Karyotyping를위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 확산 준비

서론. 안녕하세요. 저희는 브라질 파자 연방대학교 생물계측과학연구소에서 나왔습니다. 이 영상에서는 수치 염색체 이상 여부를 감지하기 위해 인간 배아 줄기세포의 염색체 도말 표본을 준비해 보겠습니다. 인간 배아 줄기세포는 안정적인 전개 핵형을 나타내는 것으로 알려져 있지만, 여러 연구에 따르면 배양 조건에 따라 염색체 전체 또는 일부가 추가되는 것과 같은 염색체 이상이 발생하기 쉽다고 보고되었습니다.

HASS의 유전적 무결성을 in vitro에서 특성화하는 것은 필수적인 도구 및 배아 발생 연구와 약물 테스트를 고려할 때 매우 중요합니다. 또한, 향후 치료 제안을 위해 염색체 변화는 발암과 빈번하게 연관되어 있어 실질적인 관심 대상입니다. 그럼 이제 시작해 보겠습니다.

세포를 ate로 처리합니다. 본 절차에서는 이를 사용합니다. 20% 무혈청 대체제와 80~9 g/mL의 섬유아세포 성장 인자가 첨가된 F 12에서 8~9일 동안 배양합니다. 먼저 배양 플라스크를 인큐베이터에서 꺼내고, 층류 훠드 아래에서 최종 농도가 0.1 µg/mL가 되도록 coit를 첨가합니다.

배지에 Coit을 첨가하면 분열기, 휴지기 및 중기 단계가 유도됩니다. 염색체가 충분히 응축되어 현미경으로 더 쉽게 관찰할 수 있을 때, 오염을 방지하기 위해 반드시 멸균 기술을 사용하십시오. Coit을 첨가한 후에는 플라스크를 닫고 세포를 배양기로 다시 옮기십시오.

배양 기간 후 세포를 고정합니다. 현재 단계에서는 세포가 고정될 준비가 되지 않았습니다. 무균 상태에서 작업할 필요는 없습니다. 먼저 배지를 흡입하여 제거한 다음, 트립신(trypsin)을 첨가합니다.

DTA 0.05%를 플라스크에 넣습니다. 세포의 바닥 표면을 충분히 덮을 수 있을 만큼의 tryin을 추가하십시오. 플라스크 캡을 닫고 가볍게 흔들어 균일하게 분산시킵니다.

트립신 처리 후 세포를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 실온에서 5분간 배양하면 세포가 플라스크 바닥면에서 더 이상 부착되어 있지 않아야 하며, 이때 혈청이 포함된 배양 배지를 첨가하거나 세포에 혈청을 부드럽게 첨가하여 트립신을 불활성화해야 합니다. 플라스크 캡을 조심스럽게 열고 배양 배지 또는 혈청을 첨가하여 액체가 세포가 있는 플라스크 바닥면으로 흘러내리게 합니다.

세포 현탁액을 피펫으로 여러 번 상하로 섞어 세포를 완전히 분리합니다. 세포를 15 milliliter 원심분리관으로 옮기되, 옮기기 전에 세포가 잘 분리되었는지, 현탁액에 눈에 보이는 세포 덩어리가 없는지 확인하십시오. 이동이 완료되면 튜브의 캡을 닫고 원심분리합니다.

현탁액을 5분 동안 섞어줍니다. 800 RPM으로 원심분리를 하면 튜브 바닥에 세포 펠렛(cell palette)이 형성되어야 합니다. 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.

P 1000 피펫을 사용하여 약 200 µL만 남을 때까지 상층액을 흡입합니다. 이 부피는 Resus용 중간 부피입니다. 펠렛을 Resus에 현탁합니다.

팰릿을 현탁합니다. 손가락으로 튜브를 가볍게 여러 번 튕깁니다. 용액 내에 세포 덩어리가 남아 있지 않은지 확인하여 세포가 잘 현탁되었는지 확인하십시오.

이 단계에서 용액은 탁해져야 합니다. 다음으로, 37 °C로 미리 가온한 75 mM 염화칼륨 용액 5 mL를 첨가하십시오. 저장액은 튜브를 회전시키면서 튜브 아래쪽으로 매우 천천히 첨가해야 합니다.

처음 3 mL를 첨가한 후, 튜브 캡을 조심스럽게 단단히 닫습니다. 튜브를 수평으로 천천히 회전시켜 저장액이 포함된 세포 현탁액을 균질화합니다.

이전과 동일한 방식으로 나머지 2 mL를 천천히 첨가합니다. 저장액을 사용하는 목적은 세포 부피를 증가시켜 염색체가 엉키지 않고 풀어지게 하기 위함입니다. 따라서 이 배양 기간은 양질의 염색체 도말 표본을 얻는 데 매우 중요합니다. 총 5 mL를 모두 첨가한 후, 튜브의 캡을 닫고 37 °C 항온수조에서 15분 동안 세포를 배양합니다.

15분간의 배양 시간이 완료되면 수조에서 튜브를 꺼냅니다. 이때 고정액에서 발생하는 흄(fume)은 독성이 있으므로 흄 후드 내에서 작업하십시오. 흄 후드를 사용할 수 없는 경우, 반드시 환기가 잘 되는 곳에서 작업하시기 바랍니다.

