Name: 동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 Lysate (pHPL)의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-30T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 학습하세요 혈소판 풍부 혈장에서 동결-융해 주기와 원심분리를 이용해 혈소판 파편이 제거된 풀링 인간 혈소판 라이세이트를 제조하는 방법을. 이 프로토콜은 줄기세포 배양에서 동물 혈청을 대체하는 효율적인 보충제를 제공합니다.

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이 작품은 오스트리아 연구 재단 (FWF, DS 부여 N211 - 할머니)과 오스트리아 연구 진흥 공사 (FFG, DS 부여 N200)에 의해 지원되었습니다. 저자는 언어 편집을위한 우수한 기술 지원과 모니카 패럴에 대한 클로디아 URL을 주셔서 감사합니다.

1. 시작 물질 cytapheresis으로 준비하거나 버피 외투에서 유래 혈소판 풍부 혈장 (PRP) 단위로 시작합니다. 2. 불임 검사 불임에 대한 연결된 작은 가방 (박스터)에 볼륨을 전송하여 각 PRP 단위 20 ML의 샘플을 확인하십시오. 용접이 가방의 연결을 끊습니다. 3. PRP 단위 동결 즉시 준비 후 ° C 원본 저장소 가방에서 추가 조작없이 최소한 -20 PRP 단위를 동결. 4. HPL 단위의 해동 세균 검사 부정하는 경우, 지금 37 ° C (물 목욕) 얼음 혈전이 사라질 때까지에서 HPL 단위라는 인간의 혈소판 lysate 단위를, 해동. HPL을 따뜻하게하지 마십시오. 5. HPL 단위 풀링 표준 제품을 준비 한 혈소판 lysate 풀장에 최소한 10-15 해동 HPL 단위를 가져가라. 풀링 더블 가방 (MacoPharma)에 연속적으로 HPL 가방을 연결하고이 두 가방에 HPL을 전송하기만하면됩니다. 용접 빈 HPL 가방 연결을 끊습니다. 두 가방의 내용을 혼합하여 풀링 인간의 혈소판 lysate (pHPL)의 3-4 패의 최종 볼륨을하십시오. 작은 가방 (박스터)를 연결하고 풀링 제품의 불임 검사 20 ML의 pHPL의 샘플을 채취할. 용접이 가방의 연결을 끊습니다. 6. pHPL의 Portioning 자세한 처리에 적합한 aliquots을하는 부분 pHPL. 풀링 더블 가방 (Macopharma)에 작은 가방 (박스터)를 연결하고 작은 스토리지 봉지 (박스터) 250 ML 최대 볼륨을 전송할 수 있습니다. 용접으로 가득한 가방을 분리합니다. 7. pHPL의 aliquots의 다시 동결 혈소판 조각의 속도와 더 동결 / 해동 단계 발표 성장 요인의 양을 늘립니다. 다시 portioned pHPL의 작은 가방을 고정 적어도 -20 ° C. 8. 다시 해동하고 pHPL의 aliquots의 portioning 37 pHPL 가방 해동 ° C (물 목욕). 멸균 가위를 사용하여 가방의 튜브를 절단하고 유리병에 pHPL를 따르고 50 ML의 튜브 (팔콘스 BD)로 콘텐츠를 전송합니다. 박테리아 또는 곰팡이 오염을 방지하기 위해 층류 벤치에서이 단계를 수행합니다. 9. 혈소판 파편의 제거 혈소판 조각이 집계하는 경향과 alloimmunization을 유발 수 있듯이, pHPL에서 그들을 제거합니다. 4천그램 (15 분, 4 ° C)에 따라서 pHPL 튜브를 원심 분리기. 층류 벤치 피펫에서 뜨는 최종 저장 유리병 (팔콘스 BD)에 플라즈마와 혈소판 알약을 폐기는 세포 배양에서 조각을 피할 수 있습니다. 10. pHPL의 스토리지 다시 50 ML pHPL의 튜브의 aliquots 고정 최소 20 ° C와 실험적인 사용을 위해 그들을 저장할 수 있습니다. 11. 세포 배양에 pHPL 사용 처음 겔 형성을 피하기 위해 매체 방부제없는 헤파린을 추가합니다. 37 ° C에서 pHPL 나누어지는를 해동하고 8 이외의 문화 매체 보완 - 10 %. 매체 MSC - 중간 : A - 멤 500 ML을 사용하여 해동 pHPL 56 ML (또한 자세한 내용은 1 참조 참조) 2 IU / ML (재고 솔루션의 μl = 224) 방부제없는 헤파린의을 (의 clumping을 통해 매체의 응고를 방지 추가 플라즈마에있는 섬유소)는 10 % pHPL의 최종 농도에 도달합니다. 또한 페니실린 (100U/mL) / 스트렙토 마이신 (100μg/mL) 솔루션과 L - Glutamin의 2mM을 (시그마 모두) 추가합니다. 20 μm의 기공 크기 - 진공 필터 (Millipore)을 통해 매체를 필터링합니다. (내용, 날짜) 적절하게 병을 라벨. ECFC - 중간 : 시토킨 - aliquots, 방부제없는 헤파린의 pHPL, 10 IU / ML (재고 솔루션 = 1120μl) 56 ML 페니실린 (100U/mL) / 스트렙토 마이신 (100 추가 EBM 한 병 (500 ML)를 사용하여 G / ML) 솔루션과 20 μl - 기공 크기의 진공 필터 (Millipore)와 기저 매체와 필터 L - Glutamin의 2mM. (내용, 날짜) 적절하게 병을 라벨. <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 지역 혈액 은행 또는 기타 승인된 공급자의 전체 혈액 기부에서 혈소판이 풍부한 혈장의 작성. 원심 분리 후 혈액 플라즈마, 버피 코트와 적혈구로 분리 수 있습니다. 원심 분리는 혈소판 풍부 혈장을 분리하기 전에 네 버피 코팅 장치, 혈액 그룹 O 한 혈액 그룹 AB 플라즈마는 풀링된 수 있습니다. 약 300mL의 정기적인 품질의 혈소판이 풍부한 혈장 단위 ML 또는 3x10 11 platele 당 1x10 9 혈소판을 포함한다TS 총. <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig2.jpg" alt="그림 2" /><img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig3.jpg" alt="그림 3" />

