2009년 11월 5일
분석 초원 심 분리기 (AUC)은 샘플 셀이 샘플과 참조 버퍼와 실험을하는 동안을 보유하고 있으며 고진공 및 60,000 RPM으로 로터 속도 최대 노출됩니다. 이 동영상은 AUC 실험이 매우 중요한 구성 요소의 조립, 로딩 및 정렬에 필요한 세부 사항에 대한 엄격한 관심을 입증합니다.
안녕하세요, 저는 안드레아 발보입니다. 저는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 피터 섉스(Peter Shucks) 그룹에서 일하고 있습니다. 이 비디오에서는 분석용 초원심분리기 시료 셀의 조립, 로딩 및 로터 정렬에 대한 절차를 시연할 것입니다.
시작하자. 모은. 다음은 분석용 초원심분리기 시료 셀의 구성 요소입니다.셀 하우징 내부에는 12mm 이중 섹터 숯 밭이 쌓여 있으며, 두 개의 창 어셈블리 사이에 끼워질 에폰 중앙 장식이 있습니다. 각 창 어셈블리는 창 개스킷, 창 라이너 및 창 홀더 내부에 고정되는 창으로 구성됩니다.
그런 다음 이 조각은 키 홈을 하우징 배럴 내부에 있는 키, 하우징 개스킷, 나사 링으로 120인치에서 140인치 파운드 사이의 토크 압력으로 샘플 셀을 닫아 셀 하우징 내부로 밀어 넣습니다. 샘플을 참조로 로드한 후, 두 개의 하우징 플러그 개스킷과 하우징 플러그가 셀의 로딩 구멍을 밀봉하여 실험 중 아티팩트, 누출 및 파손을 스캔하지 않도록 모든 구성 요소가 깨끗하고 건조하며 먼지가 없고 최상의 상태여야 하며 자주 검사하고 필요할 때 교체해야 합니다. 또한 분석용 초원심분리기, 티타늄 4홀 로터, 실험실 저울, 판독 가능한 다이얼과 토크 스탠드가 있는 토크 렌치, 평형 및 평형 추, 일자 드라이버, 집게, 긴 테이퍼 피펫 팁이 장착된 200마이크로리터 피펫, 정렬 도구 및 스핀 코트 윤활제가 필요합니다.
우리는 두 개의 창 어셈블리를 결합하여 샘플 셀 구성을 시작합니다. 먼저 창 홀더 바닥에 창 개스킷을 놓습니다. 다음으로 윈도우 라이너를 배치하거나 때로는 윈도우 홀더 내부에 윈도우 쿠션이라고 하여 라이너의 개구부가 홀더의 키홈 반대편에 약간의 각도로 오도록 합니다.
그런 다음 창을 홀더에 놓고 창의 스크라이브 마크를 창 홀더의 열쇠 홈에 맞춥니다. 창 양쪽의 가장자리를 부드럽게 누릅니다. 샘플 셀의 적절한 밀봉과 정확한 트월킹을 보장하기 위해 스크류 링에 하우징 개스킷을 가볍게 코팅합니다.
스핀 코트 윤활제를 사용하여 엄지와 검지 사이에 아주 소량의 스핀 코트를 펴 바릅니다. 나사산 링 나사산을 얇고 보이지 않는 스핀 코트 필름으로 코팅합니다. 마찬가지로 하우징 개스킷을 코팅합니다.
눈에 보이는 윤활제를 닦아내십시오. 샘플 셀 조립을 시작합니다. 창구를 하우징 키에 맞춰 창이 위를 향하도록 하여 하나의 창 어셈블리를 셀 하우징에 밀어 넣습니다.
중앙 피스 키홈을 하우징 키에 맞추고 하우징 내부의 창 어셈블리 위에 부드럽게 떨어지도록 합니다. 중앙 덮개를 셀 하우징에 밀어 넣기 위해 어떤 종류의 도구도 사용하지 마십시오. 이로 인해 센터피스가 영구적으로 손상되어 누출 저장 실험이 발생할 수 있습니다.
두 번째 창 어셈블리를 돌려 창이 중심을 향하고 사용자로부터 멀어지도록 합니다. 키홈을 하우징 키에 맞추고 중앙 피스 위로 아래로 밉니다. 하우징 개스킷을 위에 놓습니다.
그런 다음 out 단어가 보이도록 나사 링을 만듭니다. 손가락을 사용합니다. 그런 다음 정렬 도구를 사용하여 나사 링을 손으로 조입니다.
때로는 중앙 장식이 하우징 배럴로 쉽게 미끄러지지 않습니다. 먼저 정렬한 다음 두 번째 창 어셈블리를 그 위에 배치할 수 있습니다. 창 어셈블리에 부드러운 아래쪽 압력을 가하여.
