단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

본 프로토콜은 마이크로 원심분리 튜브에 배양 버퍼, FXI 카제인 용액 및 표적 프로테아제가 포함된 샘플을 첨가하는 것으로 시작하며, 이후 부드럽게 혼합하고 암실에서 37 °C로 60분 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝난 후 단백질 분해 반응을 중단시키기 위해, TCA 용액을 첨가하고 부드럽게 혼합한 뒤 다시 암실에서 37 °C로 30분 동안 배양합니다. 이 단계에서 반응하지 않은 기질이 침전됩니다.

샘플을 10,000 Gs에서 10분 동안 원심분리합니다. 산 가용성 FXI 표지 단편들이 포함된 상층액을 제거합니다. 상층액을 튜브 또는 다중 웰 플레이트에 옮기고 분석 버퍼로 희석한 후, 형광 측정기로 샘플을 측정합니다.

안녕하세요, 저는 미주리주 세인트루이스에 위치한 Sigma Aldridge DeKalb 시설의 과학자 Carrie Cup Vineyard입니다. 오늘은 형광 측정법을 이용한 프로테아제 활성 측정 절차를 보여드리겠습니다. 저희 품질 관리 실험실에서는 낮은 프로테아제 활성을 측정하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작해 보겠습니다. 본 실험 절차를 위해 배양 버퍼, 분석 버퍼, 그리고 0.6 N trichloroacetic acid(TCA) 용액이 즉시 사용 가능한 상태의 용액으로 제공됩니다. Cain이라고 표시된 fite 용액을 소량씩 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. 이때 갈색 바이알을 사용하거나 투명 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호해야 합니다.

Phycoerythrin-conjugated streptavidin 기질을 분주하면 반복적인 동결-해동 주기의 필요성을 최소화할 수 있으며, 반복적인 동결-해동 주기나 격렬한 흔들림 또는 혼합은 streptavidin에서 Phycoerythrin이 분리되어 배경 신호가 높아지는 결과를 초래할 수 있습니다. 형광 광도계를 교정하거나 Phycoerythrin 신호의 선형 범위를 결정하는 경우, Phycoerythrin 대조 용액을 준비하십시오. 이 용액은 분석 버퍼를 사용하여 적절한 농도로 재구성하여 신선하게 제조하십시오.

준비가 완료되면 용액을 빛으로부터 차단하십시오. 마지막으로, 동결 건조된 trypsin 바이알에 1 mM 염산 100 µL를 첨가한 후, trypsin이 완전히 용해되도록 짧게 혼합하여 trypsin protease 대조군을 준비합니다. trypsin을 산성 조건에서 보관하면 안정성이 높아집니다.

Tripsin 대조군 용액은 온도에 민감하며 저농도에서 안정하지 않으므로 주의하십시오. 다음으로, 분석 전반에 걸쳐 사용할 테스트 시료, 대조군 및 공시료를 포함한 모든 분석 시료의 준비를 시작합니다. 각 테스트 시료는 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.

마이크로 원심분리 튜브에 배양 버퍼 20 µL, fit c kian 기질 20 µL 및 테스트 샘플 10 µL를 혼합합니다. 샘플을 암소에서 배양하는 경우 투명한 마이크로 원심분리 튜브를 사용할 수 있습니다. 또한, 프로테아제 활성이 높은 테스트 샘플은 희석이 필요함에 유의하십시오.

트립신 대조군 샘플은 분석이 적절하게 수행되고 있는지 확인하는 양성 대조군으로 사용되며, 검출 한계를 결정하거나 일반적인 표준 곡선을 작성하는 데 이용됩니다. 트립신 대조군을 준비하려면 산성화된 트립신 1분량과 배양 완충액 또는 테스트 샘플에 사용된 완충액 9분량을 혼합하고 잘 섞어줍니다. 트립신의 최종 작동 농도는 20 µg/mL입니다. 다른 특정 프로테아제를 사용하는 경우, 해당 특정 프로테아제와 적절한 완충액을 사용하여 대조군 용액을 준비하십시오.

