Name: 분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-28T07:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 배우세요 성인 인간 말초혈액에서 내피 콜로니 형성 전구 세포(ECFC)를 동물 혈청 없이 분리하고 대규모로 확장하는 방법을. 이 기술은 혈관 항상성 및 재생 연구에 안전하고 효과적인 프로토콜을 제공합니다.

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저자는 훌륭한 기술 지원 pHPL와 Margaretha Frühwirth와 다니엘라 탈러를 제공 박사 Katharina Schallmoser 감사합니다.

A.) ECFC ISOLATON DAY 1 : <ol><li> 당신이 시작하기 전에 실험은 세포 배양 매체 내피 성장 중간 2 (EGM - 2)를 준비합니다. (; 모든 시그마, 세인트 루이스, MO 500ml 내피 기초 헤파린 (1000 U / ML의 1ml)로 중간 2 페니실린 / 스트렙토 마이신의 5ml 100x 솔루션을 보완 <a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a> ), L - 글루타민 (2 MM 최종 농도 ) 50 ML 풀링된 인간의 혈소판의 lysate (pHPL). ; 다음 0.2 ML의 하이드로코티손, 2 ML hFGF - B, 0.5 ML VEGF, 0.5 ML EGF, 0.5 ML IGF - 1과 0.5 ML의 아스코르비 산 (SingleQuots로 제공, 모든 Lonza, 워커스빌, MD 추가 <a href="http://www.lonzabioscience.com/">http://www.lonzabioscience.을 COM /</a> ). 무균 여과액 0.2 m - 기공 크기의 500 ML Millipore 진공 필터를 통해 중간. pHPL 작은 혈전을 형성하고 있기 때문에 하나의 매체의 두 가지 필터가 필요할 수 있습니다. 사전 따뜻한 필터링 EGM - 2 37 ° C 물 목욕으로 </li><li> 6ml 방부제 무료 나트륨 - 헤파린 혈액 vacutainer 관에 cubital 정맥에서 어른이 인간의 말초 혈액의 5 ML를 그림으로써 혈액 샘플을 수집합니다. 당신은 2 시간 최대 내에서 혈액 샘플을 처리한다. </li><li> 통풍 모자, 한 25 ML의 피펫과 층류 벤치에 두 5 ML pipettes와 플라스크, 한 75cm 2 (코스타 T75) 준비하여 시작하십시오. </li><li> 사전 채우기 15 ML 사전 예열 25 ML의 피펫으로 플라스크에 EGM - 2 보충. 이제 혈액 약병 및 샘플 술병에 5 ML의 피펫과 함께 모든 5 ML을 엽니다. 두 번째 5 ML의 피펫과 함께 추가 EGM - 2 5 ML과 빈 혈액 병을 린스. T75 내에서 총 판매량은 25 ML이다. 37 인큐베이터에있는 술병과 장소의 통풍 - 뚜껑을 닫기 ° C 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도. </li></ol> DAY 2 : <ol><li> 약 24 시간 (야간 이상) 후 비 점착 성의 세포의 제거에 대한 중간 혈액 혼합물을 제거합니다. 층류 흐름에 준비이 25 ML pipettes 세 5 ML pipettes 경우, 사전 따뜻한 20 ML ° C 물 목욕에 37 EGM - 2 (전날에 준비) 30 ML PBS를 보충. </li><li> 인큐베이터에서 샘플로 술병을 제거하고 25 ML의 피펫 모든 뜨는을 제거합니다. 어떤 잠재적인 식민지 손상을 방지하기 위해 술병의 표면을 스크래치 않도록주의를 가져가라. 부드럽게 다른 한쪽에서 미리 예열 PBS 및 틸팅 술병 10 ML을 추가하여 내부 술병 세포 부착 표면에 세 번 씻으십시오. PBS 즉시 각 시간과 폐기를 제거합니다. </li><li> 플라스크에 신선한 사전 예열 EGM - 2 20 ML를 추가하고 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이 과정은 분리하지 연결된 세포에 대한 신속하고 최대한 부드럽게으로 수행되어야합니다. 그들이 오래 위해 PBS 또는 상온에서 보관하는 경우 ECFCs 쉽게 분리합니다. </li><li> 술병을 통해 화면 systemically 매초마다 하루 ECFC 파생물을 찾고 가벼운 현미경의 낮은 배율을 사용하여 하루에 두세에서 시작. 식민지는 식민지의 위치를​​ 나타내는 술병의 바깥 쪽 상단에있는 마크를 발견하는 것입니다. flaks 이상 5 분 인큐베이터 밖되지해야합니다. </li></ol> DAY 5 : <ol><li> 5 일 시딩 이후 비 점착 성의 세포를 제거하는 완벽한 매체 변경을 수행합니다. 