형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

이 기술에서 유리 커버 슬립은 불활성 및 비오틴 페그 분자의 혼합물로 기능화됩니다. 이 기능화된 표면으로 플로우 셀이 생성되어 잔디 현미경에 배치됩니다. 비오틴화된 롤링 서클 템플릿은 다가 스트렙타비딘을 사용하여 표면에 부착됩니다.

repli zone 단백질과 뉴클레오티드를 첨가하여 기질을 복제하면 생성된 이중 가닥 DNA가 층류로 확장되고 inter collating dye를 사용하여 실시간으로 이미지화됩니다. 안녕하세요, 저는 하버드 의과대학 생물화학 및 분자 약리학과 Antoine Van Ian 연구실의 Nathan Tanner입니다. 저는 Van Noian 연구소의 Joe Laro입니다.

오늘은 단일 분자 수준에서 실시간으로 DNA 복제의 형광 이미징 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 개별 복제 복합체의 조정된 DNA 합성 활성을 연구합니다. 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면 TBS 완충액에 10배 이상의 올리고를 추가하여 M 13 단일 가닥 DNA에 비오틴화된 꼬리 올리고를 65°C로 가열한 다음 가열 블록을 꺼서 서서히 냉각하여 프라이머를 적절하게 냉각시킵니다. 이제 프라임 M 13이 준비되었으므로 D NDP와 염화마그네슘을 포함하는 64 나노몰 T 7 DNA 중합효소 및 T 7 복제 완충액의 혼합물에 첨가하고 섭씨 37도에서 12분 동안 반응을 배양합니다. 배양이 끝나면 100 millimolar EDTA로 담금질합니다.

다음으로, 채워진 생성물 DNA를 페놀 이소 아밀 알코올 클로로포름으로 정제하고, 추출 및 투석하여 TE 완충액 또는 기타 적절한 저장 완충액으로 다시 추출하여 각 유기 상을 추출하여 잔류 프라이밍을 회수합니다. 투석 후에 M 13는 UV 힘 분광 광도계를 가진 DNA 농도를 결정합니다. 주형 전처리를 한 번 반복하면 수백에서 수천 개의 단일 분자 실험을 위한 충분한 나노몰 농도의 주형을 만들 수 있습니다.

이제 DNA가 준비되었으므로 기능화된 커버 슬립을 준비합니다. 복제할 DNA는 Amil Lane으로 기능화된 유리 커버 슬립에 부착되고, Amil의 Oxy 그룹은 유리에 결합하여 비오틴화된 페그 분자와 결합할 수 있는 아민을 남깁니다. 이 코팅은 표면에 대한 비특이적 결합을 줄이는 데 도움이 됩니다.

유리 커버 슬립을 철저히 청소하려면 염색 항아리에 넣고 항아리에 에탄올 초음파 산염을 채 웁니다. 30분 동안 항아리를 헹구고 1몰 수산화칼륨을 30분 동안 Sosonicate로 채우고 두 세척을 모두 반복합니다. 첫 번째 기능화 반응을 위해서는 물의 모든 흔적을 제거해야 합니다.

염색 용기에 아세톤을 채우고 10분 동안 초음파 처리합니다. 항아리를 비우고 아세톤으로 다시 채웁니다. 항아리에 사인 시약을 넣고 2분 동안 교반합니다.

그런 다음 많은 양의 물로 담금질하십시오. 그런 다음 섭씨 110도의 오븐에서 30분 동안 구워 커버 슬립을 건조시킵니다. 다음으로, 유리 커버 슬립 스페이서를 포함하여 주입된 페그에서 부피당 약 0.2%의 중량으로 PEG 혼합물을 준비하고, 커버 슬립을 분리할 수 있도록 하고, 100마이크로리터의 피펫을 건조한 사일로화된 커버 슬립 상에 놓을 수 있습니다.

그 위에 두 번째 커버 슬립을 놓습니다. PEG 용액에서 커버 슬립을 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 커버 슬립 쌍을 분리하고 물로 광범위하게 씻으십시오.

커버 슬립의 기능화된 면이 위로 향하게 하려면 한쪽 면만 페그로 코팅되므로 주의하십시오. 마지막으로, 커버 슬립을 압축 공기로 건조시키고 건조제에 진공 상태로 보관하면 표면이 최소 한 달 동안 안정적으로 유지됩니다. 따라서 수십 개의 커버 슬립을 한 번에 만들어 필요에 따라 사용할 수 있습니다.

