Name: 사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: 학습하세요 생쥐 발 근육에서 전기천공법을 이용한 플라스미드 DNA 생체 내 형질도입 방법을. 형광현미경으로 단백질 발현을 관찰하여 근육 생물학 및 유전자 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 우리와 함께 TPLSM 시설을 공유 박사 T. 오티스, 신경 생물학, UCLA의 부, 감사, 박사 C. pEYFP - ClC1 플라스미드의 종류 기증 Fahlke, 생리학 연구소, RWTH 아헨, 독일, 그리고 미스터 기술 지원. R. 세라노. 이 작품은 NIH / NIAMS 부여 AR047664과 AR54816의 보조금에 의해 지원되었다.

FDB 및 IO 근육의 생체내 electroporation에 대한 실험 절차 <ol><li> . 생체내의 electroporation 프로토콜의를 시작하기 전에, 포유류의 표현 plasmids는 2-5 μg TE의 μl / 플라스미드 참고 범위의 농도를 얻을 수로 증폭해야합니다 우리는 정기적으로 상업 증폭 키트를 사용하여 제조 업체 &#39;절차를 따르십시오. 생체내 transfections의 골격근에서 매우 잘 CMV 프로 모터의 작동 실은 상업 표현 plasmids. </li><li> 나누어지는 필요한 플라스미드 솔루션의 볼륨 (10-20 μl)와 두 0.5 ML Eppendorf 튜브 (마우스의 각 발에 하나씩)에 저장합니다. </li><li> 무균 Tyrode 2 MG / ML hyaluronidase를 포함하는 솔루션을 준비합니다. </li><li> anesthetizing 상자를 사용하여, 깊이 승인 가스 마취 기계와 O2의 isoflurane 4 % 사용하여 마우스를 마취. 손난로 (37 ° C)에서 동물을 놓고 쥐 얼굴 마스크를 사용하여 마취를 유지합니다. 발가락 핀치 반사하여 마취 심도를 모니터링합니다. </li><li> 해부 현미경과 관찰에서 1 &quot;길이 33 게이지 바늘을 사용하여 살균 마우스 한발의 footpads 아래 hyaluronidase 용액 10 μL를 주입. 발 뒤꿈치에 가까운 지점에서 피부에 침투하고 ~ 1 / 4 &quot;에 대한 발가락의 기본 방향 subcutaneously 바늘을 전진. </li><li> 원할 경우 다른 발과 절차를 반복합니다. </li><li> 마취를 분리하고 새장에 마우스를 놓으십시오. 그것이 완전히 마취에서 회복하도록 허용합니다. </li><li> 일시간 후, 두 번째 시간 동안 동물을 마취하고 가열 패드에 놓으십시오. hyaluronidase 솔루션을 설명하는 동일한 절차에 따라, 플라스미드 DNA (플라스미드 구조의 크기에 따라)의 20-50 μg의 총 주입. 총 주사 량이 적은 20 μL / 도보해야합니다. 주 : 15-20 μ의 L가 필요한 경우, 그것은 조직 접착제로 바늘 진입 점에서 피부를 닫습하는 것이 좋습니다. </li><li> 마취를 분리하고 새장에 마우스를 놓으십시오. 그것이 완전히 마취에서 회복하고 10-15 분 기다리는 수 있습니다. </li><li> 세 번째 시간의 동물을 마취하고 가열 패드에 놓으십시오. </li><li> 동물의 한발을 선택합니다. 장소 하나는 금도금 침술의 발뒤꿈치에서 피부 밑에 바늘과 발가락의 바닥에 두 번째. 전극 기슭의 긴 축에 직각으로 서로 평행하고 지향하고 있습니다. </li><li> 마이크로 클립 커넥터를 사용하여 전기 자극기에 바늘 (전극)의 머리를 연결합니다. 1Hz 20 펄스, 기간 / 각 20 MS를 적용하여 근육을 Electroporate. . 전극의 간격에 따라 펄스 &#39;전압 진폭은 ~ 100 V / cm 참고 전기장 포기 (오실로 스코프로 모니터링하여) 조절 : 자극에 반응 없음 수축을 관찰해야하는 수준의 경우 마취가 적합합니다. </li><li> 원할 경우, 동물의 contralateral 기슭에 위의 절차를 반복하십시오. </li><li> 그 새장에 동물을 반환 한번 완전히 관찰하에 그것을 유지 마취에서 회복. 