Name: 표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 배우세요 표면 고정화된 생분자의 단일 분자 FRET 형광 측정을 위한 자동화 공초점 현미경 시스템 구축 방법을. 미세유체 챔버와 생물소결합을 활용하여 DNA 역학 및 효소 상호작용을 실시간으로 정밀 분석할 수 있습니다.

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우리는 시스템 microfluidic 장치를 설계에 대한 조언과 설치의 가공 부품 하버드 대학에서 롤랜드 연구소에서 직원 조슈아 에델 개발에 자신의 도움을 Chandran Sabanayagam 감사합니다. 우리는 유용한 정보를 UIUC에서 유용 롤랜드 연구소와 보스턴 대학에서 멜러 그룹의 회원들과 토론하고, T. 하의 그룹의 구성원을 인정합니다. 마지막으로, 우리는 국립 과학 재단 (PHY - 0701207) 및 보건 국립 연구소 (GM075893)에서 재정 지원을 주셔서 감사합니다.

1 - microfluidic 셀을 조립 microfluidic 세포가 융합하여 만든 패턴, 갓 청소 석영 커버 슬립에 두께 2mm, polydimethylsiloxane (PDMS) 디스크. PDMS 디스크는 버퍼의 제어 흐름, 각각 버퍼 저수지와 주사기 펌프에 연결된 입구와 콘센트 유연한 모세 혈관으로 액세스할 4 가지 30 μl 사각형 실이 포함되어 있습니다. 흐름 세포는 유리 창문하여 뒷면에 지원하고 온도를 조절하기 위해 열전 요소를 냉각 물을 포함하는 사용자 정의 만든 셀 홀더에 배치됩니다. <ol><li> 패턴 PDMS 디스크를 만들려면 1 부분 경화 에이전트 10 부품 실리콘 엘라스토머 기지를 섞어 잘 혼합하고 진공에서 1 시간 동안 degassing 둡니다. </li><li> 부드럽게 microfluidic 전지 금형에 엘라스토머 믹스를 부어. 우리의 경우, 이것은 부정적인 포토 레지스트로 만든 네 스트립 (1x10 1x10 4 X 3 X 300 μm의)와 1 &quot;실리콘 웨이퍼이다. 70 뜨거운 접시에 치료 맡겨 ° C가 두 시간 동안. </li><li> 조심스럽게 면도날을 사용하여 금형의 치료 PDMS 디스크 껍질. 30 초 동안 양쪽 표면을 산화 플라즈마에 의해 1 &#39;유리 창 (채널의 양쪽에 8 X 2mm 지름 사전 뚫고 구멍을 포함)에 디스크를 융합. PDMS 디스크의 평면쪽으로 유리 창문을 (채널을 포함하지 않는 측면) 퓨즈. </li><li> 이 채널에 도달할 때까지 각각의 유리 창문의 구멍을 통해 2 인치 긴 유연한 융합 실리카 모세관 튜브를 삽입합니다. 먼저 바늘을 삽입 후 모세관과 함께 다음과 같은 것은이 과정을 촉진 수도 있습니다. 퀵 - 캐스트와 같은 빠른 경화 실리콘 주조 화합물을 사용하여 유리 창 구멍을 밀봉합니다. </li><li> 에탄올과 물을 채널 린스, 30 초 동안 갓 청소, 1 인치 원형 석영 커버 슬립과 함께 셀 플라즈마 활성화. 우리는 피라 냐는 물고 기지 너한테 줄을 사용하여이 표지 전표 청소 제안 *. 챔버 스를 밀폐, 채널을 포함하는 세포의 측면에 커버 슬립을 후세. </li><li> 실온에서 하룻밤 치료 조립 세포를 남겨주세요. </li></ol> * 피라 냐가 H 2 O 2, H 1:2.5 비율 2 SO 4의 솔루션입니다. 커버 전표를 청소하려면 90에서 피라 냐는 물고 기지 너한테에 젖어 ° C를 20 분. 2 - 분자 고정을 위해 표면을 활성화 핵산 연구의 경우 단순한 표면 고정 제도는 먼저 코팅의 유리 또는 biotinylated 소 혈청 (BSA) 알부민 후 streptavidin과 함께 석영 커버 슬립을 구성되어 있습니다. 이것은 biotinylated 샘플은 상온에서 일 높은 특이성과 함께 움직일 수 있습니다. <ol><li> 주사기와 바늘을 사용하여 쉽게 버퍼 주사에 대한 모세 혈관 유연한 튜빙을 연결합니다. </li><li> 0.1 버퍼 biotinylated BSA의 MG / ML의 솔루션을 주사 (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 50 MM NaCl는 0.02 μm의 필터를 사용하여 필터링) 적어도 30 분 채널과 부화에. </li><li> 버퍼의 흐름 300-500 μl은 챔버 내부에 기포가 트랩되지 않도록주의하고, 채널에서 모든 무료 biotinylated BSA를 제거합니다. </li><li> 0.1의 솔루션을 주사 버퍼에 MG / streptavidin의 ML 15 분 알을 품다. 그런 다음 3 단계를 반복합니다. </li><li> biotinylated 샘플의 3-5 PM 솔루션을 통해 흐름. 형광 분자의 범위를 확인하기 위해 표면 검사를 수행합니다. 필요하다면, 더 나은 보험을 얻기 위해 샘플 농도를 높일 수 있습니다. 10 분 부화하고 3 단계를 반복합니다. </li></ol> microfluidic 세포는 광학 인코딩 DC 모터를 사용하여 정밀 (최대 25mm) 운동을 허용하는 전동 XY 스테이지에 탑재하고, 고급 (1 NM) 모션 두 폐루프 압전의 액츄에이터를 사용하는 (Physik Instrumente 모델 M - 014 또는 이와 유사한 것). 이 중 앞이나 샘플 고정을 위해 표면을 활성화하면 할 수 있습니다. 3 - 이미징의 버퍼 (IB)를 준비 IB는 Trolox으로 효소 산소 청소 시스템과 트리 플렛 끄는로 이루어져 있습니다. IB가 지속적으로 하룻밤을 통해 플러시되기 때문에, 적어도 10 ML은 사전에 준비되어야합니다. <ol><li> 0.8 % 10 ML W / V D - 글루코오스, 적어도 35 MM 트리스 - HCL 산도 8.0 탈이온수에 NaCl 50 MM를 준비합니다. 