 포장 벡터의 유전자를 번역. 이 단백질은 바이러스가 녹음을 반대하고 감염의 모든 세포의 genomes에 삽입합니다 귀하의 lentiviral 구조의 RNA의 버전을 포함하는 바이러스를 만들기 위해 진행합니다. </li></ol> 2 부 : Lentiviral 하베스트 <ol><li> 잠복기 후, 배양기의 세포를 가지고 이제 바이러스를 포함하는 표면에 뜨는를 제거하는 일회용, 10ml의 주사기를 사용합니다. 뜨는의 약 10ml있을 것입니다. </li><li> 팁에 0.45μM 주사기 필터를 부착하고 베크맨 초원 심 분리기 튜브에 바이러스를 필터링합니다. 필터는 바이러스를 허용하고, 세포는 통과하지 않습니다. </li><li> 폐기하기 전에 모든 바이러스 생산 세포를 품어, 문화 접시, 주사기 45 분 10 % 표백제에 필터. </li></ol> 파트 3 : Ultracentrifugation 통해 Lentiviral 농도 <ol><li> SW - 41Ti 또는 SW - 28 로터 버킷으로 원심 분리기 튜브를로드합니다. </li><li> 모든 바이러스를 포함하는 균형을 0.2g 이내로 튜브를 혈청이없는 DMEM을 사용합니다. </li><li> 초원 심 분리기 내부 회전자를 배치하기 전에 로터 양동이 안으로 들어가서 로터에 그들을 연결 인감 </li><li> 4 초원 심 분리기 90 분 동안 바이러스를 스핀 ° SW - 41Ti 로터에서 25,000 rpm 또는 SW - 28 로터에서 24,000 rpm으로 C. </li><li> 조직 문화 후드에서 10 % 표백제가 들​​어있는 용기에 뜨는 잔을 거꾸로 튜브를 반전. </li><li> 펠렛 주위에 여분의 액체를 흡수하고 5 분 더 이상 편리한 랙에 튜브를 반전하는 Kimwipe을 사용합니다. </li><li> 바이러스 펠렛을 다시 중지하려면 20 시간을 아래 피펫 후, 튜브 100 μL 멸균 PBS를 추가하는 필터 팁을 사용합니다. </li><li> 4 바이러스를 남겨 ° C 다시 중단을 완료 하룻밤. 하나는 약 1 주일 동안 최대 1 년 정도에 대해 -80 4 도에 바이러스 preps를 저장할 수 있습니다. 폐기하기 전에 10 %의 표백제 모든 빈 튜브를 치료해야합니다. </li><li> 한 일주 이상에 대한 바이러스 준비를 사용하고자하는 경우, 적정에 대한 5μl 미래의 실험 3 1 나누어지는 5 - 20μl의 최소 aliquots합니다. 고정 및 마이너스 80 aliquots를 저장합니다. </li></ol> 4 부 : 유동세포계측법 사용 Lentiviral 적정 <ol><li> 다음 단계는 유동세포계측법하여 바이러스 titer를 결정하는 것입니다. 이 방법은 lentiviral 플라스미드는 형광 리포터 유전자를 포함 경우에 작동합니다. 아이디어는 바이러스가 세포를 감염 때, 그 세포의 게놈에 lentiviral 플라스미드 DNA를 도입한다는 것입니다. 감염된 세포는 다음 녹음 및 lentiviral 플라스미드에 포함 유전자를 번역하고 형광 리포터 유전자를 포함하는 경우, 감염된 세포는 형광 것이다. 형광의 수준은 바이러스의 힘, 또는 titer를 나타냅니다. </li><li> 각각의 바이러스 재고가 titered하기 위해서는, 전체 미디어 1.5 ML (DMEM, 펜 - strep, 글루타민, FBS)에 집중 바이러스 3 μl를 희석. </li><li> 96 잘 접시의 단일 행에 우물 1-6에서는 다음과 같은 일련 dilutions을 수행 완료 DMEM 미디어 100 μl를 추가할 모든 6 웰스 수 있습니다. 좋지 100 μl를 추가합니다 물론 두 번째로 (이것은 당신의 흠없는 컨트롤)없이 바이러스와 미디어 100μl를 추가 세번째로 희석 바이러스 100 μl를 (undiluted 바이러스의 상당 to1 ML되는) 추가 먼저물론 두 번째의 혼합의, 잘 잘 다섯 번째로, 잘 3에서 100 ML을 추가할 잘 4 우물에서, 그리고 여섯 번째에 100μl를 추가합니다 물론 5에서 100 μl를 추가 네번째 수 있습니다. 마지막으로 6 자 밖으로 100ul을 가지고 표백제로 폐기. 각 물론 그 전에 한에 비해 바이러스의 절반 볼륨을 가지고 어디에 시리얼 희석이 수행되었다. </li><li> 200μl의 모든 우물에서 전체 볼륨을 가져와. 이들이 가장 집중적으로 바이러스를 titering 위해 잘 작동해야만이 제안 dilutions,됩니다. 바이러스 titer에서 낮은, 또는 unconcentrated 경우 하나는 dilutions을 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 생물 학적 폐기물 용기에 폐기하기 전에 45 분 동안 10 % 표백제와 함께 사용하지 않은 희석 바이러스를 처리합니다. </li><li> 6 우물 각 ~ 15,000 건강한 적극적으로 나누어 293 세포를 추가합니다. 단일 96 - 웰 플레이트는 16 바이러스 preps을 titer하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 5 % CO로 37 정도의 배양기에 세포를 반환 2 감염이 최소 48 시간 동안 진행하실 수 있습니다. </li><li> 부화 후, 세포는 흐름 cytometer와 함께 기자의 표현 (우리의 경우 형광의)에 대한 분석입니다. 바이러스성 입자가 잘마다 형광 세포의 퍼센트 quantitated 있습니다. </li></ol> 다음 수식과 ML 당 전염성 단위의 개수를 계산 : <div style="text-align:center;"> (# 감염 X 기자 긍정적인 세포의 날에 잘 당 세포) X 1000 ______________________________________________________ 벡터의 ML이 잘 추가 </div> 제 5 부 : 대표 결과 : 48 시간 잠복기 게시물 transfection 후, 293 세포의 플레이트는 90 % 정도 형광등에 있어야한다. 형광 세포의 비율이 높으면 바이러스 생산 세포의 높은 비율을 나타냅니다. resuspending 때 원심 분리 후, 바이러스 펠렛 겨우 볼 수 있습니다. 펠렛은 투명하고 아주 작은므로 이것은 정상입니다. 세포 세포마다 한 병 이상은 안된다 바이러스 통합을받은 (형광) 감염 때 하나에만 정확한 titer 계산을 달성할 수있는 흐름 cytometer 결과를 해석, 적어 둡니다. 이 경우되도록하기 위해, 계산을위한 &lt;15 % 감염 속도 세포를 사용합니다. 높은 감염률과 세포는 가능성이 세포마다 여러 바이러스 integrants을 받았습니다. 2 단계에서 제안 dilutions는 감염의 범위 내에서 몇 가지 샘플을 얻을 것입니다. 이상적으로, 당신이 마지막 titer를 계산 할 수있는 적정 계획 (선형 라인)을 생성하는 몇 가지 샘플을 사용하지만, 필요하다면 당신은 하나의 샘플을 사용하여 titer를 계산하실 수 있습니다. 하나는 기대할 수 titer 1.0 X 10 7 TU / 취소 집중 바이러스 ML 및 1.0 X 10 8 농축 바이러스 TU / ML.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM, HEK 293T 세포, 페니실린-스트렙토마이신, 글루타민, 인산염 완충 식염수(PBS), FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 transfection 시약, pSico mCherry, pMDL, pRSV, pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-cm 세포 배양 접시, 96웰 세포 배양 접시</td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 파이펫</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 파이펫 팁</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Eppendorf 튜브, 주사기, 주사기 필터 (0.45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심분리 튜브</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 조직 배양 인큐베이터</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41T.I 로터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirus 제작