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일부 지역에서는 혈소판 풍부 혈장 (PRP)는 버피 - 코팅이 달리 혈액 검사 기부 (그림 1)에서 포장 적혈구 세포 생산의 낭비되는 제품에서 구할 수 있습니다. 성장 요인의 가용성을 집중 오래된 혈소판에서와 같이 최적 PRP는 pHPL의 더 준비를 위해 즉시 사용되는 혈소판 저장 병변 및 저하 20 인해 줄어들 수 있습니다. 그것은 더 ABH 항원과 isoagglutinins 가능한 영향을 피하기 위해 혈액 AB 그룹의 플라즈마와 혈액 그룹 O의 혈소판과 일치하여 PRP를 생성하는 것이 좋습니다. 지금까지 세포 배양은 대부분 xenoimmunization 21 알려진 미지의 병원균의 전염의 위험을지지 태아 소 혈청 (FBS)을 사용하고 있습니다. 이러한 autologous 혈청이나 혈청 무료 미디어와 같은 대안은 아직 많은 응용 프로그램에서 FBS 교체에 성공하지 않았다. 이전 연구에서 22 우리는 셀 전파에 pHPL 높은 효율을 공개 mesenchymal strom...

<table><tbody><tr><td>이중 백 (2 x 3.5L)</td><td>MacoPharma</td><td>VDL 8000XQ</td><td>원래 복수 천자용</td></tr><tr><td>50 mL Falcon 튜브</td><td>Falcon BD</td><td>2098</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 스트리펫 (Stripettes)</td><td>Costar</td><td>4501</td><td></td></tr><tr><td>혈장 백 (600mL)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>R4R2021</td><td></td></tr><tr><td>멸균 튜브 웰더 (Tubing welder)</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>TSCD-II</td><td></td></tr><tr><td>접합 장비 (Welding equipment)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>Compo Seal</td><td></td></tr><tr><td>항온수조 (Water bath)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 lysate (phpl)의 준비