참고 : 프로 시저가 정상적으로된다면 동물이 30 분 이내에 완전한 이동성을 회복하고 나중 동식물 사육장의 동물 방으로 보낼 준비가됩니다. footpads에서 hyaluronidase와 DNA의 주사는 동물에 눈에 띄는 악영향이 없습니다. 일단 마취에서 회복 생쥐은 우리 주위에 정상적으로 앰버 수 있습니다. 추가 예방 차원에서, 0.0027 진통제로 2 일간 MG / ML에서 동물 Carprofen의 식수를 추가할 수 있습니다. </li><li> 단백질 표정은 2-8일 transfection 후 assayed 수 있습니다. 그러나, 많은 단백질의 지속적인 표현은 몇 달 동안 관찰되었습니다. </li></ol> 참고 : 동물 복지 법률과 실험실 동물의 동물 애호 관리 및 사용에 PHS 정책에 의해 위임된으로 모든 동물의 절차는 UCLA 는구나 동물 연구위원회에 의해 승인되었습니다. 대표 결과 : 위에서 설명한 생체내의 electroporation 절차에의 올바른 구현은 FDB 및 IO 근육에 plasmids의 효과적인 transfection을 초래한다. 그러나, 유전자 변형 단백질 변종 표현의 효율성이 플라스미드에 따라 달라집니다, 단백질, 단백질의 기능 특성, 그리고 통제 밖의 다른 변수의 숫자의 크기와 복잡. mCherry 단백질에 대한 상업적인 플라스미드 (PMR - mCherry) 인코딩의 존재에 electroporated FDB 근육을 위해 그림 1에서 그림과 같이 그들의 대부분은 적색 형광을 표시 사실에 의해 그림과 같이, 근육 섬유의 대부분은 우리의 프로토콜 transfected 있습니다. 이것은 각각의 섬유는 단백질 표현의 다른 학위를 전시 가능성을 배제하지 않거나 일부 섬유는 모두 3 transfected되지 않습니다. 그것은 B해야전자는 mCherry, EGFP, ECFP 및 EYFP 같은 형광 단백질의 대량의 효율적인 표현이 근육 섬유 &#39;흥분하고 여기 - 수축 결합 특성을 손상하지 않는 것을 지적했다. 사실, 그들은 가짜 transfected 근육 (결과가 표시되지 않음) 이들로부터 구별할 수 있습니다. 골격근 섬유의 찬란 - 태그 단백질의 언어 표현을 확인하는 데 사용되는 실용적인 접근. 디 노보 표현 유전자 변형 단백질의 세포내 지방화는 일상적으로 세포 구조를 잘 식별 마커의 각 태그 및 이미지의 TPLSM, 형광 이미지를 사용하여 인수 동시에 의해 평가됩니다. 이러한 후자의 가장 일반적인은 다음과 같습니다) 제 2 고조파 발생 (SHG) sarcomeric의 마이 오신 이방성 밴드 (M - 라인 중심) 9,10에서 발생하는 이미지, 그리고 B) DI - 8 - ANEPPS 형광 표면 및 가로 관을이 impermeant potentiometric dye11과 근육 섬유의 (T - 가느다란 관) 시스템 점막 라벨에 의해 얻을 수있다 이미지. DI - 8 - ANEPPS 물들일 근육 섬유의 형광 이미지에서 T - tubules는 섬유의 긴 축에 형광 지향 약 직교의 좁은 대역으로 나타납니다. 이 밴드는 unequally 서로 간격입니다 그들은 M - 라인에 걸쳐 걸쳐 장거리, 그리고 Z - 11 번 노선 전체에 걸쳐 짧은 하나에 의해 구분됩니다. 표현과 골격근 섬유의 α - actinin - EGFP의 지방화. 구조 근육 단백질의 태그 변종의 표현의 예제는 α - actinin은 그림 2에 표시됩니다. 이 단백질은 같은 정기적으로이 structure12의 표지로 사용, Z 라인의 주요 성분으로 알려진 것입니다. 우리는 α - actinin EGFP와 C 단자에 태그를 인간 (비 근육)에 대한 플라스미드 pEGFPN1 - α - actinin1 인코딩으로 FDB 및 IO 근육을 transfected. 엿새 transfection 후, 우리는 α - actinin은 대부분 동일 섬유 축을 따라 간격 좁은 밴드에서 표현 EGFP 형광 분포에 의해 평가, 것으로 나타났습니다. sarcomere 당 하나의 밴드는 (그림 2A &amp; 2D) 볼 수 있습니다. Z - 라인이 밴드의 colocalization은 SHG (그림 2B)와 D​​I - 8 - ANEPPS (그림 2E) 이미지 EGFP 형광의 분포를 비교하여 입증됩니다. 