Lentivirus Production

RNA 간섭 (RNAi)은 살아있는 세포에서 유전자 입을의 시스템입니다. RNAi에 유전자가 상동 짧은 간섭 RNAS을 순서대로 (siRNA) 포스트 transcriptional 상태에서 침묵하고 있습니다. 짧은 헤어핀 RNAS, siRNA에 엽 성의 전구 물질은 세포 유형의 다양한 RNAi 수있게 lentivirus을 사용하여 표현할 수있다. 같은 인간 면역 결핍 바이러스로 Lentiviruses는, 세포를 분리 및 비 분리를 모두 감염을 수 있습니다. 우리는 어떤 패키지 lentiviruses에 절차를 설명합니다. 포장은 DNA 벡터에서 관할 바이러스의 준비를 말합니다. Lentiviral 벡터 생산 시스템은 자연의 바이러스 게놈은 개인 도우미 플라스미드 구조로 분할되어 &#39;분할&#39;시스템을 기반으로합니다. 네 별도의 벡터로 다른 바이러스 요소의 분할은 lentiviral 게놈의 우발적인 재조합에 의한 복제 가능 바이러스를 생성의 위험을 감소. 여기, 관심을 세 포장 벡터의 shRNA (P - VSVG, pRSV, pMDL)를 포함하는 벡터가 transiently 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 최소한 48 시간 잠복기 후, 바이러스가 포함된 뜨는은 수확과 집중되어 있습니다. 마지막으로, 바이러스 titer는 기자 (형광) 흐름 cytometer와 표현에 의해 결정됩니다.

lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.

Lentivirus 제작

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 살아있는 세포 내의 유전자 침묵 시스템입니다. RNAi에서는 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)와 서열이 상동인 유전자가...