이제 커버 슬립이 준비되었으므로 단일 분자 실험을 위한 플로우 챔버를 조립할 수 있습니다. 먼저 BSA가 포함된 20-25밀리리터의 차단 버퍼를 건조제에 넣어 이후 단계를 위해 기포를 제거합니다. 다음으로, 25마이크로리터의 스트렙타비딘을 100마이크로리터의 PBS에 희석하고 용액을 페그 기능화된 커버 슬립 표면에 펴 바르고 실온에서 20분 동안 배양하여 챔버의 다른 부분을 준비하면서 스트렙타비딘이 표면 비오틴에 결합할 수 있도록 합니다.

커버 슬립이 인큐베이팅하는 동안 플로우 챔버를 조립하는 데 사용되는 석영 슬라이드의 크기와 일치하도록 양쪽에 뒷면이 있는 양면 테이프 조각을 자릅니다. 테이프에 흐르는 챔버의 윤곽을 테이프에 그릴 수 있도록 연필로 테이프의 튜브 구멍 위치를 표시합니다. 구멍을 표시한 후 표시 주위에 2mm 너비의 직사각형을 만듭니다.

이 직사각형은 흐름 채널 역할을 하므로 직선면을 만들고 튜빙 입구와 출구 주위에 공간을 남겨 두십시오. 이제 그려진 윤곽을 따라 표시된 테이프를 자르고 접착제가 채널로 튀어 나오지 않도록 직선으로 깨끗하게 자릅니다. 이전 실험에 사용된 플로우 셀 구조에서 접착제를 제거하기 위해 아세톤을 사용하여 석영 슬라이드를 철저히 청소합니다.

채널 윤곽선의 최적 정렬을 찾습니다. 접착 뒷면의 한쪽 면을 제거하고 테이프를 코트 슬라이드에 조심스럽게 놓습니다. 입구와 출구 구멍이 막히지 않은 상태로 유지되어야 하므로 테이프를 올바르게 정렬하도록 주의하십시오.

다음으로, 플로우 셀(flow cell)의 입구와 출구를 위한 0.76mm 튜브의 튜브 절단 길이를 준비합니다. 튜브가 챔버 바닥에 평평하게 눌리지 않도록 튜브의 끝을 약 30도 각도로 절단하는 데 도움이 됩니다. 다음 단계에서 플로우 셀에 쉽게 부착할 수 있도록 시험관 랙에 튜브를 매달아 놓습니다.

이제 커버 슬립 배양이 완료되었습니다. 연쇄상구균 아비드 ENC 코팅 커버를 헹구고 물로 완전히 미끄러뜨린 다음 압축 공기를 사용하여 건조시킵니다. 커버 슬립을 뒤집지 않도록 주의하면 한쪽 면만 기능화되어 있으므로 주의하세요.

마지막으로, 테이프 뒷면의 다른 쪽을 제거하고 석영 슬라이드를 커버 슬립에 올려 놓아 플로우 챔버의 조립을 완료합니다. 커버 슬립을 가볍게 눌러 접착제에 갇힌 공기를 빼냅니다. 이렇게 하면 기포가 흐름 채널로 들어가는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.

챔버의 측면을 에폭시로 밀봉하십시오. 절단된 튜브를 석영의 구멍에 삽입하고 에폭시로 제자리에 밀봉하고 몇 분 동안 건조시킵니다. 에폭시 씰이 건조되면 표면 차단을 시작합니다.

21 게이지 바늘을 사용합니다. 튜브 중 하나를 통해 Degas 차단 버퍼의 일부를 당깁니다. 몇 번 플러시하여 기포를 제거하고 챔버가 단일 분자 복제로 이동하기 전에 최소 30분 동안 배양하도록 합니다. 실험.

이제 플로우 셀(flow cell)이 차단되었으므로 현미경 스테이지에 놓습니다. 스테이지 클립으로 챔버를 제자리에 고정하고 흐름 채널이 y축을 따라 정렬되어 있는지 확인합니다. 더 큰 직경의 커넥터 튜브를 사용하여 플로우 셀 배출 튜브를 주사기 펌프에 연결합니다.

주입구를 차단 버퍼에 놓고 주사기를 뒤로 당겨 튜브의 공기를 제거합니다. 배출 튜브를 부드럽게 튕기면 플로우 셀에 갇힌 기포를 제거하는 데 도움이 됩니다. 이제 DNA를 추가하고 DNA의 우수한 표면 커버리지를 허용하기 위해 30분 동안 분당 0.025밀리리터와 같은 적당한 유속으로 챔버로 유입되는 1밀리리터의 차단 완충액 흐름에 스톡 DNA 템플릿을 25피코몰라로 희석합니다.