버퍼의 높은 농도는 두 가지 이유 때문에 중요하다 : 해소 Trolox는 솔루션을 시어지다되며, 효소 반응은 시간이 지남에 따라 솔루션의 산도를 낮춰드립니다. 이 솔루션은 긴 수명을 가지고 있기 때문에 그것은 주식 솔루션으로 저장할 수 있습니다. </li><li> 몇 분 동안 vortexing 후&gt; 10 분 흔들어하여 1 단계에서 준비 버퍼에 Trolox 5 MG를 디졸브. Trolox는 산도&gt; 7 시에 물에 매우 용해되지 않으므로이 단계를 서두 르 지마. 0.2 μm의 필터와 10 분 진공 degassing두고 사용하여 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 60 μl 웨이트를 혼합하여 &quot;gloxy&quot;효소 솔루션을 준비R, 5 배 버퍼 A, 카탈 라 아제 20 μl, 1 MG 포도당 산화 효소와 10 100 μl가 MG / ML BSA 20 μl. 0.22 μm의의 원심 분리기 필터를 사용하여 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 부드럽게 공기 거품의 형성을 피하기 위해 3 단계에서 &quot;gloxy&quot;솔루션과 함께 2 단계에서 버퍼를 섞는다. </li><li> 흐름 속도를 제어하는​​ 기계 주사기 펌프를 사용하여 5 μl / 분 일정한 속도로 채널을 통해 IB를 흐름. 버퍼로 다시 용해에서 대기 산소를 방지하기 위해 IB 저수지에 거품이 아르곤 가스. </li></ol> 표면 검사, 단일 분자 강도 흔적의 분자 현지화 및 인수는 자동 데이터 수집 1 수 LabView 프로그램에 의해 제어됩니다. 이 프로그램은 0.1 μm의 / MS의 속도, 0.2 μm의 해상도에서 20x20 μm의 두 영역을 검색합니다. 데이터는 즉시 강도 - 가중 배경 카운트 위의 모든 픽셀의 위치를​​ 얻을 수로 처리됩니다. 고정화 분자가 발견되면, 그들은 공촛점 볼륨 및 기증자와 수용체의 형광단의 농도로 하나 하나가 모두 fluorophores의 photobleach 때까지 시간의 함수로 기록 이동됩니다. 단계는 다음 100 μm의 거리에 새로운 기원로 이동 프로그램이며, 스캔 과정은 반복됩니다. 4 - 대표 결과 아래 표면 활성화 이전과 분자 고정 준비 현미경에 장착 후에 조립 microfluidic 세포를 보여주는 몇 가지 이미지가있다. 채널이 성공적으로 활성화되면, 표면 검사 직접 기증 여기 후 기증자 염료 (녹색)와 수용체 (빨간색)의 방출을 보여주는 아래 그려져 스캔과 유사해야합니다. 이러한 분자는 탐색 볼륨으로 하나씩 이동하며 형광이​​ 두 염료의 photobleach 때까지 시간이 지남에 기록됩니다 단일 분자 흔적에 표시됩니다. 다음과 같은 성분부터 차례로 생물 학적 관심의 분자의 구조와 역학을 탐구하는 데 사용되는 순간 기증자 - 수용체의 분리에 알려줍 걱정 효율성을 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" /> 그림 1 : 네 채널 Microfluidic 세포, 입구 / 출구 모세 혈관 각. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" /> 그림 2 : 측정 준비 현미경에 장착 휴대폰. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="그림 3" border="0" /> 그림 3 : SM - 안달 측정을위한 설정. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">여기를 클릭</a> 그림 3의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="그림 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="그림 5" border="0" /> 그림 4와 5 : 고정의 표면 검사의 빨간색과 초록색 채널 녹색 레이저로 흥분 분자를 무서워. 더 큰 버전을 보려면 클릭하세요 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">그림 4</a> , 또는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">그림 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="그림 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="그림 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="그림 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="그림 9" border="0" /> 피규어 6, 7, 8, 9 : 기증자의 강도 궤도 (녹색)와 DNA 분자 8, 10, 16, 간격 18 basepairs에 표시된 수용체 (적색) fluorophores. 의 더 큰 버전을 보시려면 클릭하세요 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">그림 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">그림 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">그림 8</a> , 또는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">그림 9</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
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<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