본 절차는 lentivirus, 플라스미드 및 바이러스 패키징 벡터를 사용하여 2 9 3 T 세포를 형질전환하는 것으로 시작하며, 최소 48시간의 배양 기간 후에 바이러스 상청액을 수집합니다. 수집된 상청액은 필터링한 후 초원심분리기를 사용하여 농축합니다. 바이러스 펠렛을 PBS로 재현탁하여 바이러스 역가를 구하며, 먼저 농축된 바이러스를 완전 배지에 희석한 다음, 단계별 희석을 수행하여 lentivirus로 세포를 감염시킵니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스 당뇨병 센터의 Michael McManus 연구실 소속 Shein Wong입니다. 저는 Michael McManus입니다. 오늘은 렌티바이러스 제작 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 RNA 간섭을 위한 렌티바이러스를 제작하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 이 프로토콜을 시작하려면, 2 9 3 T 세포에 트랜스펙션할 DNA를 준비하십시오.먼저 1.5 mL 튜브에 Fuji six transfection 시약 30 µL와 무혈청 배지 600 µL를 혼합하여 희석합니다. 시약을 배지에 넣을 때 Fuji six가 튜브 벽면에 닿지 않도록 주의하며, 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 튜브 캡에 렌티바이러스 플라스미드 4 µg과 1.33 µg을 혼합합니다.각각의 3세대 바이러스 패키징 벡터입니다. 렌티바이러스 플라스미드는 DNA를 포함하고 있습니다. 바이러스는 감염시키는 모든 세포의 게놈에 삽입되며, 패키징 벡터는 렌티바이러스를 만드는 데 필요한 다른 모든 단백질에 대한 유전자를 포함합니다. 뚜껑을 닫고 튜브를 몇 번 뒤집어 섞어줍니다.DNA와 transfection 시약을 상온에서 15~20분 동안 배양합니다. 이제 준비된 DNA를 2 9 3 세포에 transfection할 차례입니다. 24시간 전에 플레이팅하여 조직 배양 후드 내에서 50~70%의 confluence에 도달한 세포를 사용하십시오. 준비된 모든 DNA를 2 9 3 플레이트에 피펫으로 분주하고, 플레이트를 앞뒤로 천천히 기울여 부드럽게 혼합합니다. 세포를 인큐베이터로 옮겨 수확 전까지 48~96시간 동안 바이러스 생산이 계속되도록 합니다. 배양 과정 동안 2 9 3 세포는 관심 DNA의 RNA 복사본을 게놈으로 포함하는 렌티바이러스를 생성합니다.이제 바이러스를 수집할 차례입니다. 인큐베이터에서 세포를 꺼내십시오. 조직 배양 후드 안에 0.4 또는 5 micron 시린지 필터, 일회용 10 milliliter 시린지, 그리고 UltraClear Beckman 원심분리 튜브를 준비해 두십시오.일회용 주사기를 사용하여 바이러스가 포함된 상층액을 제거합니다. 주사기 끝에 0.45 micron 주사기 필터를 장착하고 바이러스를 UltraClear Beckman 원심분리관에 여과하여 옮깁니다. 이 필터는 세포는 걸러내고 바이러스만 통과시키며, 이후 바이러스 생성 세포를 모두 폐기하고 배양합니다.배양 플레이트, 주사기 및 필터를 10% bleach에 45분 동안 담가 소독합니다. 바이러스를 수집하고 필터링했으므로, 이제 초원심분리를 통해 바이러스를 농축해야 합니다. serum free DMEM을 사용하여 바이러스가 포함된 모든 튜브의 무게 차이가 0.2 grams 이내가 되도록 맞춥니다.다음으로, 균형을 맞춘 원심분리관을 SW 41 TI 또는 SW 28 로터 버킷에 넣습니다. 로터 버킷을 밀폐한 후 로터에 고정합니다. 그런 다음 로터를 초원심분리기에 넣습니다.SW 41 TI 로터의 경우 25,000 RPM, SW 28 로터의 경우 24,000 RPM으로 4°C에서 약 90분 동안 바이러스를 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 조직 배양 후드로 돌아와 튜브를 뒤집어 SNAT를 10% 표백제가 들어 있는 용기에 붓습니다. Kim wipe를 사용하여 펠렛 주변의 과잉 액체를 흡수하고, 펠렛을 재부유시킬 준비가 될 때까지 편리한 랙에 튜브를 뒤집어 놓되 5분을 넘기지 않도록 합니다.바이러스 펠렛을 재부유시키려면, 필터 팁을 사용하여 튜브에 멸균 여과된 PBS 100 microliters를 첨가하십시오. 그다음 피펫팅을 약 20회 반복합니다. 재부유가 완전히 이루어지도록 바이러스를 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.