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

혈소판 유래 성장 요소가 효율적으로 세포 증식을 자극하는 표시되었습니다<em&gt; 생체내에</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;과<em&gt; 체외에서</em&gt;. 이 효과는 트롬빈에 의해 활성화된 혈소판과 mesenchymal stromal 세포 (MSCS), 섬유아 세포 및 내피 식민지 - 형성 세포에 대한보고되었습니다<sup&gt; 3-5</sup&gt; 또는 동결 / 해동주기에 의해 lysed<sup&gt; 6-14</sup&gt; 전에 혈소판 releasate은 세포 배양 매체에 추가됩니다. 혈소판 파생된 성장 요인의 영양 효과는 이미 조직 공학 및 재생 치료를위한 여러 가지 실험으로 테스트되었습니다.<sup&gt; 1,15-17</sup&gt; 다양한 효율로 인해 성장 요인 개별적으로 분기하는 농도 적어도 일부로 간주됩니다<sup&gt; 18,19</sup&gt;와 혈소판 준비 표준 프로토콜의 현재 부족하다.<sup&gt; 15,16</sup&gt;이 프로토콜은 40-50 단일 혈액 기부금의 일상적 생산 혈소판 풍부 혈장 (PRP)에서 파생된 인간의 혈소판 lysate (pHPL)의 수영장을 생성하기 위해 사용할 수있는 절차를 제공합니다. 여러 동결 / 해동주기에 의해 혈소판 세포막이 손상되고 성장 요소가 효율적으로 플라즈마에 발표됩니다. 마지막으로, 혈소판 조각은 광범위한 골재 형성을 방지하고 잠재적인 항원을 고갈하기 위해 원심 분리에 의해 제거됩니다. 표준 문화 프로토콜에 pHPL의 구현은 단백질이없는 시스템의 동물의 증식 세포 치료제의 발전을위한 유망한 도구를 나타냅니다.

인간의 혈소판 lysate 성장 요인 풍부한 소스와 세포 배양에서 강력한 보충이다. 이 프로토콜은, 혈소판 풍부 혈장부터 몇 동결 - 해동 사이클을 수행하고 혈소판 조각을 파괴하여 인간의 혈소판 lysate의 큰 수영장을 준비하는 과정을 보여줍니다.

동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 Lysate (pHPL)의 준비

혈소판 유래 성장 인자는 생체 내(in vivo)1,2 및 생체 외(in vitro)에서 세포 증식을 효율적으로 자극하는 것으로 나타났습니다. 이러한 효과는 ...에 대해 보고되었습니다.