마찬가지로 그들이 Z - 라인의 위치와 동시, 연속 2 M - 밴드 사이의 중간에 위치하는 표시, SHG 밴드 α - actinin - EGFP 밴드 대체 오버레이 이미지 (그림 2C)에 의해 표시됩니다. DI - 8 - ANEPPS 물들일 transfected 근육 섬유에서 α - actinin - EGFP 밴드는 측면에 Z - 라인 (즉, 짧은 거리로 구분) 알려진 T - tubules (그림 2 층)의 모든 쌍 사이의 중심으로 보는 따라서 형질 α - actinin은 Z - 라인을 타겟으로하는 것을 나타냅니다. DHPRα1s 표현 EGFP와 N - 말단의 태그 pEGFPC1.1 - DHPR α 1S와 근육 transfection의 효율성은 그를 보여주는 TPLSM 이미지 (예 : 그림 3A)에서 확인할 수 있습니다 대부분의 섬유 표현 EGFP - DHPRα1s (transmembrane 단백질). transfected 섬유의 가장 두드러진 기능은 단백질이 T - tubules를 타겟으로하는 경우 예상했던대로 EGFP 형광 (그림 3A 및 3B)의 이중 줄무늬 패턴입니다. 또한 다른 섬유 형광 강도의 다양한 레벨을 표시하면서, 각 섬유의 줄무늬 형광 패턴이 섬유를 따라 균일 유지 것 같지만 그림 3에서 볼 수 있습니다. 높은 배율 (그림 3B)에서, 그것은 분명 밴드 간의 간격이 고르지 DI - 8 - ANEPPS (예 : 그림 2E) 스테인드 섬유에서 관찰하는 것과 비슷한 것을 볼 수 있습니다. 오버레이 이미지 (그림 3B &amp; 3E) SHG 밴드이 단백질은 T - tubules에서입니다 corroborating, EGFP - DHPRα1s 밴드 사이의 큰 간격 내에 있는지 보여줍니다. 추가가 아닌 형광 lipophilic 음이온과 측정을 걱정 DPA - (데이터가 표시되지 않음) 더 EGFP의 잔기가 T - tubules &#39;세포막의 내부 전단지의 몇 나노미터 이내입니다 보여줍니다. 현지화 및 EYFP - ClC1의 표현의 기능 평가 EGFP - DHPRα1s에 대한 관찰되는 비슷한 패턴으로 골격근 염화 채널 (ClC1), 디스플레이 EYFP 형광 밴드 (그림 4A)의 EYFP - 태그 구조를 (N - 터미널) 인코딩 pEYFP - ClC1와 transfected 섬유 &#39;표현 (그림 3A)와 DI - 8 - ANEPPS의 얼룩 (그림 2E)로 그림과 같이 T - 가느다란 관 배치에 해당. 예상대로, EYFP - ClC1 (그림 4A)과 SHG 이미지 (그림 4B) 오버레이 (그림 4C)에서와 같이의 superimposition은 SHG 밴드가 넓은 간격 O 중심 있다고 설명EYFP 형광 밴드 사이에 F. 같은 기능 염화 채널의 overexpression 기대 근육 섬유의 휴식 전도성에 상당한 증가 EYFP - ClC1 결과의 표현, 우리 transfected FDB 근육의 효소 dissociated 근육 섬유들이 electrophysiological 속성을 공부 여부를 평가하기 위해 두 microelectrodes를 사용하여 실험 설정은 이전에 6,11,13 설명했다. 표준 형광 현미경의 글로벌 형광 강도 측정 (표시되지 않음)에서 평가로 EYFP - ClC1 대량의 표현 하나, 다른이 아닌 transfected 컨트롤입니다 : 그림 5는 두 섬유의 결과를 보여줍니다. 그림 5A에서 전압 레코드 (EYFP - ClC1을 표현 근육 섬유에서 얻은) 과도한 휴식 전도성으로 인해 그것을 보여줍니다, 섬유는 거의 비 고르기입니다. 최대 400nA (0.5ms)의 전류 자극 펄스는 매우 작은 적극적인 반응을 (노 오버 슈트, 그림 5A) 이끌어하기 위해 사용할 수 있도록했습니다. 염화물 채널 차단 9 ACA 500 μm의를 포함 한 외부 Tyrode 솔루션의 교체 후, 200 NA 전류 펄스 (즉, 제어 섬유에 기록보다하지만 훨씬 느린와 광범위한 실천 가능성 (그림 5B)를 이끌어내는하기에 충분했다 그림 5C). 