바이러스 준비물은 4°C에서 약 일주일 동안, -80°C에서 최대 1년까지 보관할 수 있습니다. 모든 빈 튜브는 폐기 전 10% 표백제로 처리해야 함을 유의하십시오. 바이러스 준비물을 일주일 이상 사용할 계획이라면 냉장고에 보관하십시오.향후 실험을 위해 5~20 µL의 소량 분주액을 여러 개 만들고, 적정(titration)을 위해 3~5 µL의 분주액을 하나 만든 후, 분주액들을 약 -80 °C에서 보관하십시오. 다음 단계는 바이러스 역가(viral titer)를 결정하는 것입니다. 렌티바이러스 플라스미드에 형광 리포터 유전자를 포함시킨 경우, 감염된 세포에서 형광이 나타나므로 유세포 분석법(flow cytometry)을 사용하여 바이러스 역가를 결정할 수 있습니다.먼저, 96-웰 플레이트의 한 행에 있는 1번부터 6번 웰에 각각 1.5 milliliters의 완전 배지를 넣고, 여기에 농축된 바이러스 3 microliters를 희석합니다. 100 microliters의 완전 DM을 사용하여 6개 모든 웰에 대해 다음과 같이 연속 희석을 수행합니다. 첫 번째 웰에는 바이러스가 포함되지 않은 배지 100 microliters를 추가합니다.이것은 염색하지 않은 대조군입니다. 두 번째 웰에는 희석된 바이러스 100 µL를 첨가합니다. 세 번째 웰에는 두 번째 웰의 혼합물 100 µL를 네 번째 웰에 첨가합니다.세 번째 웰에서 다섯 번째 웰로 100 µL를 추가합니다. 네 번째 웰에서 여섯 번째 웰로 100 µL를 추가합니다. 다섯 번째 웰에서 100 µL를 추가합니다.마지막으로 여섯 번째 웰에서 100 µL를 취해 폐기하고 표백 처리합니다. 그 후 모든 웰의 총 부피가 200 µL가 되도록 DMEM을 추가합니다. 희석을 거듭할 때마다 바이러스 농도는 절반으로 감소합니다. 참고로 이는 권장 희석 배수로, 대부분의 고농도 바이러스 역가 측정에 적합합니다.바이러스의 역가가 낮거나 농축되지 않은 경우, 희석 배수를 조정해야 할 수도 있습니다. 사용하지 않고 남은 희석 바이러스는 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리기 전 10% bleach로 45분 동안 처리하십시오. 6개의 웰 각각에 건강하게 활발히 분열하는 2 9 3 T 세포 약 15, 000개를 첨가합니다.단일 96웰 플레이트를 사용하여 16종의 바이러스 준비물을 적정할 수 있으며, 각 웰의 부피를 200 µL까지 채운 뒤 세포를 인큐베이터로 옮겨 최소 48시간 동안 감염이 진행되도록 합니다. 배양 후, 유세포 분석기를 사용하여 세포 형광을 분석합니다. 웰당 형광 세포의 백분율을 이용하여 적정가 또는 첨가된 바이러스 1 mL당 감염성 바이러스 입자 수를 결정할 수 있습니다.유세포 분석기 결과를 해석할 때 다음 공식을 사용하여 밀리리터당 감염 단위 수를 계산하십시오. 감염된 세포당 바이러스 통합이 1회 이하로 이루어진 경우에만 정확한 역가 계산이 가능하다는 점에 유의하십시오.이를 확실히 하기 위해, 계산 시 감염률이 15% 미만인 세포를 사용하십시오. 감염률이 더 높은 세포는 세포당 여러 개의 바이러스가 통합되었을 가능성이 큽니다. 2단계에서 제안한 희석법을 사용하면 이 감염 범위 내에 있는 여러 샘플을 얻을 수 있을 것입니다.이상적으로는 여러 개의 샘플을 사용하여 최종 타이터를 계산할 수 있는 적정 곡선을 생성하십시오. 피팅된 직선의 계산식을 사용하여 바이러스 타이터를 산출할 수 있으나, 필요한 경우 단일 샘플을 사용하여 타이터를 계산할 수도 있습니다. 농축되지 않은 바이러스의 경우 mL당 1 × 10⁷ transducing units의 타이터를, 농축된 바이러스의 경우 mL당 1 × 10⁸ transducing units의 타이터를 기대할 수 있습니다.지금까지 이 절차를 통한 렌티바이러스 생산 방법을 살펴보았습니다. 모든 생물 안전 규정을 준수하고 폐기물을 적절하게 처리하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Lentiviral 표현 벡터가 안정적으로 포유 동물 세포와 전체 생명체를 나누어와 비 나누어에서 다른 이펙터 분자 또는 리포터 구조를 표현하는 가장 효과적인 수단입니다. 여기 pseudoviral 입자에 lentivector 표현 구조를 패키지하고 pseudoviral 입자를 사용하여 대상 세포를 transduce하는 방법에 프로토콜을 제공합니다.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될...