본 프로토콜은 혈소판 풍부 혈장으로부터 다량의 인간 혈소판 용해물을 준비하는 과정을 제시합니다. 동결-해동 사이클을 1회 수행하여 혈소판을 용해시킵니다. 그 후, 최소 10단위의 인간 혈소판 용해물을 하나의 배치로 모아 혼합 인간 혈소판 용해물(PHPL)을 제조합니다.약 3L의 이 용액을 다시 여러 개의 분주액(aliquots)으로 나누어 냉동함으로써 혈소판 파편을 제거합니다. 이 분주액들을 해동하여 바이알에 옮긴 후 원심 분리합니다. 상층액은 혈소판 파편이 제거된 PHPL이며, 여기에는 세포 배양 보충제 등으로 사용되는 혈소판 유래 성장 인자들이 포함되어 있습니다.남은 혈소판 파편 펠렛은 폐기합니다. 안녕하세요, Grads 의과대학 줄기세포 연구 부문 Dr.TRO 연구실의 Kadina Sharmo입니다. 오늘은 인간 혈소판 분리물 풀(pool)을 준비하는 절차를 보여드리겠습니다.우리는 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma)에서 시작하여 수차례의 동결-융해 주기를 거친 후, 혈소판 파편을 제거할 것입니다. 저희 실험실에서는 태아 송아지 혈청(fatal boen serum)의 대안으로 세포 배양에 충분한 보충제를 얻기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.본 프로토콜은 PRP라고 불리는 혈소판 풍부 혈장으로 시작합니다. 이 혈장은 성분채집술(Cy Apheresis)을 통해 준비되었거나 버피 코트(Buffy coats)에서 유도되었을 수 있습니다. 수혈 의학 분야 외의 연구자는 지역 혈액원이나 기타 공인 제공업체로부터 PRP를 구매해야 합니다.각 PRP 유닛에서 20 milliliters를 연결된 작은 백으로 옮긴 후, 웰더(welder)를 사용하여 백을 분리함으로써 PRP 유닛의 무균 상태를 확인하십시오. 이 분취액은 조제 직후 무균 시험을 위해 미생물 실험실로 보낼 수 있습니다. PRP 유닛을 원래의 보관 백에 담아 최소 -20 °C에서 냉동시키는 것이 중요합니다.세균 테스트 결과가 음성으로 나오면 다음 단계를 수행할 수 있습니다. 이제 HPL이라 칭하는 인간 혈소판 용해물이 과도하게 가열되지 않도록 주의하면서, 얼음 결정이 사라질 때까지 HPL 유닛을 37 °C 항온 수조에 넣습니다. 각 혈소판 용해물 풀에 대해 표준화된 제품을 준비하기 위해, 이 동결-해동 단계 이후에 혈소판을 용해시켜야 합니다.해동된 PRP 10~15 단위를 수집합니다. 각 HPL 백을 순차적으로 풀링 더블 백에 연결한 다음, HPL을 이 두 백으로 옮깁니다. 웰더를 사용하여 빈 HPL 백을 분리합니다.두 백의 내용물을 혼합하여 최종 부피 3~4 L의 pooled human platelet lysate를 준비합니다. 이를 PHPL이라고 합니다. 작은 백을 연결하고 PHPL 샘플 20 mL를 채취하여 혼합 제품의 무균 상태를 확인합니다.풀링 더블 백에 소형 백들을 연결하여 추가 처리를 위한 PHPL 샘플을 분주합니다. 소형 보관 백에 약 250 milliliters의 부피를 옮긴 후, 웰더를 사용하여 채워진 백들을 분리합니다. 이제 혈소판 파쇄율과 방출되는 성장 인자의 양을 증가시키기 위해 추가적인 동결-해동 사이클을 수행합니다.분주된 PHBL이 담긴 작은 백들을 -20 °C에서 냉동하여 이를 수행하십시오. 그 후, 층류 후드 내에서 37 °C 항온수조를 사용하여 백들을 해동하십시오.멸균 가위를 사용하여 각 백의 튜브를 자르고 개봉한 다음, PHPL을 50 milliliter 바이알에 붓습니다. 종종 혈소판 조각이 혈소판을 응집시키거나 동종면역을 유발할 수 있습니다. 이러한 상태를 방지하려면, 냉장 원심분리기를 사용하여 4,000 GS에서 15분 동안 원심분리하여 PHPL에서 조각들을 제거하십시오.다음으로, 세포 배양액에 파편이 섞이는 것을 방지하기 위해 혈소판 펠릿은 폐기하고 혈장 상층액을 최종 보관용 바이알에 분주합니다. PHPL을 50 milliliter씩 분주하여 추후 사용 시까지 minus 20 degrees에서 다시 냉동 보관합니다. 혈소판 파편이 제거된 PHPL이 생성되었으므로, 이제 용해물 특성을 분석할 수 있습니다.혼합 혈소판 용해물의 기능과 품질은 세포 배양을 통해 테스트하며, 세포 증식의 효율적인 자극, 중간엽 기질 세포(MSC) 및 내피 콜로니 형성 세포(E CFCs)의 증식이 혈소판 파편이 제거된 PHPL을 사용하여 성공적으로 이루어짐으로써 입증됩니다. 배지 레시피에 대한 자세한 내용은 여기의 서면 프로토콜을 참조하십시오. 혼합 인간 혈소판 용해물의 두 가지 응용 분야.중간엽 기질 세포 배양에서 공여라 한 명의 MSC를 PHPL 또는 혈소판 파편이 제거된 PHPL로 배양한 결과가 나타나 있습니다. 표시된 바와 같이, 파편 제거 PHPL만 사용했을 때와 비교하여 여기서는 더 많은 파편 오염이 확인됩니다. 혈소판 파편은 MSC의 성장을 충분히 지원하지 못합니다.세 이미지 모두 배양 13일 후에 촬영되었습니다. 공여자 2의 MSC는 혈소판 풍부 혈장 대신 혈소판 파편이 제거된 PHPL에서 9일 동안 배양되었습니다. 혈소판 용해를 거치지 않은 PRP는 MSC의 성장을 충분히 지원하지 못한다는 점에 유의하십시오.인간 제대혈 유래 MSC를 분리하고 배양하기 위해 파편이 제거된 PHPL을 사용하는 방법을 설명하는 Andreas Reish의 JoVE 프로토콜을 함께 참조하시기 바랍니다. 지금까지 줄기세포 배양에서 동물성 혈청을 완전히 대체할 수 있는 PHPL 제조 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 배양 배지에 헤파린과 PHPL을 첨가하기 전에 혈소판 파편을 제거하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기에서는 해리된 단일 세포의 비집락형 단층(NCM) 성장을 기반으로 하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배양 프로토콜을 제시합니다. Rho 관련 키나아제 억제제 또는 라미닌 동형(laminin isoform 521, LN-521)을 활용하는 이 새로운 방법은 다량의 동질적인 hPSC 생산, 유전자 조작 및 약물 발견에 적합합니다.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

