Name: 난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 학습하세요 SC1을 사용하여 LIF 없이 마우스 배아줄기세포의 자기 갱신을 유지하는 방법을. 면역화학법으로 다능성 마커 발현을 분석하고 비용 효율적인 대안을 확인하세요.

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저자는 그들의 지원과 방향에 대한 스크립스 연구소의 박사 Sheng 딩과 북경 대학의 박사 Hongkui Deng 감사하고 싶습니다.

1. MEF 피더 플레이트의 준비 <ol><li> culturing의 ES 세포 전에 하루의 해동 한 병을 조사 E14.5 CF - 1 MEF의 피더 세포 (ES 세포를 해동하는 방법에 대한 절차를 참조). </li><li> 10000 세포의 밀도에 플레이트 MEF 피더 셀 / 물론 12 잘 플레이트 인치 37 ° C와 5% CO 2 밤새 세포를 품어. MEF 세포 미디어 : DMEM 10 % ES - PBS, 1X 및 1X 글루타민이 아닌 필수 아미노산과 보충. </li></ol> 2. 마우스 ES 세포 자기 갱신의 유지 관리 <ol><li> 트립신을 사용하여 ES 세포를 분리합니다. / 잘 성장 미디어에 이전에 준비 MEF 피더 플레이트 (마네의 멤은 15 % KSR, 4 MM의 L - 글루타민, 0.1 MM 아닌 필수 아미노산과 1X BME와 보충)에 50,000의 세포 밀도에 씨앗 세포가 SC1과 보충 원하는 농도에서 (우리는 100 nm의, 300 NM, 1 μm의 사용). 우리는 또한 1,000 μ / 평범한의 ML과 보충했습니다 잘 긍정적인 컨트롤을 추가했습니다. 37 ° C와 5% CO 2 밤새 세포를 품어. </li><li> 문화 37 세포 ° C와 5% 각 구절에서 3~4일에 대한 CO 2. 새로고침 미디어마다 48시간. </li><li> 패시지 세포 초기 시딩 밀도로 유사한 밀도를 유지하는 트립신과 1시 10분에서 1시 15분까지. 5 구절 후, 세포가 immunocytochemistry를 사용하는 전형적인 pluripotency 마커의 표현에 대한 검사 수 있습니다. </li></ol> 3. Pluripotency 마커 Immunocytochemical 시험 <ol><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> 실온에서 20 분 정착액 500 μl와 세포를 수정. </li><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> 상온에 한 시간 동안 500 μl 차단 버퍼가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다. </li><li> 특정 차 항체 250 μl (1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 그리고 우리가 다음 dilutions에서 Nanog, Sox2, SSEA1, 그리고 Oct4를 사용)으로 세포를 품어 </li><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> (우리가 1 1:2000과 동키의 알렉사 플루어 ® 488과 안티 - 토끼 복합에서 알렉사 플루어와 안티 - 마우스 복합 ® 555 당나귀를 사용하여 빛으로부터 멀리 보관, 상온에서 두 시간 동안 이차 항체 250 μl와 세포를 품어 : 2000). </li><li> 세포에게 PBS로 가볍게 세 번 씻으십시오. </li><li> 마지막으로 씻어 DAPI를 (최종 농도가 1 μg / ML) 추가하고 핵을 시각화하기 위해 5 분 알을 품다. </li><li> 형광 현미경으로 세포를 분석합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 1. 형태 결과 : 마우스 ES 세포 (ESC R1)가 undifferentiated 상태에서 자기 갱신을 유지하기 위해 난생 또는 SC1 중의 면전에서 MEF 피더 세포에서 성장했다. 두 번째 통로 후, 차별화는 평범한 또는 SC1 (대조군)하지 않고 세포에서 관찰 될 수있는 5 구절 후 본질적으로 아무런 undifferentiated 식민지는 관찰되지 않았습니다. 난생 (긍정적인 제어) 처리 식민지는 5 세포 통로를 통해 undifferentiated 상태에 있었다. 300 NM 또는 100 nm의의 농도에서 SC1로 치료 세포도 다섯 구절 후 undifferentiated 남아 그러나, 세포는 네 번째 통로 후 1 μm의 SC1 경험이 세포 죽음으로 취급. (애플 리케이션 노트 그림 2) 표 1은 형태학의 관찰을 요약한 것입니다. 2. Pluripotency 마커 표현 5 구절에 대한 유지 마우스 ES 세포는 SSEA1, Oct4, Nanog와 Sox2에 대한 고정 및 immunocytochemistry에 의해 조사되었다. 마커 표현이 평범한 유지 세포와 유사했다. (애플 리케이션 노트의 그림 3과 4) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 난생 또는 SC1 유지 세포의 형태론 비교. 형태에 차이는 관찰되지 않았습니다. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="그림 2 및 3" /> 그림 2와 그림 3 : Nanog, SSEA1, Sox2, 그리고 SC1 또는 평범한 (애플 리케이션 노트의 그림 4) 유지 ES 세포의 Oct4 염색법. SC1 유지 전지는 평범한 유지 세포와 유사한 pluripotency 표시자 표현을 보여줍니다. 표 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> 대조군 </td><td> 평범한 긍정적인 제어 </td><td> SC1 1uM </td><td> SC1 300 NM </td><td> SC1 100 NM </td></tr><tr><td> 첫째 패시지 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr><tr><td> 둘째 패시지 </td><td> 어떤 차별 형태 </td><td> 일반 ES 셀 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr><tr><td> 셋째 패시지 </td><td> 차별화된 세포의 대부분 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr><tr><td> 넷째 패시지 </td><td> 아무 ESC 식민지 없음 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 세포 죽음은 관찰 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr><tr><td> 다섯째 패시지 </td><td> 차별 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 세포 죽음은 관찰 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td><td> 일반 ES 세포 형태 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