사전 따뜻한 20 ML 이러한 목적 EGM - 2 37 ° C 물 목욕으로 두 25 ML pipettes 준비. </li><li> 25 ML의 피펫을 사용하여 완전한 매체를 제거하고 가능한 빨리 신선한 사전 예열 보충 EGM - 2를 추가합니다. 전지는 건조하지 않도록 분 이상 매체없이 왼쪽해서는 안됩니다. 인큐베이터에 다시 플레이스와 매일 술병을 검사 반복합니다. </li><li> 신선한 보충 EGM - 2 회 주간의 중간의 30 %를 교체하여 세포를 공급. </li></ol> DAY 14-28 : <ol><li> 코블 스톤의 형태로 전형적인 식민지는 하루에 1,200 나타납니다. 각 식민지의 위치를​​ 나타내기 위해 술병의 맨 바깥쪽 면을 표시한다. 단일 세포 분리 시작하지 않는 한 식민지가 하루 28까지 성장할 수 있습니다. 일단, 기본 식민지들은 그들의 크기에 따라 일 14 28 사이에 수확한 수 확인되었습니다. </li></ol> B.) ECFC 하베스트 <ol><li> 사전 따뜻한 5 ML 트립신 0.05 % / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 ML PBS 및 5ml 신선한 보충 EGM - 2. </li><li> 완전히 (잠재적인 식민지 손상을 방지하기 위해 술병의 표면을 만지지 않도록 돌봐) 팔콘 튜브에 술병에서 매체를 제거하고 10 ML preheated PBS로 세포를 신중하게 씻으십시오. </li><li> 인큐베이터 5 분 5 ML 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화를 추가합니다. 그것이 독성되는 이후 세포는 7 개 이상의 분 트립신에 노출해서는 안됩니다. 철저하게 플라스크의 측면을 감청하는 것은 세포를 분리하는 데 도움이됩니다. 보존된 사용하는 문화 매체의 약 10 ML을 추가하여 트립신 프로 테아제 활동을 끄다. </li><li> 50 ML 팔코에 세포 현탁액을 제거N 튜브. 이후 수확 세포 현탁액에 추가되면 10 ML PBS로 술병을 씻으십시오. 4 7 분에 대한 300g에 세포 현탁액을 원심 분리기 ° C는 세포를 수집하고 트립신을 제거합니다. 뜨는을 취소하고 1 ML PBS에서 즉시 세포 펠렛을 resuspend. 얼음 계속. </li><li> R. 리카르도와 K. Phelani하여 조브 프로토콜에서 설명한대로 휴대폰 번호를 결정 5. </li></ol> C.) ECFC 확장 <ol><li> 보충 500 ML EGM - 2 등) 1.1에서 설명했다. 37 사전 따뜻한 ° C 물 목욕 인치 </li><li> Nunc, 네이퍼빌, IL,, 약 2,500cm이 문화 공간 11 T220 (225cm 2) 15 T175 (175cm 2) 또는 하나에 안경 계층 세포 공장 (CF - 4 준비 <a href="http://www.nuncbrand.com/">http://www.nuncbrand . com</a> ). 또한 두 개의 새로운 통풍구 - 모자와 층류 벤치에서 특별한 살균 깔때기가 필요합니다. </li><li> 100 시작 세포 밀도의 씨앗 ECFCs에 휴대폰 번호의 C / cm 2 계산이 필요합니다. 한 CF - 4 252,800 전지 500 ML 신선한 EGM - 2 resuspended되고 멸균 깔때기를 사용하여 CF - 4에 부어. 환기 - 모자 하나의 통풍구를 닫고 모든 4 밀가루 사이에 매체의 평등한 분배를 가능하게 CF - 4 한 경도 측면을 기울. 다음 챔버를 뒤로 기울이기 및 통풍 - 캡의 뚜껑을 엽니다. 인큐베이터에서 CF - 4를 놓습니다. </li><li> CF - 4까지 적어도 한번 매주 매체의 20 %를 변경 합류합니다. </li><li> 수확 세포는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 70 ML과 약 200 ML PBS를 사용하여) B.에 설명되어. </li></ol> 대표 결과 이 격리 방법을 사용하여 우리는 하루에 12 주 콜로니 형성을 관찰했다. 이전 연구에서는 4.0 ± 의미 말초혈 각 ML에서 파생된 0,8 ECFC - 식민지를 복구할 수있었습니다. 4 ECFCs는 일반 코블 스톤의 모습을 보여주었다. 대규모 확장 후, 100 세포 / cm 2 시딩 밀도, 우리 3 남 1 여성 자원 봉사자 (26 ~ 50 세 사이의 연령)에서 약 30 일의 총&gt; 1 X 10 8 세포를 획득하였습니다. 이러한 조건 하에서 교양 ECFC은 proliferative 기능 및 genomically 안정 표시되었습니다. 4 나아가 세포가 추가로 사용하기 위해 액체 질소로 (10 % DMSO)를 저장할 수 있습니다. 3,4