예상대로, 9 - ACA의 또한이 컨트롤 섬유 (그림 5D)에 최소한의 영향을했다. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" /> 그림 1. 인 - 생체내 electroporation 방법의 Transfection 효율. 브라이트 (A) 및 형광 (B) FDB 근육의 이미지는 PMR - mCherry와 transfected. electroporation 프로토콜 후 일 : 12 일. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 위해. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 표현과 FDB 섬유의 α - actinin - EGFP의 타겟팅. 패널 A와 B는 α - actinin - EGFP을 표현 섬유의 각각 EGFP의 형광 및 SHG 이미지,입니다. 패널 C는 A와 B. 패널 D와 E에있는 이미지의 중첩이다 각각 DI - 8 - ANEPPS과 α - actinin - EGFP와 스테인드을 표현하는 또 다른 섬유의 형광 이미지입니다. 육일 : 패널 F는 electroporation 프로토콜 후 D와 E 일 이내에 이미지의 중첩이다. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 표현과 FDB 섬유에서 EGFP - DHPRα1s 타겟팅. 패널, EGFP - DHPRα1s을 표현 섬유 그룹의 EGFP 형광 이미지. 패널 B는 패널에서 사각형의 확대는 더 단백질 표현의 줄무늬 패턴을 보여주기 위해서. 패널 C는 패널 A. 패널 D의 이미지에 해당하는 SHG 이미지 것은 이미지의 오버레이는 A와 C. E가 패널 electroporation 프로토콜 후 패널 D. 날짜에 표시된 지역의 확대입니다 : 20 일. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 표현과 FDB 섬유의 EYFP - ClC1 타겟팅. 패널은 A와 B는 EYFP - ClC1을 표현 섬유의 각각 EYFP의 형광 및 SHG 이미지,입니다. 칠일 : 패널 C는 A와 B. 패널 D가 electroporation 프로토콜 후 패널 C. 날짜에 이미지의 강조 하얀 선을 따라 측정된 강도 프로파일입니다 패널에있는 이미지의 중첩이다. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 유전자 변형 EYFP - ClC1. 패널을 표현 Electrophysiological 평가 섬유 A와 B는 각각 9 ACA 치료 전후에 전류 펄스에 대한 응답으로 EYFP - ClC1을 표현 섬유의 전압을 기록하고 있습니다. 패널 C와 D가 아닌 transfected 섬유에 전류 펄스에 대한 응답으로 (행동 잠재력)가 elicited 전압 기록입니다 각각 9 - ACA와 치료 전후.

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저자들은 공개할 사항이 없습니다.

우리는 여기서 생체내의 electroporation에 의해 골격 근육 섬유로의 DNA plasmids 효과 transfections을 달성하기 위해 따라야 할 자세한 단계를 설명합니다. 우리의 접근 방법의 주요 장점은 구현의 단순하고, 동물 무시할 건강 위험의 결과는 최소한의 invasiveness 있습니다. 현실에서는, 위에서 설명한 electroporation 프로토콜은 마취에서 동물에 의해 잘 용납하는 모든 중 전기 자극 프로토콜에 의해 뒤에 걸어서 당 두 피하 주사보다 더 많은 것들을 수반하지 않습니다. 저희 기관에서 이러한 조작은 모두 그들은 피부의 열기를 포함하지 않기 때문에 비 수술 절차로 결정됩니다. 게다가, electroporation 절차의 온후은 중요한 세포 손상이 효율적으로 활성 단백질 합성에 관여하는 능력에 악영향을 줄 것입니다 때문에 근육 섬유에 의해 효율적인 플라스미드 transfection 및 후속 단백질 표정을 취득에있는 전반적인 성공을위한 중요한 요소입니다. <p clas...

