표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

개별 분자의 역학을 장기간에 걸쳐 연구하기 위해서는 먼저 분자를 공간적으로 국소화해야 합니다. 저희는 미세유체 셀의 표면에 분자들을 고정함으로써 이를 수행합니다. 이 과정은 바이오분자들이 고정될 4개의 챔버가 포함된 셀을 조립하는 것으로 시작됩니다.

챔버는 입구 및 출구 모세관을 통해 외부와 연결됩니다. 셀은 패턴화된 PDMS 디스크를 쿼츠 커버슬립에 융합하여 제작합니다. 조립된 셀을 형광 현미경에 장착하고 유연한 튜브를 모세관에 연결하여 챔버 내의 용액을 쉽게 교체할 수 있도록 합니다. 분자 고정을 위해 표면을 활성화하려면 먼저 채널 중 하나로 biotinylated BSA 용액을 흘려줍니다.

BSA가 챔버에 흡착됩니다. 그 다음 표면에 스트렙타비딘(streptavidin) 용액을 흘려주면, 스트렙타비딘이 비오틴(biotin)에 결합합니다. 마지막으로 비오틴화된 올리고뉴클레오타이드(biotinylated oligonucleotide)를 흘려주면, 이것이 스트렙타비딘에 결합하여 표적 분자를 쿼츠 커버슬립 표면에 고정하게 됩니다.

형광체의 수명 안정성과 강도를 극대화하도록 설계된 이미징 버퍼를 전체 획득 기간 동안 챔버에 일정 속도로 흘려줍니다. 자동화된 설정은 표면의 서로 다른 구역을 스캔하여 공여자(donor) 및 수용체(acceptor) 형광체를 모두 가진 분자를 탐색한 다음, 이를 하나씩 프로빙 볼륨으로 이동시켜 두 형광체가 광퇴색될 때까지 각각의 형광 강도 시간 추적 곡선을 얻습니다. 안녕하세요, 보스턴 대학교 의생명공학과 밀러 교수님 연구실의 Nicholas Dfi입니다.

오늘은 공초점 설정을 사용하여 고정된 핵산으로부터 단일 분자 F trace를 얻는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 핵산 역학과 핵산 및 효소 간의 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

Microfluid Excel은 패턴화된 2 mm 두께의 폴리디메틸실록산(PDMS) 디스크를 깨끗하게 세척한 쿼츠 커버슬립에 접합하여 제작합니다. 패턴화된 PDMS 디스크를 만들기 위해 실리콘 엘라스토머 베이스 10부와 경화제 1부를 혼합한 후, 진공 상태에서 1시간 동안 탈기합니다. 엘라스토머 베이스의 탈기가 완료되면, 이를 마이크로유체 셀 몰드에 천천히 붓습니다.

엘라스토머 혼합물을 70 °C의 핫플레이트에서 2시간 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면 면도날을 사용하여 몰드에서 PDMS 디스크를 조심스럽게 떼어냅니다. PDMS 디스크에는 30 µL 크기의 직사각형 챔버 4개가 포함되어 있습니다.

채널이 없는 PDMS 디스크의 평평한 면을 두 표면 모두 30초 동안 플라스마 산화시켜 1인치 유리 윈도우에 접합합니다. 유리 윈도우의 채널 양 끝에는 이전에 뚫어 놓은 2mm 구멍 8개가 있습니다. 다음으로, 2인치 길이의 유연한 용융 실리카 모세관 튜브를 각 유리 윈도우 구멍에 삽입합니다.

이를 위해 먼저 바늘을 삽입한 다음, 모세관 튜브가 채널에 닿을 때까지 삽입하십시오. Quick Cast와 같은 급속 경화 실리콘 캐스팅 화합물을 사용하여 유리 윈도우 구멍을 밀봉하십시오. 셀과 piranha 용액으로 새로 세척한 1인치 원형 쿼츠 커버슬립을 30초 동안 플라즈마 활성화한 후, 채널을 에탄올과 물로 헹구십시오.

