인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

인간의 탯줄은 전구 세포에 쉽게 접근할 수 있는 공급원입니다. 이 기사에서는 혈관 벽 및 중간엽 전구 세포(mesenchymal progenitor cell) 내 세포의 하위 집단인 내피 전구 세포(endothelial progenitor e CFC)의 분리 및 후속 확장을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 단일 인간 탯줄에서 파생된 MSC.

먼저 가위를 세로로 사용하여 인간의 배꼽을 따라 자르고 내부 혈관 표면에서 세포를 긁어냅니다. 스크레이퍼에서 세포를 플라스크로 옮기고 집락이 자랄 때까지 기다립니다. 긁힌 세포 중 일부는 전구 표현형을 나타내고 크게 증식하여 큰 군체를 형성합니다.

이러한 세포가 증식하면 e CFCs는 새로운 플라스크에서 증식할 수 있습니다. 추가 분석을 위해 중간엽 세포 집단을 인간 탯줄에서 분리할 수도 있습니다. 코드의 일부를 작은 조각으로 자르고 멸균 배양 플레이트로 옮깁니다.

며칠 후, 혈관 간 탯줄 조직 조각 주변에서 기질 세포 성장이 보일 것입니다. 이러한 세포를 새로운 플라스크로 옮기고 추가 분석을 위해 확장하십시오. 이 프로토콜을 사용하면 3-4주 이내에 단일 시작 물질 코드로부터 두 가지 유형의 전구 세포 계통을 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 오스트리아 의과대학 줄기세포 연구실의 Dr.T Strong 연구실에서 근무하는 안드레아스 대니쉬입니다. 오늘 우리는 하나의 제대 코드에서 인간 중간엽 및 내피 채널 세포의 분리, 확장 및 분석 절차를 보여 드리겠습니다. 용어에 대한 한 가지 참고 사항.

우리 세포는 다분화능, 중간엽 기질 세포 또는 MSE 및 내피 결장을 형성하는 프로 세포 또는 e CSC라고 합니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 비혈구 전구 세포 기능 및 생물학을 연구합니다. 시작하겠습니다.

세포 분리 단계 전에 inadine으로 층류 조직 배양 후드를 닦아내고 멸균 세포 배양 플레이트를 모읍니다. 세포 배양 플라스크, PBS 멸균 수술 기구, 세포 스크레이퍼, 튜브 홀더, 25ml 스트립 펫, 뭉툭한 끝 바늘이 장착된 5ml 주사기. 알파 MEM 및 EGM 2세포 배양 배지를 37도 수조에서 예열하는 것을 잊지 마십시오.

이제 탯줄을 층류로 옮기고 PBS에서 두 번 씻습니다. 오염된 혈액을 제거하려면 멸균 5ml 주사기를 사용하여 한쪽의 탯줄 정맥을 캐뉼링합니다. 이제 액체가 흘러나올 때까지 PBS로 제대 정맥을 헹굽니다.

코드의 다른 쪽 끝은 붉은 색조 없이 완전히 투명해집니다. 75제곱센티미터 플라스크에 15-20밀리리터의 예열 EGM 2 배지를 채워 내피 집락을 형성하는 전구 세포 분리를 시작합니다. 멸균 PBS로 채워진 새 접시에 탯줄을 넣고 수술용 가위를 사용하여 탯줄을 각각 약 5cm 길이의 두 조각으로 자릅니다.

이제 수술 용 가위의 한쪽 날을 삽입하고 정맥을 세로로 자릅니다. 이 시점에서 보조자는 집게를 사용하여 정맥을 잡고 추가 절단이 이루어지는 동안 정맥을 잡을 수 있습니다. 열린 정맥이 있는 코드를 새 플레이트에 놓습니다.

PBS가 없으면 세포 스크레이퍼를 사용하여 정맥의 내부 표면을 최소 1cm 영역에 문지릅니다. EGM 2 매체에서 스크레이퍼를 세척하여 문지른 용기 세포를 플라스크로 방출합니다. 이 절차는 최대 10회까지 반복해야 합니다.

플라스크를 닫고 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%로 설정된 인큐베이터에 넣습니다. 이제 e CFC가 분리되었으므로 MSC로 넘어가겠습니다. 이제 내피층을 긁어냈으므로 멸균 메스를 사용하여 탯줄을 아주 작은 조각으로 자릅니다.

1-2 밀리미터. 멸균 집게를 최대한 사용하여 이러한 조각을 사전 라벨링된 배양 플레이트로 옮길 수 있습니다. 조각이 플라스틱 표면에 부착될 수 있도록 배지로 채우기 전에 접시를 최소 5분 동안 열어 두십시오.

가능한 가장 낮은 속도를 사용하여 30-35 밀리리터의 예열 알파 변형 MEM을 부드럽게 첨가하십시오. 플레이트를 닫고 이산화탄소 37%와 습도 5%로 설정된 인큐베이터에 95%를 넣습니다. 탯줄 조각에서 중간엽 기질 세포가 자라는 데는 3일에서 7일이 소요되며, 그 후 세포가 확장될 수 있습니다.

한편, ECFC를 확장할 수 있으며 다음 단계에서 보여줍니다. 다음 날에는 도립 현미경을 사용하여 세포를 검사합니다. 스크래핑 절차가 제대로 수행되면 첫 번째 증식하는 세포 클러스터를 완전히 볼 수 있습니다.

E GM 두 개의 매체를 교체하여 부착되지 않은 모든 세포와 입자를 제거합니다. 세포를 계속 확장하고 일주일에 두 번 배지의 1/3을 교환하십시오. 10일에서 12일 후에는 매우 큰 내피 군락이 정기적으로 관찰됩니다.