사용 포유류 골격 근육의 유전자 transfection vivo에서 electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

세포 생물학에 관심이 점점 자신의 내생적인 분포와 기능 관련을 조사하기 위해 필수적인 단백질 (예 : 찬란 태그를 구성 및 / 또는 돌연변이 변종)의 transgenically 수정된 형태를 표현하는 것입니다. 완전히 차별화된 세포에서이 목표를 성취하기 위해 구현되었습니다 흥미로운 접근 방식입니다<em&gt; 생체내에</em같은 간장과 같은 특정 조직에 다양한 방법으로 plasmids의&gt; transfection<sup&gt; 1</sup&gt;, 골격​​근<sup&gt; 2,3</sup&gt;, 그리고 심지어 두뇌<sup&gt; 4</sup&gt;. 우리는 여기서 효율적으로의 섬유로 유전 물질을 transfect하기 위해 따라야합니다 단계에 대한 자세한 설명을 제시<em&gt; flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB)와<em&gt; interosseus</em를 사용하여 성인 마우스&gt; (IO) 근육<em&gt; 생체내에</em&gt; electroporation 접근. 실험 매개 변수는 각각의 섬유로 표현 단백질의 품질과 수량을 손상 수 있습니다 조직 손상을 최소화하면서 transfected 근육 섬유의 수를 최대화하기 위해처럼 최적화되었습니다. 우리는이 문서에서 설명하는 방법의 구현 수용성 단백질의 높은 수율, 즉 EGFP와 ECFP 결과 확인했습니다<sup&gt; 3</sup&gt; calpain, FKBP12, β2a - DHPR 등, 구조 단백질, 즉 minidystrophin과 α - actinin 및 막 단백질, 즉 α1s - DHPR, RyR1, 심장 나 / CA<sup&gt; 2 +</supFDB, IO와 생쥐와 쥐의 다른 근육에 적용&gt; 교환기, NaV1.4 나 채널, SERCA1 등. 이러한 단백질 중 일부의 효율적인 표현은 생화학과 함께 확인되었습니다<sup&gt; 3</sup&gt; 및 기능 증거<sup&gt; 5</sup&gt;. 그러나, 훨씬 우리가 사용하는 가장 일반적인 확실한 방법은 찬란 태그 단백질 구조의 표준 형광 현미경 및 2 광자 레이저 스캔 현미경 (TPLSM), 전반적인 표현뿐만 아니라 식별하도록 허용뿐만 아니라 세부적인 세포 로컬 리 제이션은 다음과 같습니다. 방법은 동일합니다 (여기에 표시) 생리 관련의 단백질의 표현을위한 인코딩 plasmids를 transfect하는 데 사용하거나, 간섭 RNA (siRNA)를 일반적으로 표현 단백질 (아직 저희가 테스트하지)의 표현을 억제하는 목표 수 있습니다. 그것은이 근육의 효소 dissociated 섬유 아래는 흥분하고 여기 - 수축 결합의 기본 메커니즘을 조사하기 위해 현재 가장 적합한 모델 중 하나이기 때문에 FDB 및 IO 근육 섬유의 transfection은 포유류의 근육 생리학의 조사에 특히 관련이 있다고 지적한다 전류 또는 전압 클램프 조건<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

세포 생물학에서 점차 관심이 높아지고 있는 분야는 필수 단백질의 형질전환 변형 형태(예: 형광 표지된 구조체 및/또는 돌연변이...