위의 프로토콜의 특정 시스템 및 염료 (TMR 및 ATTO647N)의 구체적인 선택을 위해 최적화되어 있지만, 그것없이는 유일한 입증 방법을 의미하는 것입니다. 최근 protocatechuic 산성 (PCA) / ​​protocatechuate - 3 ,4 - dioxygenase (PCD)의 구성 대체 산소 청소 시스템은 특정 염료 4 photostability를 증가 표시했다. 이들은 특히 Cy5 5, 일부 염료의 지속적인 점멸을 억제하지 않을 수도 있지만, 이와 같은 β - 메르 캅 토 에탄올 (BME) 같은 다른 플렛 - 상태 quenchers는 대신 Trolox에 사용할 수 있습니다. (BSA) 비오틴 - streptavidin - biotinylated 소 혈청 알부민을 통해 고정이 핵산 연구에 대한 선호하는 선택지만 그것이 아닌 구체적인 접착력 1 방지할 수 있기 때문에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 코팅 표면이 좋은 단백질의 연구에 가장 적합합니다. 또한 하위 회절 - 제한된 크기 vesicles 그것은 표면의 상호 작용 6에 의해 영향을받을 수있는 경우에 관심 생분자을 캡슐 화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서 우리는 형광 강도 흔적를 얻기위한 실리콘 애벌란치 photodiodes 갖춘 공촛점 설정을 사용합니다. 이 프로토콜은 CCD 카메라가 장착된 총 내부 반사 형광 현미경의 (TIRF)와 동일하게 작동합니다. 에 관계없이 현미경의 사용, 기증자 및 수용체의 신호가 올바르게 7 수정 때 앵스트롬 접근 공간적 해상도에 알려줄 수 SM - 초조해.