설명된 프로토콜을 통해 실험실은 프로그래밍 가능한 액체 처리 로봇과 96웰 플레이트를 사용하여 최소한의 노동력, 경험 및 장비 투자 비용으로 높은 처리량으로 확장 가능하고 접착력이 있는 줄기 세포 배양을 수행할 수 있습니다.  이 시스템에서 20회 이상 통과한 iPSC는 다능성, 정상 핵형을 유지했으며 심근세포로 분화되었습니다.

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

이 프로토콜은 추가적인 외인성 보충 또는 hPSC 특이적 합성 하층(hPSC) 없이 젤라틴으로 코팅된 접시에 담긴 인간 태반에서 유래한 조건화된 배지만을 사용하여 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 증식시키는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

이 프로토콜에는 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시 형태로 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 반자동된 접근 방식을 설명 합니다. 이 프로세스는 신속 하 고 비용 효율적인, 품질의 생산 기초 및 응용 연구를 인간의 hepatocyte 같은 셀 배치를 안심 수 있도록 합니다.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

이 프로토콜은 100% 자가 섬유아세포 배양 시스템에서 세포의 시험관 내 확장을 촉진하기 위해 PRP를 생성하는 장치를 제시합니다.

In Vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산

인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 효소적 또는 기계적 패시징과 관련된 한계를 피하기 위해 EDTA 매개 탈유착을 사용하여 인간 포피 섬유아세포의 피더 세포층에 유지되는 hESC 또는 hiPSC 콜로니를 수확하기 위한 빠르고 효과적이며 비용 효율적인 고수율 방법을 확립했습니다.

에틸렌디아민테트라아세트산 매개 탈접착에 의한 공급세포에서 인간 만능 줄기세포의 신속하고 비용 효율적이며 효소 없는 패스페이징

이 프로토콜은 인간 만능 및 유도 만능 줄기 세포로부터 자가 조직화 혈관의 생성을 설명합니다. 이러한 혈관 네트워크는 혈관주위세포, 평활근 액틴 및 연속적인 기저막으로 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피 네트워크를 나타냅니다.

만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.

인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

최근의 기술 발전으로 약물 대사 및 독성 응용 분야를 위한 체외 플랫폼의 대규모 생산이 가능해졌습니다. 모든 인간 2D+ 간계(TV2D+)는 기존의 2차원 배양 방법을 사용하여 생리학적으로 관련된 결과를 제공합니다. 이 프로토콜은 시스템의 설정, 유지 관리 및 적용에서 최종 사용자를 지원합니다.

약물 개발 응용 분야를 위한 모든 인간 간 배양 시스템

학습하세요 혈소판 풍부 혈장에서 동결-융해 주기와 원심분리를 이용해 혈소판 파편이 제거된 풀링 인간 혈소판 라이세이트를 제조하는 방법을. 이 프로토콜은 줄기세포 배양에서 동물 혈청을 대체하는 효율적인 보충제를 제공합니다.

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