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

폴리글루타민 척수뇌 운동실조증은 CAG 확장으로 인해 응집 가능성이 높은 단백질이 생성되어 발생합니다. 이 프로토콜은 벡터 생성, 입체적 전달, 포함물 및 신경 마커 손실 분석을 설명하여, 신경퇴행성 질환의 기전 조사와 표적 치료제를 평가할 수 있는 통제된 플랫폼을 제공합니다.

렌티바이러스 유발 선관절 병리학을 폴리글루타민 척수소뇌 운동증의 전임상 모델로 활용하다

여기서는 고정된 포유류 세포에서 폴리(ADP-리보스)(PAR) 농축 초점의 세포 기반 시각화, 아세포 위치 및 정량적 분석을 기술합니다. 이 분석법은 제노톡신 노출 세포 핵에서 염기 절제 수리 또는 단일 가닥 절단 복구와 관련된 DNA 손상 유도 PARP 활성화 부위를 정량화할 수 있게 합니다.

형광 융합 단백질 기반 리포터를 이용한 세포 내 제노톡신 유도 PARP1/PARP2 활성화의 시각화 및 정량적 분석

학습하세요 293T 세포를 이용한 렌티바이러스 제작 방법을. DNA 벡터 전사, 바이러스 상청액 수확, 형광 발현을 통한 바이러스 역가 측정까지 포함된 효율적인 유전자 전달 기술입니다.

Lentivirus 제작

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