이제 배지를 제거하고 PBS로 세척하여 남은 단백질 사용을 제거하십시오. 0.05 % 트립신 0.7 밀리 몰 EDTA를 사용하여 세포를 분리합니다. 세포를 새로운 배양 용기로 옮길 때는 낮은 파종(seeding) 밀도를 달성하기 위해 적절한 크기의 플라스크를 선택해야 합니다.

이것은 추가 확장에 도움이 될 것입니다. 우리 실험실은 일반적으로 20개 이상의 큰 군체에서 자손을 4225제곱센티미터 플라스크로 후퇴시킵니다. 일주일에 두 번 배지의 1/3을 교체하는 것을 잊지 마십시오.

다음 섹션에서는 MSC 확장에 유사한 프로토콜이 사용됩니다. 3일에서 7일이 지나면 도립 현미경을 사용하여 부착된 조직 근처에 방추 모양의 세포가 나타나는지 확인합니다. 세포가 충분히 자랄 때, 조각들은 플라스틱과의 접촉을 잃으면서 부착되는 경향이 있습니다.

10-12일 후에 조직 조각을 제거합니다. 트립신 EDTA 용액을 사용하여 플라스틱에서 MSC를 분리하고 세포 증식 중 낮은 파스딩 밀도를 보장하기 위해 적절한 크기와 개수의 새로운 배지 미리 채워진 배양 플라스크로 세포를 전달합니다. 두 세포 유형이 모두 확장되면 일주일에 두 번 배지의 1/3을 교환해야 합니다.

염색 후 유세포 분석을 수행하여 전구 표현형을 나타내는 세포 표면 마커 발현을 검출하고 조혈 세포에 오염이 없는지 확인할 수 있습니다. 순수하게 수확된 e CFC를 세포 배양 플레이트에 제곱센티미터당 3개 또는 10개의 매우 낮은 도금 밀도로 파종하여 단일 콜로니 성장을 보장하고 배지의 1/3을 14일 후 일주일에 두 번 교환합니다. 문화의 종말.

매체를 제거합니다. PBS로 두 번 세척하고 얼음 냉 고정 용액으로 콜로니를 고정합니다.냉장고에서 15분 동안 고정 용액을 버리고 플레이트를 열어 10분 동안 건조시킵니다. 10분 동안 증류수로 세포를 재수화합니다.

Harris Hematin 용액을 넣고 고정 콜로니를 12분 동안 염색합니다. 적혈구 용액을 제거하고 수돗물로 플레이트를 헹굽니다. 남아 있는 염색 용액을 제거합니다.

실체 현미경을 사용하여 각 군체의 사진을 찍고 jpeg 또는 TIFF 형식 파일을 컴퓨터로 가져옵니다. 이미지 J 소프트웨어로 사진을 열고 다음 애니메이션에 설명된 대로 각 군체의 정확한 세포 수를 분석합니다. 이미지 J 소프트웨어를 열고 풀다운 메뉴의 파일 열기 기능을 사용하여 콜로니 이미지를 가져옵니다.

프로세스를 사용하여 계속 진행합니다. 배경 빼기 기능. 이미지 J 메뉴의 타원형 또는 브러시 선택 기능을 사용하여 군체 여백을 표시합니다.

edit clear outside 기능을 사용하여 주변 이미지를 지우고 이미지 자르기를 선택하여 사진을 자릅니다. 이미지 조정 임계값 기능을 사용하여 임계값을 수동으로 조정하여 모든 셀이 완전히 착색되도록 합니다. 빨강. 를 선택하여 콜로니의 세포 번호를 계산합니다.

입자를 분석하고 분석합니다. 각 셀 유형에 최적화된 적절한 설정을 선택하고 올바르게 수행된 경우 확인을 선택합니다. 이 프로토콜은 인간 내피 및 중간엽 전구 세포의 특성을 공유하는 거의 순수한 세포 집단을 분리할 수 있으며, 이들은 동일한 코드에서 파생되기 때문에 서로 자가

5일차부터 방추형 중간엽 세포가 배양판에 부착된 탯줄 조각 아래에서 나타납니다. 하루에서 이틀 후, 전구 세포 또는 e CFC를 형성하는 내피 집락의 첫 번째 클러스터가 도립 현미경으로 볼 수 있게 됩니다. 이 빠르게 성장하는 거대한 e CFC 군락은 11일 후에 형성되었습니다.

MSC와 E CFC는 모두 계면 통과 및 추가 확장이 가능합니다. 적절한 표현형을 확인하기 위해 유세포 분석을 사용하여 모든 배양 산물에 대한 후속 분석을 권장합니다. 내피 계통과 중간엽 계통은 모두 CD 73, CD 1 46, CD 29 및 CD 1 0 5에 특이적인 항체에 반응한다는 점을 기억하십시오.

MSC는 대퇴골 1을 발현했는데, 이는 항 CD 90 항체를 사용하여 검출되었습니다. E CFC는 혈소판 내피 세포 접착 분자 또는 pcam이라고도 하는 CD 31에 대해 양성입니다. E CFCs(Chlorofluorocarbons·염화불화탄소)에 의한 코드 내 CD 34 면역반응 발현은 반복 배양을 통해 감소될 수 있다는 것은 잘 알려진 사실입니다.

CD 45 H-L-A-D-R 및 CD 14와 같은 혈액 세포 마커는 두 세포 유형 모두에서 음성을 유지했습니다. E CFC 중 전구 세포 계층은 각 단일 콜로니의 정확한 세포 수를 계수하여 Image J 소프트웨어를 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 인간 탯줄 코드에서 메이스와 ECE를 분리, 확장 및 분석하는 방법을 보여주었습니다.

무균 상태에서 작업하고 후속 연구에서 세포를 사용하기 전에 표현형과 순도를 확인하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.