<ol><li>Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+endothelial+cells+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia.</a> N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).</li>
<li>Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

이 소설 절연 및 확장 방법이 더 효율적이고 더 적은 시간이 소요 모든 세포 분리합니다 (밀도 기울기가 필요 없습니다)을 피함으로써과 기존 기술보다 비싸 간단하고 효율적인 프로세스입니다. 보빈 항원과 putative 이후 xenoimmunization에 pHPL 연락처를 사용하여 제외됩니다. 문화 기간 동안 작은 혈전이 pHPL에 의한, 양식 수 있습니다. 우리의 경험을 바탕으로 이러한 혈전은 콜로니 형성과 세포 증식이나 기능에 영향을하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>Endothelial basal Medium-2</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>500ml</td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid</td></tr><tr><td>방부제 무첨가 Heparin</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td>EGM-2당 10U/ml</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>EGM-2당 2mM</td></tr><tr><td>Penicillin 및 Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>EGM-2당&lt;br/&gt;100U/mL Penicillin 및&lt;br/&gt;100&amp;#x03BC;g/mL Streptomycin</td></tr><tr><td>Trypsin/1mM EDTA </td><td>Invitrogen</td><td></td><td>T75 플라스크용 7ml&lt;br/&gt;CF-4용 70ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4층 세포 배양 공장 (CF-4) </td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 깔때기</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 배양 플라스크 (통기성 캡 포함)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mL vacutainer 튜브 (방부제 무첨가 sodium heparin) </td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>방부제 무첨가 sodium heparin&lt;br/&gt;108 IU/6ml 사전 충전</td></tr><tr><td>50ml Falcon 튜브</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5ml Stripetts</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25ml Stripetts</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Squeezer</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 공극 크기 멸균 필터</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>EGM-2당 500ml 2개</td></tr></tbody></table>

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

본 논문은 heparinized에서 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)에 대한 새로운 복구 전략을 도입하지만, 그렇지 12일의 의미 이내에 성인 인간의 말초 혈액을 unmanipulated. 대규모 확장 후&gt; 1x10 8 ECFCs는 추가적인 테스트를 위해 얻을 수 있습니다. Advantageously pHPL를 사용하여 소 혈청 항원과 인간 세포의 접촉은 제외시킬 수 있습니다. 유동세포계측법 및 immunohistochemistry으로 분리된 세포는 ECFC 및 체외 기능의 구조와 같은 혈관을 형성하는가 matrigel 분석에서 테스트 수있는 특징 수 있습니다. 또한이 세포는 생체내 subcutaneously에 기능, perfused 혈관을 형성하는 마우스 모델에서 주입 수 있습니다. 장기 확장 및 cryopreservation 확산 후, 기능 및 게놈의 안정성은 화석이 보존 되기에 나타납니다. 3,4가 이것은 동물 단백질 무료로 절연 및 확장 방법은 ECFCs 대량를 생성하기 위해 쉽게 적용됩니다.

내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)은 혈관 항상성 및 수리를 공부하는 유망 도구입니다.<sup&gt; 1,2</sup&gt;이 논문은 절연 및 안티 소 예방 접종의 위험이 떨어지면서 풀링된 인간의 혈소판 lysate (pHPL)와 heparinised 성인 인간의 말초 혈액에서 ECFC의 확장을위한 소설 동물 - 혈청 무료 방법을 소개합니다.

본 논문은 헤파린 처리되었으나 그 외에는 조작되지 않은 성인의 혈액으로부터 혈관내피세포 형성 전구세포(endothelial colony forming progenitor cells, ECFCs)를 회수하는 새로운 전략을 소개합니다...