채널이 포함된 셀의 측면에 커버 슬립을 융합시킵니다. 이제 챔버가 밀봉되었습니다. 조립된 셀을 상온에서 하룻밤 동안 경화시킵니다.

조립된 마이크로플루이딕 엑셀(microfluid Excel)을 하룻밤 동안 경화시킨 후, 맞춤 제작된 홀더에 넣어 공초점 현미경의 스테이지에 장착하여 셀 표면 활성화를 시작합니다. 분자 고정화를 위해, 주사기와 바늘을 이용한 버퍼 주입이 용이하도록 셀의 모세관에 유연한 튜브를 연결합니다. 이제 버퍼 A에 녹인 0.1 mg/mL biotinylated BSA 용액을 채널에 주입하고 최소 30분 동안 배양합니다.

30분간의 배양 후, 채널 내에서 흡착되지 않은 biotinylated BSA를 제거하기 위해 300~500 µL의 buffer A를 흘려줍니다. 이때 챔버 내에 공기 방울이 갇히지 않도록 주의하십시오. 다음으로, buffer A에 희석된 0.1 mg/mL STR din 용액을 주입하고 15분 동안 배양합니다.

15분간의 배양 유동 후, 채널 내에 흡착되지 않은 strep din을 제거하기 위해 300 내지 500 µL의 버퍼 A를 흘려줍니다. 이전과 마찬가지로 챔버 내에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 3 내지 5 pM 농도의 비오틴화된 시료 용액을 흘려줍니다.

형광 분자의 커버리지를 확인하기 위해 표면 스캔을 수행합니다. 비오틴화된 샘플을 10분 동안 인큐베이션하고 버퍼 흐름을 반복합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 이미징 버퍼(IB)는 효소 산소 제거 시스템과 트롤록스(trolox)와 같은 삼중항 소광제로 구성되어 있어 IB가 먼저 용해되도록 합니다.

5 mg의 trol을 10 mL의 glucose buffer에 넣고 몇 분간 볼텍싱한 후 최소 10분 동안 흔들어 섞습니다. 용액을 필터링하고 진공 상태에서 10분 동안 가스를 제거합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 TRO lock 용액을 Glocky 효소 용액과 부드럽게 혼합합니다.

저장조에 IB 용액을 채웁니다. 그런 다음 기계식 시린지 펌프를 사용하여 유량을 조절하며, 5 µL/min의 일정 속도로 채널에 IB를 흐르게 하고, 완충액에 대기 중의 산소가 용해되는 것을 방지하기 위해 IB 저장조에 아르곤 가스를 버블링합니다. 표면 스캐닝, 분자 위치 지정 및 단일 분자 강도 추적 데이터 수집은 LabVIEW 프로그램으로 제어하며, 20 × 20 µm² 영역을 0.2 µm 해상도로 0.1 µm/ms의 속도로 스캔합니다.

표면 스캐닝 데이터를 즉시 처리하여 배경 수치 이상의 모든 픽셀에 대한 강도 가중 위치를 산출합니다. 고정된 분자들이 발견되면, 이를 하나씩 공초점 부피 내로 이동시키고 공여체 및 수용체 형광체의 강도를 두 형광체가 모두 광퇴색될 때까지 시간의 함수로 기록합니다. 그 후 스테이지가 100 millimeters 떨어진 새로운 원점으로 이동하도록 프로그래밍되며 스캐닝 과정이 반복됩니다.

조립된 MICROFLUID Excel의 모습입니다. 녹색 공여체(donor) 채널과 적색 수용체(acceptor) 채널 내의 단일 분자들을 보여주는 표면 스캔 이미지입니다. 수용체 강도는 적색으로, 공여체 강도는 녹색으로 표시된 몇 가지 전형적인 단일 분자 궤적이 제시되어 있습니다.

지금까지 공초점 셋업을 사용하여 고정된 생체 분자로부터 단일 분자 궤적을 얻는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 매우 까다로운 실험이므로 모든 단계를 신중하게 진행하고 충분한 시간을 갖는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.