전기천공법은 성체 마우스의 단지굴근(flexor digitorum brevis, FDB) 또는 골간근(interosseous, IO)에 DNA, 플라스미드를 형질전환하여 형질전환성으로 발현시키기 위해 생체 내(in vivo)에서 수행될 수 있습니다. 절차는 마우스를 마취하는 것으로 시작합니다. 바늘을 뒤꿈치에 삽입하고 발을 따라 피하로 유도하여, 첫 번째 히알루로니다아제 주사를 위해 한쪽 발의 발바닥 표면을 준비합니다.1시간 후, 동물을 다시 마취시키고 hyaluronidase를 주입했던 발의 동일한 피하 부위에 플라즈마를 주입합니다. 10분 후, 그림과 같이 금도금 침을 피하에 배치합니다. 필요한 경우, 침을 자극기에 연결하여 전기천공 펄스를 전달합니다.이 절차는 반대측 발에도 반복하여 시행할 수 있습니다. 2일에서 8일 정도의 기간이 지난 후, 동물을 희생시켜 근육을 적출하고, 현미경 하에서 형광을 관찰하여 목적 단백질의 형질전환 여부를 확인합니다. 안녕하세요, 저는 UCLA 데이비 게펜 의과대학 생리학과의 Julio Vera 교수님 연구실의 Marino DeFranco입니다.오늘은 성체 생쥐의 근섬유에 형질전환 단백질 발현 플라스미드를 Inbivo 방식으로 형질전환하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 형질전환 단백질의 발현과 국소화를 연구하며, 단백질 과발현이 근섬유 생리학에 미치는 영향을 분석합니다. 그럼 시작하겠습니다.in vivo 전기천공법 프로토콜을 시작하기 전, 포유류 발현 플라스미드를 증폭하여 TE 완충액 1µL당 2~5µg 범위의 농도를 확보해야 합니다. 본 연구실에서는 일반적으로 Qiagen 증폭 키트를 사용하며 제조사의 지침을 따릅니다. CMV 프로모터를 포함하는 상용 발현 플라스미드(예: Invitrogen의 pEGFP-C1 또는 pEGFP-N1)를 사용할 것을 권장합니다.이 프로모터는 골격근에서 매우 효과적으로 작동하므로, 생체 내 절단법 절차를 시연하겠습니다. P EEG FPN 1을 사용하여, 멸균 타이로(tyro) 용액에 2 mg/mL의 hyaluronidase를 포함하는 용액을 미리 준비했습니다. 이 용액은 동물 준비 시까지 상온에서 보관합니다.형질전환을 위해, 승인된 가스 마취기에 연결된 마취 박스를 사용하여 4% ISO fluorine과 산소 혼합 가스로 동물을 깊게 마취합니다. 마취가 되면, 이후의 마취 과정 동안 생쥐의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 연고를 도포합니다. 동물을 37 °C로 설정된 가열 패드 위에 올려두고, 구강 안면 마스크를 사용하여 마취 상태를 유지합니다.발가락 꼬집기 반사를 확인하여 마취 깊이를 모니터링합니다. 동물이 깊게 마취되면, 해부 현미경으로 관찰하면서 1인치 길이의 33 gauge 멸균 바늘을 사용하여 마우스 한쪽 발바닥 피부 아래에 10 µL의 고농도 UR 용액을 주입합니다. 발뒤꿈치에 가까운 지점에서 피부를 뚫고 바늘을 피하로 발가락 기저부 방향으로 진전시킵니다.피부가 과도하게 부풀어 오르는 것을 방지하기 위해 약 0.25인치(약 6mm) 정도의 깊이로 용액을 천천히 주입하십시오. 반대쪽 발에도 동일한 절차를 반복합니다. 필요에 따라, 주입된 효소는 히알루론산을 가수분해함으로써 근섬유 주변의 결합 조직을 약 1시간에 걸쳐 부드럽게 만듭니다.이는 이후 섬유 사이의 간질 공간에 주입될 DNA 플라스미드의 확산을 용이하게 합니다. 히알루로니다아제 주입 후 마취를 중단하고 마우스를 케이지에 넣습니다. 동물은 3~4분 이내에 마취에서 회복될 것입니다.1시간 후, 동물에게 두 번째로 마취를 실시합니다. 플라스미드 용액 10 µL를 채취하여 깨끗한 소형 웨이 보트(whey boat) 뒷면에 한 방울 떨어뜨립니다. 주입용 주사기로 해당 방울을 흡입하여 발바닥 패드에 주입합니다.더 큰 단백질을 위한 히알루로니다아제 용액에 대해 설명한 것과 동일한 절차를 따라, 더 많은 양의 혈장을 주입할 수 있습니다. 15 µL 이상이 필요한 경우에도 20 µL를 초과하여 주입하지 않을 것을 권장합니다. 