<table><tbody><tr><td>융해 석영 모세관 튜브</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>융해 석영 커버슬립</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>튜브</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>실리콘 엘라스토머 키트</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Cast 밀봉제</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>실리콘 캐스팅 화합물</td></tr></tbody></table>

표면 고정화 biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

형광 공명 에너지 전달은 (무서워) 현미경이 널리 등 핵산 및 단백질과 같은 생물 학적 관심 분자의 구조와 역학을 연구하는 데 사용되었습니다. 단일 분자가 고정화 분자의 (SM - 프렛) 측정을 걱정하는 것은 오랜 관찰을 허용 시스템 효과적으로 모두 염료가 시간 흔적으로 photobleach - 결과까지 그 분 밀리초에서 timescales 광범로 biomolecular 역학에 대한 리포트입니다. 통계 분석에 대한 흔적을 다수의 인수를 촉진하기 위해 프로세스가 자동화되어야하며 샘플 환경을 단단히 전체 측정 시간 (~ 12 시간)를 통해 제어되어야합니다. 이것은 단일 분자의 수천의 심문은 밤새 수있는 자동 스캔 공촛점 현미경, 그리고 제한된 산소 컨텐츠와 버퍼의 제어 교류를 허용하고 전체 측정 기간 동안 일정한 온도를 유지 microfluidic 세포를 사용하여 수행됩니다. 여기서 우리는 microfluidic 장치를 조립하는 방법과 DNA를 고정에 대한 표면을 활성화하는 방법을 보여줍니다. 그럼 우리가 fluorophores의 photostability과 수명을 최대화하기 위해 버퍼를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 시간이 해결 단일 분자의 자동 수집을 위해 설치 준비에 관련된 단계는 DNA 분자의 흔적이 무서워 보여.

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

형광 공명 에너지 전이(FRET) 현미경법은 생물학적 관심 대상인 분자들의 구조와 역학을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며, ...

