동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 Lysate (pHPL)의 준비

본 프로토콜에서는 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma)으로부터 대량의 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate)을 준비하는 과정을 제시합니다. 한 번의 동결-해동 사이클을 통해 혈소판을 용해시킵니다. 그 후, 최소 10단위의 인간 혈소판 용해물을 하나의 배치로 모아 혼합 인간 혈소판 용해물(pooled human platelet lysate, PHPL)을 제조합니다.

약 3L의 이 부피를 여러 개의 분주액으로 나누어 다시 동결하여 혈소판 파편을 제거합니다. 이 분주액들을 해동하여 바이알에 옮긴 후 원심분리합니다. 상층액은 세포 배양 보충제로서 혈소판 유래 성장 인자가 포함된 혈소판 파편 제거 PHPL이 됩니다.

남은 혈소판 파편 펠렛은 폐기합니다. 안녕하세요, 저는 Grads 의과대학 줄기세포 연구 부문 Dr.TRO 연구실의 Kadina Sharmo입니다. 오늘은 인간 혈소판 분리물 풀(pool)을 준비하는 절차를 보여드리겠습니다.

먼저 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma)에서 시작하여, 여러 번의 동결-해동 사이클을 거친 후 혈소판 파편을 제거하겠습니다. 저희 연구실에서는 태아 송아지 혈청(fetal bovine serum)의 대안으로 세포 배양에 충분한 보충제를 얻기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

본 프로토콜은 PRP라고 불리는 혈소판 풍부 혈장으로 시작합니다. 이 혈장은 성분채집술(Cy Apheresis)로 준비되었거나 버피코트(Buffy coats)에서 유래되었을 수 있습니다. 수혈 의학 분야 외의 연구자는 지역 혈액원이나 기타 공인된 제공업체로부터 PRP를 구매해야 합니다.

각 PRP 유닛에서 20 mL를 작은 연결백으로 옮긴 후 웰더(welder)를 사용하여 백을 분리함으로써 PRP 유닛의 무균 상태를 확인하십시오. 이 분주액은 준비 직후 미생물 실험실로 보내 무균 시험을 진행할 수 있습니다. PRP 유닛은 원래의 보관백 상태로 최소 -20 °C 이하에서 냉동하는 것이 중요합니다.

박테리아 검사 결과가 음성으로 나오면 다음 단계를 수행할 수 있습니다. 인간 혈소판 용해물(이하 HPL)이 과하게 가열되지 않도록 주의하면서, 얼음 결정이 사라질 때까지 HPL 단위를 37 °C 항온 수조에 넣어둡니다. 각 혈소판 용해물 풀에 대해 표준화된 제품을 준비하기 위해, 이 동결-해동 단계 이후에 혈소판을 용해시켜야 합니다.

해동된 PRP 유닛 10~15개를 수집합니다. 각 HPL 백을 순차적으로 풀링용 더블 백에 연결한 다음, HPL을 이 두 개의 백으로 옮깁니다. 웰더를 사용하여 비어 있는 HPL 백을 분리합니다.

두 백의 내용물을 혼합하여 총 3~4 L의 풀링된 인간 혈소판 용해물을 만듭니다. 이를 PHPL이라고 합니다. 소형 백을 연결하고 PHPL 샘플 20 mL를 채취하여 풀링된 제품의 무균 상태를 확인합니다.

풀링 더블 백에 소형 백을 연결하여 추가 처리를 위한 PHPL 샘플을 분주합니다. 약 250 milliliters의 부피를 소형 보관 백으로 옮긴 후, 웰더(welder)를 사용하여 채워진 백을 분리합니다. 이제 추가적인 동결-해동 사이클을 수행하여 혈소판 분절률과 방출되는 성장 인자의 양을 높입니다.

분주된 PHBL이 담긴 소형 백들을 -20 °C에서 냉동시킨 후, 라미나 플로우 후드 내의 37 °C 항온수조에서 해동하여 수행하십시오.

멸균 가위를 사용하여 각 백의 튜브를 절단하여 개봉한 후, PHPL을 50 milliliter 바이알에 붓습니다. 흔히 혈소판 조각은 혈소판을 응집시키는 경향이 있으며 동종면역을 유도할 수도 있습니다. 이러한 현상을 방지하기 위해, 냉장 원심분리기를 사용하여 4,000 GS에서 15분 동안 원심분리하여 PHPL에서 조각들을 제거하십시오.

다음으로, 세포 배양액이 얼 때 파편이 생기는 것을 방지하기 위해 혈소판 펠렛은 폐기하고 혈장 상층액을 최종 보관용 튜브에 분주합니다. PHPL을 50 µL씩 분주하여 사용 시까지 -20 °C에서 다시 보관합니다. 혈소판 파편이 제거된 PHPL이 생성되었으므로, 이제 용해물 특성을 분석할 수 있습니다.

풀링된 혈소판 용해물의 기능과 품질은 세포 배양을 통해 테스트하며, 세포 증식의 효율적인 자극, 중간엽 기질 세포(MSC) 및 혈관 내피 콜로니 형성 세포(E CFCs)의 증식 성공을 통해 이를 입증하며, 이는 혈소판 파편이 제거된 PHPL을 사용하여 수행됩니다. 배지 레시피에 관한 자세한 내용은 여기의 서면 프로토콜을 참조하십시오. 풀링된 인간 혈소판 용해물의 두 가지 응용 분야입니다.

중간엽 기질 세포 배양에서 공여자의 MSC를 PHPL 또는 혈소판 파편이 제거된 PHPL로 배양한 모습이 나타나 있습니다. 표시된 바와 같이, 파편 제거 PHPL만 사용했을 때와 비교하여 여기서 더 많은 파편 오염이 확인됩니다. 혈소판 파편은 MSC 성장을 충분히 지원하지 않습니다.

세 이미지 모두 배양 13일 후에 촬영되었습니다. 공여자 2의 MSC는 혈소판 풍부 혈장 대신 혈소판 파편이 제거된 PHPL에서 9일 동안 배양되었습니다. 혈소판 용해 과정이 없는 PRP는 MSC의 성장을 충분히 지원하지 않는다는 점에 유의하십시오.

또한 인간 제대혈 유래 MSC를 분리하고 배양하기 위해 fragment depleted PHPL을 사용하는 방법을 설명한 Andreas Reish의 JoVE 프로토콜을 참고하시기 바랍니다. 지금까지 줄기세포 배양에서 동물성 혈청을 완전히 대체하기 위해 PHPL을 만드는 방법을 살펴보았습니다. 이 과정을 수행할 때, 배양 배지에 heparin과 PHPL을 첨가하기 전 혈소판 파편(platelet fragments)을 반드시 제거해야 한다는 점을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.