바늘 진입 지점에서 DNA가 누출될 위험을 방지하기 위해 조직 접착제를 사용하여 피부를 폐쇄하는 것을 권장합니다.마취 장치를 분리하고 마우스를 케이지에 넣습니다. 마우스가 마취에서 완전히 깨어날 때까지 기다리며, 전기천공법 준비를 위해 10분에서 15분 정도 대기합니다. 이전과 동일한 방법으로 동물을 다시 마취합니다.동물의 한쪽 발을 선택하여, 첫 번째 금도금 침 또는 전극을 발뒤꿈치 피부 아래에 배치하고, 두 번째 침을 발가락 기저부에 배치합니다. 침들은 서로 평행하며 발의 장축에는 수직이 되도록 방향을 잡습니다. 침의 직경은 160 micrometers이며 길이는 13 millimeters입니다.이 제품들은 개별 포장된 멸균 상태로 판매됩니다. 바늘 간격에 따라 전압 펄스를 전달할 수 있도록 펄스 진폭을 조절하십시오. 이를 통해 cm당 약 100 V의 전기장을 생성합니다.펄스 지속 시간을 20 milliseconds로, 주파수를 1 hertz로 조정하십시오. 마이크로 클립 커넥터를 사용하여 전극의 헤드 부분을 전기 자극기에 연결하십시오. 20회의 전기 펄스를 가하여 발 근육을 자극하십시오.오실로스코프를 통해 전압 파형을 모니터링하십시오. 자극에 반응하여 중대한 수축이 관찰되지 않아야 합니다. 마취 수준이 적절하다면, 원하는 경우 마취 상태에서 계속 진행하십시오.다른 쪽 발에도 위와 동일한 전기천공법 절차를 반복합니다. 전기천공 후 동물을 케이지로 옮기고 관찰하며 유지합니다. 마취에서 완전히 회복될 때까지, 동물은 5분 이내에 완전한 가동성을 회복해야 합니다. 부작용이 없고 절차가 정상적으로 진행되었다면, 추가적인 예방 조치로 0.027 milligrams per milliliter 농도의 carfin을 동물의 음용수에 첨가하여 2일 동안 투여합니다.진통 단백질의 발현은 형질전환 후 2일에서 8일 사이에 분석할 수 있습니다. 하지만 많은 단백질의 지속적인 발현이 수개월 동안 관찰되었습니다. EGFP 단백질을 인코딩하는 상용 플라스미드 P EEG FPN one으로 FDB 근육을 전기천공했을 때의 형질전환 효율은 휴대용 UV 램프나 고강도 UV 다이오드에서 나오는 UV 광선을 통해 쉽게 시각화할 수 있습니다.해부 현미경으로 마우스의 발을 관찰하면, 대부분의 근섬유가 녹색 형광을 나타내는 것으로 보아 본 프로토콜을 통해 대부분의 근섬유가 형질전환되었음을 확인할 수 있습니다. 해부 현미경은 근육의 전반적인 형질전환 패턴을 보여줍니다. 이 관찰 과정을 반복합니다.에피 형광 현미경을 사용하면 근섬유 다발 또는 개별 섬유 내에서 EGFP 발현 패턴을 시각화할 수 있습니다. FDB 근섬유에서의 mCherry 단백질 발현 효율은 근육의 명시야 이미지와 형광 이미지를 대조하여 평가할 수 있습니다. 이를 위해 이광자 레이저 주사 현미경을 사용하여 새로 발현된 형질전환 단백질의 세포 내 국소화를 평가할 수 있습니다.형광 표지된 단백질의 이미지와 세포 구조의 명확히 식별된 마커 이미지를 동시에 획득합니다. 가장 전형적인 세포 구조 마커는 근절의 myosin A-band가 M-line을 중심으로 배열되어 발생하는 제2 고조파 생성(second harmonic generation) 또는 SHG 이미지입니다.염료 Di-8-ANEP로 염색한 근섬유의 형광 이미지에서, 근섬유 표면 및 횡축관(t tubule) 시스템 막을 이 염료로 표지하여 얻은 부속 형광 이미지입니다. T-관은 섬유의 장축과 거의 직교하는 방향의 좁은 형광 띠 형태로 나타납니다. 이 띠들은 서로 불균일한 간격으로 배치되어 있습니다.이들은 M 선을 가로지르는 긴 거리와 Z 선을 가로지르는 짧은 거리로 구분됩니다. 여기에는 태그가 부착된 구조적 근육 단백질 alpha actinin 변이체의 발현 예시가 나와 있습니다. 이 단백질은 Z 선의 주요 성분이며, 통상적으로 이 구조의 표지자로 사용됩니다.