개별 분자의 역학을 장기간에 걸쳐 연구하기 위해서는 먼저 분자를 공간적으로 국소화해야 합니다. 저희는 미세유체 셀의 표면에 분자들을 고정함으로써 이를 수행합니다. 이 과정은 바이오분자들이 고정될 4개의 챔버가 포함된 셀을 조립하는 것으로 시작됩니다.챔버는 입구 및 출구 모세관을 통해 외부와 연결됩니다. 셀은 패턴화된 PDMS 디스크를 쿼츠 커버슬립에 융합하여 제작합니다. 조립된 셀을 형광 현미경에 장착하고 유연한 튜브를 모세관에 연결하여 챔버 내의 용액을 쉽게 교체할 수 있도록 합니다. 분자 고정을 위해 표면을 활성화하려면 먼저 채널 중 하나로 biotinylated BSA 용액을 흘려줍니다.BSA가 챔버에 흡착됩니다. 그 다음 표면에 스트렙타비딘(streptavidin) 용액을 흘려주면, 스트렙타비딘이 비오틴(biotin)에 결합합니다. 마지막으로 비오틴화된 올리고뉴클레오타이드(biotinylated oligonucleotide)를 흘려주면, 이것이 스트렙타비딘에 결합하여 표적 분자를 쿼츠 커버슬립 표면에 고정하게 됩니다.형광체의 수명 안정성과 강도를 극대화하도록 설계된 이미징 버퍼를 전체 획득 기간 동안 챔버에 일정 속도로 흘려줍니다. 자동화된 설정은 표면의 서로 다른 구역을 스캔하여 공여자(donor) 및 수용체(acceptor) 형광체를 모두 가진 분자를 탐색한 다음, 이를 하나씩 프로빙 볼륨으로 이동시켜 두 형광체가 광퇴색될 때까지 각각의 형광 강도 시간 추적 곡선을 얻습니다. 안녕하세요, 보스턴 대학교 의생명공학과 밀러 교수님 연구실의 Nicholas Dfi입니다.오늘은 공초점 설정을 사용하여 고정된 핵산으로부터 단일 분자 F trace를 얻는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 핵산 역학과 핵산 및 효소 간의 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.Microfluid Excel은 패턴화된 2 mm 두께의 폴리디메틸실록산(PDMS) 디스크를 깨끗하게 세척한 쿼츠 커버슬립에 접합하여 제작합니다. 패턴화된 PDMS 디스크를 만들기 위해 실리콘 엘라스토머 베이스 10부와 경화제 1부를 혼합한 후, 진공 상태에서 1시간 동안 탈기합니다. 엘라스토머 베이스의 탈기가 완료되면, 이를 마이크로유체 셀 몰드에 천천히 붓습니다.엘라스토머 혼합물을 70 °C의 핫플레이트에서 2시간 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면 면도날을 사용하여 몰드에서 PDMS 디스크를 조심스럽게 떼어냅니다. PDMS 디스크에는 30 µL 크기의 직사각형 챔버 4개가 포함되어 있습니다.채널이 없는 PDMS 디스크의 평평한 면을 두 표면 모두 30초 동안 플라스마 산화시켜 1인치 유리 윈도우에 접합합니다. 유리 윈도우의 채널 양 끝에는 이전에 뚫어 놓은 2mm 구멍 8개가 있습니다. 다음으로, 2인치 길이의 유연한 용융 실리카 모세관 튜브를 각 유리 윈도우 구멍에 삽입합니다.이를 위해 먼저 바늘을 삽입한 다음, 모세관 튜브가 채널에 닿을 때까지 삽입하십시오. Quick Cast와 같은 급속 경화 실리콘 캐스팅 화합물을 사용하여 유리 윈도우 구멍을 밀봉하십시오. 셀과 piranha 용액으로 새로 세척한 1인치 원형 쿼츠 커버슬립을 30초 동안 플라즈마 활성화한 후, 채널을 에탄올과 물로 헹구십시오.채널이 포함된 셀의 측면에 커버 슬립을 융합시킵니다. 이제 챔버가 밀봉되었습니다. 조립된 셀을 상온에서 하룻밤 동안 경화시킵니다.조립된 마이크로플루이딕 엑셀(microfluid Excel)을 하룻밤 동안 경화시킨 후, 맞춤 제작된 홀더에 넣어 공초점 현미경의 스테이지에 장착하여 셀 표면 활성화를 시작합니다. 분자 고정화를 위해, 주사기와 바늘을 이용한 버퍼 주입이 용이하도록 셀의 모세관에 유연한 튜브를 연결합니다. 이제 버퍼 A에 녹인 0.1 mg/mL biotinylated BSA 용액을 채널에 주입하고 최소 30분 동안 배양합니다.30분간의 배양 후, 채널 내에서 흡착되지 않은 biotinylated BSA를 제거하기 위해 300~500 µL의 buffer A를 흘려줍니다. 이때 챔버 내에 공기 방울이 갇히지 않도록 주의하십시오. 다음으로, buffer A에 희석된 0.1 mg/mL STR din 용액을 주입하고 15분 동안 배양합니다.15분간의 배양 유동 후, 채널 내에 흡착되지 않은 strep din을 제거하기 위해 300 내지 500 µL의 버퍼 A를 흘려줍니다. 이전과 마찬가지로 챔버 내에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 3 내지 5 pM 농도의 비오틴화된 시료 용액을 흘려줍니다.형광 분자의 커버리지를 확인하기 위해 표면 스캔을 수행합니다. 비오틴화된 샘플을 10분 동안 인큐베이션하고 버퍼 흐름을 반복합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 이미징 버퍼(IB)는 효소 산소 제거 시스템과 트롤록스(trolox)와 같은 삼중항 소광제로 구성되어 있어 IB가 먼저 용해되도록 합니다.5 mg의 trol을 10 mL의 glucose buffer에 넣고 몇 분간 볼텍싱한 후 최소 10분 동안 흔들어 섞습니다. 용액을 필터링하고 진공 상태에서 10분 동안 가스를 제거합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 TRO lock 용액을 Glocky 효소 용액과 부드럽게 혼합합니다.저장조에 IB 용액을 채웁니다. 그런 다음 기계식 시린지 펌프를 사용하여 유량을 조절하며, 5 µL/min의 일정 속도로 채널에 IB를 흐르게 하고, 완충액에 대기 중의 산소가 용해되는 것을 방지하기 위해 IB 저장조에 아르곤 가스를 버블링합니다. 표면 스캐닝, 분자 위치 지정 및 단일 분자 강도 추적 데이터 수집은 LabVIEW 프로그램으로 제어하며, 20 × 20 µm² 영역을 0.2 µm 해상도로 0.1 µm/ms의 속도로 스캔합니다.표면 스캐닝 데이터를 즉시 처리하여 배경 수치 이상의 모든 픽셀에 대한 강도 가중 위치를 산출합니다. 고정된 분자들이 발견되면, 이를 하나씩 공초점 부피 내로 이동시키고 공여체 및 수용체 형광체의 강도를 두 형광체가 모두 광퇴색될 때까지 시간의 함수로 기록합니다. 그 후 스테이지가 100 millimeters 떨어진 새로운 원점으로 이동하도록 프로그래밍되며 스캐닝 과정이 반복됩니다.조립된 MICROFLUID Excel의 모습입니다. 녹색 공여체(donor) 채널과 적색 수용체(acceptor) 채널 내의 단일 분자들을 보여주는 표면 스캔 이미지입니다. 수용체 강도는 적색으로, 공여체 강도는 녹색으로 표시된 몇 가지 전형적인 단일 분자 궤적이 제시되어 있습니다.지금까지 공초점 셋업을 사용하여 고정된 생체 분자로부터 단일 분자 궤적을 얻는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 매우 까다로운 실험이므로 모든 단계를 신중하게 진행하고 충분한 시간을 갖는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