마이크로 원심분리 튜브에 배양 버퍼 20 microliters, fz cain 기질 20 microliters 및 trypsin 대조군 10 microliters를 혼합하여 대조군 샘플 준비를 계속합니다. 각 분석 시 최소 한 개의 5 nanograms trypsin 대조군 샘플을 실행하거나 연속 희석법을 사용할 것을 권장합니다. 마지막 샘플은 공시료(blank)로, 마이크로 원심분리 튜브에 배양 버퍼 20 microliters, Fitz Caine 기질 20 microliters 및 초순수 10 microliters를 혼합하여 준비합니다.

세 가지 유형의 샘플이 준비되면, 각 튜브를 부드럽게 혼합하고 37 °C의 암소에서 60분 동안 배양합니다. 과도한 와류는 높은 형광 배경을 유발하여 분석의 감도를 낮출 수 있으므로 너무 격렬하게 혼합하지 않도록 주의하십시오. 감도를 높이기 위해 최대 24시간까지 배양할 수 있으나, FXI casein이 분해되기 시작할 수 있으므로 그 이상의 장시간 배양은 권장되지 않습니다.

배양이 완료되었을 때 높은 형광 배경이 나타나는 경우, 적절한 보호 장비를 착용한 상태에서 각 마이크로 원심 분리 튜브에 TCA 용액 150 µL를 첨가하십시오. TCA와 함께 배양하면 튜브 내에 흰색 안개가 관찰되는데, 이는 침전된 소화되지 않은 불용성 casein입니다. 가볍게 섞은 후 37 °C의 암소에서 30분 동안 배양하십시오. TCA 용액 배양이 끝나면 상온에서 10,000 ×g로 10분 동안 튜브를 원심 분리하십시오.

상층액에는 형광 측정이 사용될 산 가용성 fite 표지 Cain 단편이 포함되어 있습니다. 펠렛의 침전물이 피펫 팁으로 흡입되면 이후의 형광 검출 과정에서 위양성 결과가 나올 수 있으므로, 튜브 상단에서 조심스럽게 피펫팅하십시오. 형광계를 사용하여 프로테아제 활성을 측정하기 위해, TCA 상층액 10 µL와 분석 버퍼 1 mL를 튜브에 넣고 부드럽게 혼합합니다. 또한, FE 10 µL를 분석 버퍼 1 mL에 첨가하여 분석용 FE 표준물을 희석하십시오. FE 대조군과 Trypsin 표준물은 샘플이 초과해서는 안 되는 형광 수준을 나타냅니다. TCA 상층액과 분석 버퍼의 혼합액은 형광 측정 전까지 2~8 °C의 암소에서 최대 24시간 동안 보관할 수 있습니다.

큐벳을 사용하여 측정하는 경우, 용액 1 mL를 적절한 큐벳으로 옮깁니다. 많은 수의 샘플을 분석해야 하는 경우에는 96-웰 플레이트와 형광 플레이트 리더기를 사용하여 형광 측정 데이터를 얻을 수 있습니다. 본 분석에서 fluorescein isothiocyanate는 기기 보정 가능성을 위한 대조군으로 제공됩니다. 여기에는 설명된 절차에 따른 FS e 신호의 대표적인 선형 범위가 표시되어 있습니다.

첫 번째 배양 단계의 배양 시간을 30분으로 설정하여 이 키트를 사용하면, 1.5 nanograms에서 25 nanograms 범위의 trypsin 및 대조군 샘플에 대해 다음과 같은 전형적인 표준 곡선을 얻을 수 있습니다. 형광 측정은 멀티웰 플레이트에서 수행되었습니다. 이 분석법의 검출 한계는 공시료(blank sample)에서 얻은 값보다 유의미하게 높은 형광 수치를 생성하는 프로테아제의 양입니다.

지금까지 Sigma Aldridge 프로테아제 측정 키트를 사용하여 생물학적 시료 내의 형광 프로테아제 활성을 검출하는 방법을 살펴보았습니다. 본 키트는 사용 최적화되어 있으나, 분석하고자 하는 특정 프로테아제에 따라 약간의 조건 수정이 필요할 수 있다는 점을 유의하시기 바랍니다. 이상으로 모든 과정을 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.