동물 혈청이 없는 최적화된 배지로 전혈을 단순히 배양함으로써 수행합니다. 75 cm² 플라스크에서 E CFC는 플라스크 표면에 부착되며, 이를 통해 대부분의 적혈구와 백혈구가 제거됩니다. 1일 차에 플라스크를 세척하고, 5일 차에 전체 배지를 교체하여 남아 있는 세포들을 제거합니다.격일로 또는 편리한 경우 주 3회 콜로니 스크리닝을 계속 수행하십시오. 그러면 12일경에 첫 콜로니들이 관찰될 것입니다. 안녕하세요, 저는 그로츠 의료대학교 줄기세포 연구소의 Nicole Hoffman입니다.오늘은 성인 인간 말초혈액에서 혈관내피세포 형성 전구세포(endothelial colony forming progenitor cells, ECFC)를 분리하고 증식시키는 간소화된 과정을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 과정을 통해 in vitro 및 in vivo 환경에서 ECFC의 기능과 생물학적 특성을 연구하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.이 섹션은 배양에 사용할 endothelial growth medium two의 조제 및 필터 멸균으로 시작합니다. 37 °C 항온수조에서 배지 20 mL를 예열합니다. 주관절 정맥에서 성인 인간 말초혈액 5 mL를 보존제가 없는 sodium heparin blood vacutainer tube 6 mL에 채취합니다.혈액 샘플은 수집 후 2시간 이내에 층류 후드 내에서 처리해야 합니다. 층류 벤치에 통기성 캡이 있는 75 square centimeter 플라스크 1개, 25 milliliter 피펫 1개, 그리고 5 milliliter 피펫 2개를 준비합니다. 25 milliliter 피펫을 사용하여 플라스크에 미리 데운 보충제 함유 E GM two 15 milliliters를 미리 채웁니다.혈액 파일을 열고 5 mL 피펫을 사용하여 혈액 5 mL 전체를 플라스크로 직접 옮깁니다. 피펫을 사용하여 남아 있는 pre-war E GM two 5 mL로 빈 혈액 바이알을 헹굽니다. 이 부피의 용액을 플라스크에 추가합니다.현재 25 mL가 담겨 있는 플라스크의 통기성 캡을 닫습니다. 플라스크를 37 °C, 5% carbon dioxide 및 95% 습도로 설정된 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 37 °C 항온수조에서 보충된 e GM two 20 mL와 PBS 30 mL를 예열하고, 라미나 플로우 후드 내에 25 mL 피펫 2개와 10 mL 피펫 3개를 준비합니다.시료

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

내피 콜로니 형성 세포 (ECFCs) 본질을 표시하는 강력한 clonal proliferative 잠재력과 내피 세포를 순환하고...

내피 콜로니 형성 세포의 Phenotypic 및 기능성 특성은 인간 탯줄의 혈액에서 유래

이 비디오는 성인 인간 섬유아세포에서 유래한 유도 신경전구세포(iNPC)를 분리하는 기술을 보여줍니다. iNPC 군집체를 분리하고 iNPC 개체군의 지속적인 증식 및 확장을 촉진하는 적절한 배양 배지가 있는 상태에서 라미닌 코팅된 다중 웰 플레이트 웰에서 배양하는 데 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

성체 인간 섬유아세포에서 유래한 유도 신경전구세포 군집(Induced Neural Progenitor Cell Colonies)

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 원발성 종양 특이적 내피 세포를 분리하고 배양하는 신뢰할 수 있는 방법을 보고합니다.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

이 프로토콜은 소량의 성인 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포(BOEC)를 안정적으로 생성하고 특성화할 수 있도록 합니다. BOEC는 혈관 질환 환자의 내피 세포의 대리 및 유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 기질로 사용할 수 있습니다.

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

내피 전구 세포 (내피 전구 세포는) 결정적으로 허혈성 조직의 혈관 신생에 관여한다. 이 방법은 말초 혈액에서 인간 내피 전구 세포의 분리뿐만 아니라, 심장 수술 환자의 혈청 샘플에 대한 그들의 이동성 전위의 식별을 설명한다.

심장 수술 후 혈청 샘플의 영향을 건강한 자원 봉사자와 그들의 철새 잠재력에서 내피 전구 세포의 분리

이 프로토콜의 목표는 내 피 뿌리 탯 줄 혈액에서 세포를 분리. 조직 설계 만드는 혈관 및 심장 밸브 구성 및 응용 프로그램의 일부는 biomarker로 심혈 관 위험, 허 혈 성 질환 치료 환자를 식별 하는 데 이러한 세포를 사용 하 여 포함 됩니다.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

종양 내 피 세포는 종양 microenvironment의 중요 한 결정 요인 및 질병의 과정. 여기, 인간 대 장 암 및 마약 테스트 및 병 인 연구에 사용 될 일반 콜론에서 순수 하 고 가능한 내 피 세포의 고립에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

배우세요 성인 인간 말초혈액에서 내피 콜로니 형성 전구 세포(ECFC)를 동물 혈청 없이 분리하고 대규모로 확장하는 방법을. 이 기술은 혈관 항상성 및 재생 연구에 안전하고 효과적인 프로토콜을 제공합니다.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

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