우리는 형질전환 6일 후, C-말단에 EGFP가 태그된 인간 비근육 alpha actinin을 인코딩하는 plasmid P-E-G-F-P Fpn one alpha actinin을 FDB 및 IO 근육에 형질전환하였습니다. 분석 결과, alpha actinin은 주로 섬유 축을 따라 동일한 간격으로 배치된 좁은 띠 형태로 발현됨을 확인하였습니다. 근절(sarcomere)당 하나의 띠가 관찰됩니다.이러한 밴드들이 Z선과 공국소화된다는 것은 중첩 이미지를 통해 확인할 수 있듯이, EGFP 형광 분포를 SHG 또는 D eight annex 이미지와 비교함으로써 입증됩니다. Alpha Acton 및 EGFP 밴드가 SHG 밴드와 교대로 나타나는 것은 이들이 두 개의 연속적인 M 밴드 중간 지점에 위치함을 나타내며, 이는 d an up Alpha Actinin으로 염색된 형질전환 근섬유 내 Z선의 위치와 일치합니다. EGFP 밴드는 Z선을 측면에서 둘러싸고 있는 것으로 알려진 매 T-세관의 각 쌍 사이에 중심을 두고 관찰됩니다. 이는 형질전환된 alpha actinin이 Z선으로 타겟팅됨을 보여줍니다.N-말단 EGFP 태그가 붙은 DHPR alpha one s의 발현 및 표적화 양상은 그림 3에 나타나 있습니다. EGFP 형광은 주로 T2E와 유사한 패턴의 간격을 가진 밴드 쌍으로 관찰됩니다. SHG 및 EGFP-DHPR alpha one s 이미지를 중첩해 보면, 연속된 두 개의 SHG 밴드 사이에 두 개의 EGFP 형광 밴드가 존재함을 알 수 있으며, 이는 DHPR alpha one s가 T2ES D8 및 abstaining(제시되지 않음)으로 정확하게 표적화되었음을 시사하며, 이는 DHPR alpha one s의 T-tubule 표적화를 입증하는 확실한 증거가 됩니다. 골격근 염화물 채널 CLC1의 C-말단에 EYFP 태그가 붙은 구조물을 인코딩하는 P-EYFP CLC1을 transfection한 섬유는 EYFP 형광 스팬을 나타내며, 이는 D8 및 abstaining에서 설명된 T-tubule 배열과 일치합니다.예상했던 결과입니다. 오버레이에 표시된 EYFP CLC one과 SG 이미지의 중첩은 SHG 밴드가 EYFP 형광 밴드 사이의 넓은 간격에 중심을 두고 있음을 보여줍니다. EYFP CLC one의 발현이 기능적 염화물 채널의 과발현으로 인해 예상되는 근섬유의 휴지 전도도의 유의미한 증가를 초래하는지 평가하기 위해, 형질전환된 FDB 근육에서 근섬유를 효소적으로 분리하고 2개의 미세전극 실험 장치를 사용하여 전기생리학적 특성을 연구하였습니다.이 이미지는 두 개의 섬유에서 얻은 결과를 보여줍니다. 하나는 다량의 EYFP clc를 발현하고 있으며, 이는 표준 형광 현미경의 전체 형광 강도 측정을 통해 평가되었습니다. 다른 하나는 형질전환되지 않은 대조군입니다.전압 기록은 EY FP CLC-1을 발현하는 근섬유에서 얻었습니다. 대조군 섬유를 흥분시키는 데 필요한 것보다 더 큰 전류 펄스를 가했을 때, 외부 Tyro 용액을 500 µM의 염화물 채널 차단제인 9-anthracene carboxylic acid(9-ACA)가 포함된 용액으로 교체하면 형질전환된 섬유에서는 작은 재생 반응만이 유도됩니다. 더 작은 펄스는 활동 전위를 유도하였으나, 예상대로 대조군 섬유에서 기록된 것보다 훨씬 더 느리고 넓은 형태를 보였습니다.9-CA의 첨가는 대조군 섬유에 최소한의 영향만을 미쳤습니다. 우리는 EY FP CLC1을 발현하는 섬유가 과도한 휴지기 염화물 전도도로 인해 거의 흥분하지 않는 상태라고 결론지었습니다. 우리는 지금까지 전기천공법을 사용하여 살아있는 골격근 섬유에 형질전환 단백질 발현 플라스미드를 형질전환시키는 방법과, 형질전환 효율 및 형질전환된 단백질의 국소화와 기능을 평가하는 방법을 보여드렸습니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.I.

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