둘 다 셀 하우징에 동시에 밀어 넣을 수 있습니다. 이런 식으로 중앙 장식을 직접 누르지 않습니다. 이제 세포에서 먼지, 보푸라기 및 지문을 살펴볼 좋은 시기입니다.
또한 중앙과 창문 사이에 아직 공기가 있음을 나타내는 뉴턴의 고리를 볼 수 있습니다. 이것들은 나사 링이 위로 올라가고 단어 out이 보이는 상태에서 토크 한 후에 사라집니다. 샘플 셀을 셀 내부 끝까지 놓습니다.
토크 스탠드의 토크 콜레트. 토크 스탠드 핸들에 일정한 압력을 가하여 셀을 제자리에 고정합니다. 한 번의 연속 동작으로 나사 링을 120인치에서 140인치 파운드 사이로 조입니다.
토크 스탠드 핸들을 풀고 s를 조심스럽게 제거합니다.amp르 셀. 우리는 일상적으로 400 마이크로 리터의 부피를 12mm 중앙 장식의 각 섹터에 적재합니다. 200마이크로리터 피펫을 사용하여 로딩 구멍이 맨 위에 있고 스크류 링의 단어가 보이도록 샘플 셀을 배치합니다.
피펫 팁을 로딩 구멍을 통해 왼쪽 중앙 부분으로 반쯤 밀어 넣고 200마이크로리터의 기준 용액을 천천히 분배합니다. 동일한 피펫 팁과 동일한 기술을 사용하여 총 400마이크로리터까지 한 번 반복하여 신중하고 천천히 수행합니다. 오른쪽 중앙 부분을 400마이크로리터의 시료 용액으로 채웁니다.
reference 및 sample solution의 부피를 가능한 한 가깝게 일치시키는 것이 중요합니다. 피펫 팁을 피펫에 단단히 끼우고, 용액을 천천히 로딩 및 분주하고, 기포가 쌓이지 않도록 하고, 두 용액에 동일한 피펫 팁을 사용합니다. 이 모든 것은 세포를 밀봉하기 위해 부피를 동일하게 유지하는 데 도움이 됩니다.
두 개의 빨간색 하우징 플러그 개스킷을 각 로딩 구멍에 꼭 맞게 놓고 센터피스와 알루미늄 하우징 사이에 조심스럽게 배치되도록 합니다. 각 로딩 구멍을 하우징 플러그로 덮고 작은 일자 드라이버로 손으로 조입니다. 로터를 로드하기 전에 평형추와 평형 반대편에 있는 셀의 무게가 서로 0.5g 이내인지 확인하십시오.
0에서 잔액으로 시작하십시오. 먼저, 균형추 반대편에 위치할 샘플 셀의 무게를 측정합니다. 저울을 찢어 샘플 세포 무게를 뺍니다.
그런 다음 균형의 무게를 잰다. 여기서 우리는 평형벌이 샘플 셀보다 4.193g 더 가볍다는 것을 알 수 있습니다. 4g의 평형 추를 선택하고 평형추의 부착 구멍에 나사로 고정하여 상단에서 튀어나오지 않도록 합니다.
최종 무게가 0.5g 이내가 되도록 균형을 맞춥니다. 4개의 구멍 로터를 사용하여 흰색 화살표가 보이고 원심력 방향을 가리키도록 평형추를 위치 4에 놓습니다. 정렬 도구를 사용하여 로터 안쪽 끝까지 있는지 확인하십시오.
저울 s를 배치하십시오.amp하우징 플러그가 로터 중앙을 향하고 나사 링의 단어가 보이도록 셀을 선택합니다. 다시 말하지만, 정렬 도구를 사용하여 로터 안쪽 끝까지 있는지 확인하십시오. 로터 아래에서 바라본 모습.
내부를 정렬합니다. Scribe, 정렬 도구를 사용하여 카운터밸런스에 스크라이브 마크가 있는 로터 중앙에 가장 가까운 마크를 표시합니다. 같은 방법으로 샘플 셀을 위치 2에 정렬합니다.
모든 셀이 정렬되면 로터를 원심분리기 챔버에 배치할 준비가 된 것입니다.
이 비디오는 분석 초원심분리기 (AUC) 샘플 셀의 조립, 로딩 및 정렬을 보여주며, 이는 AUC 실험에 매우 중요합니다. 정확한 결과를 보장하기 위해 샘플 셀 부품의 적절한 취급 및 준비가 강조됩니다.
Proper assembly and alignment of analytical ultracentrifuge sample cells are critical for generating reliable biophysical data on protein size, shape, purity, and oligomerization states. Meticulous sample cell preparation minimizes experimental artifacts, ensuring data integrity for target validation and mechanistic studies in early drug discovery. This procedural rigor supports predictive confidence in downstream screening and lead optimization workflows.
The analytical ultracentrifuge sample cell workflow integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform go/no-go decisions based on target behavior and stability.