튜브의 캡을 제거하고 고정액 3방울을 첨가합니다. 고정액은 메탄올과 아세트산의 3:1 비율로 혼합하며, 사용 당일에 준비해야 합니다. 튜브 캡을 단단히 닫고, 튜브를 천천히 회전시키며 먼저 시계 방향으로, 그다음 반시계 방향으로 부드럽게 수평으로 돌려줍니다.

튜브를 800 RPM에서 5분 동안 감속 없이 원심분리합니다. 원심분리 후 세포 마모로 인한 시료 손실을 방지하기 위해 스핀 사이클이 천천히 멈추도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이 심장 추출액은 약 200에서 생존합니다.

펠렛을 현탁시키기 위해 손가락으로 튜브를 여러 번 가볍게 튕겨줍니다. 세포 덩어리가 남아 있지 않은지 확인하여 세포가 잘 현탁되었는지 확인하십시오. 고정액 3 mL를 튜브 벽을 따라 천천히 가하며, 처음 3 mL를 넣은 후에는 튜브를 회전시키면서 추가하십시오.

튜브 T의 캡을 단단히 닫고, 튜브를 수평으로 천천히 회전시키며 세포 현탁액을 조심스럽게 균질화합니다. 최소 한 바퀴는 완전히 회전시켜야 합니다. 혼합 과정을 극대화하려면 더 많이 추가하십시오.

세포를 가라앉히기 위해 튜브 벽을 따라 고정액 2 mL를 첨가합니다. 세포 현탁액을 4 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 이렇게 고정된 세포는 고정액 상태로 4 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다.

다음 날 세포를 세척하기 위해, 중단 없이 800 RP에서 5분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상층액을 버리고 약 200 µL의 용액을 남깁니다. 손가락으로 튜브를 여러 번 가볍게 쳐서 펠릿을 현탁합니다.

세포가 충분히 결합되었으며 현탁액에 육안으로 보이는 세포 덩어리가 없는지 확인하십시오. 튜브 벽면을 따라 신선한 고정액 5 mL를 천천히 첨가하십시오. 튜브 캡을 닫고, 튜브를 천천히 회전시키면서 수평으로 부드럽게 돌려 세포를 균질화하십시오.

고정액은 내부의 세포를 보호하고 지질을 제거한 후 단백질을 보조함으로써 결과적으로 염색체 확산이 용이하게 합니다. 튜브를 800 RPM에서 5분 동안 중단 없이 원심분리하십시오. 슬라이드 준비 단계에서 세포 펠렛을 균질화할 수 있도록 충분한 양의 용액을 남겨두십시오.

액체의 양은 세포 수에 따라 달라질 수 있습니다. 손가락으로 튜브를 가볍게 여러 번 튕겨 줍니다. 육안으로 세포 덩어리가 보이지 않는지 확인하여 세포가 잘 분산되었는지 확인하십시오.

이 단계에서, 피펫을 슬라이드 표면과 평행하게 이동시켜 깨끗하고 건조한 슬라이드 위에 20 to 30 µL의 세포 현탁액을 떨어뜨립니다. 고정액이 증발함에 따라 슬라이드 표면이 즉시 알갱이 형태로 변합니다. 이 표면이 위로 향하게 하여 뜨거운 물 증기에 30 seconds 동안 노출시켜 세포를 팽창시킵니다.

이 슬라이드들을 분석합니다. 슬라이드를 준비한 후, 위상차 현미경의 10배 및 40배 대물렌즈를 사용하여 세포 밀도가 추가 분석에 적합한지 확인합니다. 이 슬라이드는 밀도가 너무 높은 사례입니다.

세포 핵이 중기 분열상(metaphase spreads)에 너무 가깝게 위치해 있음에 유의하십시오. 세포 밀도가 너무 높은 슬라이드가 있는 경우, 고정액을 더 추가하여 세포 현탁액을 희석하십시오. 이 슬라이드는 적절한 세포 밀도를 보여줍니다.

중기 전개(metaphase spreads)가 잘 분산되어 있고 서로 격리되어 있는지 확인하십시오. 최적의 세포 밀도를 가진 슬라이드를 얻었다면, 이를 염색하여 분석할 수 있습니다. 염색체가 가려지거나 시야에서 차단될 수 있으므로 핵 근처의 중기 세포는 선택하지 마십시오.

둥근 모양의 중기(metaphase)를 찾되, 염색체가 중기판에서 멀리 떨어져 있지 않은지 확인하며 둥글고 잘 분리된 중기를 선택하십시오. 다음 슬라이드와 같이, 두 개 이상의 스프레드가 겹쳐져 발생하는 염색체 수 증가나 염색체가 일직선으로 펴져 발생하는 염색체 수 감소로 인해 잘못된 IES가 보고되는 것을 방지해야 합니다.

이 영상이 향후 실험에 도움이 되기를 바랍니다. 궁금한 점이 있으시면 언제든지 저희에게 문의해 주시기 바랍니다. 유익한 시간이 되시길 바라며, 실험에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.