TIRF 현미경을 사용하여 대규모 공여체-수용체 네트워크에서 smFRET 데이터를 얻기 위한 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 베이지안 추론 소프트웨어인 Fast-NPS를 사용한 이러한 측정의 단계별 분석은 적응된 염료 모델의 적용을 통해 고분해능 구조 정보를 산출합니다.

단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 FRET

여기, 우리는 프로토콜 3 색 smFRET 데이터 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델의 분석을 제시. 이 방법을 과학자 들은 복잡 한 단백질 시스템, cooperativity 또는 서로 상호 작용을 포함 하 여에서 운동 정보를 추출할 수 있습니다.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

이 문서에서는 스위치 켜기부터 정렬 및 초점, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 오픈 소스, 저렴한 smfBox를 사용하여 생체 분자를 자유롭게 확산시키는 개별에 대해 완전히 수정된 정확한 FRET 측정을 만들기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

이 문서는 와이드필드 형광 현미경 검사를 사용하여 모바일, 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET) 기반 프로브의 현면 분석을위한 방법을 제시한다. 새로 개발된 소프트웨어 툴킷을 사용하면 정확한 FRET 효율과 분자 위치를 포함한 움직이는 프로브의 smFRET 시간 추적을 시간의 함수로 판단할 수 있습니다.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

여기에서는 컨포칼 현미경 모드에서 단일 분자 수준에서 시간 분해 형광 이방성을 사용하여 생체 분자의 국소 유연성과 역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

이 프로토콜은 원형질막 단백질의 나노스케일 공간 조직을 해명하기 위한 단일 항체 표지(SAL)를 설명합니다. 단일 분자 수준에서 누적된 항체-에피토프 상호작용을 활용하여 막 SAL(mSAL)은 국소 에피토프 분포를 지도화하는 동시에 천연 세포 환경에서 항체 결합 행동을 포착합니다.

단일 항체 표지를 이용한 막 단백질의 단분자 위치 현미경

배우세요 표면 고정화된 생분자의 단일 분자 FRET 형광 측정을 위한 자동화 공초점 현미경 시스템 구축 방법을. 미세유체 챔버와 생물소결합을 활용하여 DNA 역학 및 효소 상호작용을 실시간으로 정밀 분석할 수 있습니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

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