DNA가 챔버에 들어가면 최소 200개의 플로우 셀 부피에 대해 차단 완충액 세척을 사용하여 초과 DNA를 세척합니다. 모든 무료 DNA를 제거하려면 레이저와 카메라를 켜십시오. 냉각된 CCD는 사용하기 전에 온도에 도달해야 합니다.

과잉 DNA를 씻어내고 복제 완충액을 탈기한 후, 복제 완충액에 복제 반응 혼합물 뉴클레오티드 DTT와 사이톡스를 준비합니다. 그런 다음 단백질을 넣고 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 반응 혼합물을 플로우 셀(flow cell)로 유동시킵니다.

여기서 유속은 이중 가닥 DNA를 2mm 너비로 늘릴 수 있을 만큼 충분해야 합니다. 100마이크로미터 높이의 유동 채널은 분당 0.04밀리리터가 잘 작동합니다. 혼합물이 챔버에 들어갈 때까지 약 10분 동안 기다립니다.

시야를 채널 측면으로 이동하고 접착 재료에 초점을 맞춰 초점을 맞추고 이미징을 시작할 수 있도록 표면 근처에 있는지 확인합니다. 레이저 파워 현미경 초점과 잔디 각도를 조정합니다. 염색된 DNA의 사진 절단을 방지하기 위해 전력을 낮게 유지하십시오.

DNA 복제 속도에 따라 몇 분 동안 초당 1-5프레임으로 획득합니다. 더 긴 복제 궤적을 얻기 위해 반복하거나 거의 모든 반응 혼합물이 cyt와 함께 더 많은 완충액으로 세포 흐름으로 펌핑되었을 때 더 많은 분자를 보기 위해 다른 시야를 보기 위해 반복합니다. 서로 다른 복제 분자의 여러 이미지를 촬영하면 생산성 결정을 위한 통계를 얻을 수 있습니다.

롤링 서클에서. 복제 분석, 선행 강도 합성은 원과 표면을 연결하는 꼬리를 확장하고, 꼬리는 지체 가닥 중합효소에 의해 이중 가닥 DNA로 변환되고 표시된 층류에 의해 늘어납니다. 다음은 532 나노미터 여기(excitation)에서 cyt orange를 사용한 시야의 예입니다.

작은 형광 반점은 복제되지 않은 기질로 묶여 있습니다. 제품의 길이가 매우 길고 필드당 제품 수가 많다는 점에 유의하십시오. 일반적인 시야는 섭씨 37도에서 염색된 DNA 대장균 실험의 밝은 선이 성장함에 따라 표면 밀도에 따라 필드당 5개에서 50개의 분자를 제공하는 수많은 복제 분자를 보여줍니다.

T 7 repla zone은 훨씬 더 효율적으로 시작하며 필드에 있는 분자의 50% 이상을 복제합니다. 이러한 높은 밀도에서는 여기에서 볼 수 있듯이 개별 분자를 분해하기가 어렵습니다. 따라서 더 낮은 단백질 농도 또는 표면 밀도에서 T 7 실험을 수행하고, 대장균의 일반적인 복제 분자에 대한 차임 그래프를 포함하고, T 7 실험에는 대장균 및 T 7 분자의 종말점 궤적이 포함되며, 이 예에서는 대장균에 대해 초당 467.1 염기쌍과 초당 99.4 염기쌍을 구하기 위해 선형 회귀 분석이 맞춰집니다.

T 7의 경우, 단일 분자 궤적에 맞는 단일 분자 궤적의 속도 분포는 대장균에 대해 초당 평균 535.5 플러스 마이너스 39 염기쌍과 초당 75.9 플러스 또는 마이너스 4.8 염기쌍을 제공합니다. T 7의 경우, 복제 산물의 길이 분포는 생산성을 얻기 위해 단일 지수 붕괴에 적합하며, 이는 대장균의 경우 85.3 플러스 또는 마이너스 6.1 킬로 염기 쌍이고 G 7의 경우 25.3 플러스 또는 마이너스 1.7 킬로 염기 쌍입니다. 그런 다음 단일 분자로 조정된 DNA 복제를 측정하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 커버 슬립을 적절하게 기능화하고 깨끗한 직선 흐름 채널을 만드는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 레이저 출력 부하를 유지하고 긴 DNA의 광 절단을 최소화해야 합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.