이 문서의 저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 Stemgent 고용하고 있습니다.

작은 분자 SC1은 마우스 ES 세포에서 undifferentiated 상태와 자기 갱신을 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 안된 세포 라인에 사용하기 전에, 그러나, 그것은 최적의 농도를 결정하기 위해 titrated해야합니다. 예를 들어, 마우스 ES 세포 라인 ESC R1 세 농도를​​ 테스트. 100 nm의 300 나노미터 농도가 마우스 ES 세포를 유지 수 있었던 것은, 그러나, 1 μm의 농도가 독성이되었다. SC1 또한 피더 무료 조건에서 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>Nanog 항체</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 항체</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>Oct4 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

난생의 부재에서 자기 갱신 mesc를 지원하기 위해 sc1 (pluripotin)의 사용

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

마우스 배아 줄기 (ES) 세포는 통상 자기 갱신을 유지하기 위해 백혈병 억제 팩터 (난생)와 양식입니다.<sup&gt; 1</sup&gt; 그러나, 난생는 고가이며 LIF/JAK/STAT3 경로의 활성화가 절대적으로 자동 갱신 상태를 유지하기 위해 필요하지 않습니다.<sup&gt; 2</sup&gt; SC1 작은 분자는 평범한하는 경제적인 대안이있을 수 있습니다. SC1 라스 - GAP 및 ERK1의 이중 억제를 통해 기능을 수행합니다.<sup&gt; 3</sup행동의 메커니즘&gt; 그림은 자기 갱신의 근본적인 분자 메커니즘을 연구하기위한 유용한 도구합니다. 여기 SC1의 존재에 culturing 마우스 ES 세포에 대한 절차를 설명하고 그들이 난생의 부재에서 자기 갱신을 유지할 수 있는지 보여줍니다. SC1과 교양 세포는 평범한와 유지 세포에 비해 유사한 형태를 보였다. 모두 다섯 구절 후 일반적인 마우스의 형태를 ES 전시. 전형적인 pluripotency 마커의 표현은 (Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 SSEA1) SC1의 존재에서 다섯 구절 후 관찰되었다. 또한, SC1은 마우스 ES 세포에 대해서는 명백한 독성을 발생하지 않습니다.

SC1 라스 - GAP 및 ERK1의 이중 억제를 통해 기능을 수행합니다. 우리는 난생의 부재에서 마우스 ES 세포 자기 갱신을 지원 SC1의 기능을 테스트하고 SC1은 마우스 ES 세포 배양의 자기 갱신을 유지할 수 있는지 보여주었다.

난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용

마우스 배아줄기(ES) 세포는 일반적으로 자가 재생을 유지하기 위해 백혈병 억제 인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF)와 함께 배양됩니다.1 하지만 LIF는 가격이 비싸며...

안녕하세요, 보스턴 STEM Gen 실험실의 Sarah NAU입니다. 오늘은 저분자 화합물인 C one mouse가 존재하는 환경에서 마우스 배아줄기세포의 자가 재생을 유지하는 절차를 보여드리겠습니다. 마우스 배아줄기세포는 일반적으로 자가 재생을 유지하기 위해 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor)가 존재하는 조건에서 배양됩니다.하지만 L은 가격이 비쌉니다. 따라서 여기서는 경제적인 대안인 저분자 화합물 SC one을 제공하겠습니다. 영상의 마지막 부분에서는 L에서 배양한 세포와 SC one에서 배양한 세포 간의 다능성 마커 발현 비교 결과를 보여드리겠습니다.이제 시작하겠습니다. 배아줄기세포를 배양하기 하루 전, 방사선 조사된 피더 세포(feeder cells) 한 바이알을 해동합니다. 피더 세포를 웰당 10,000 cells의 밀도로 플레이팅합니다.12-웰 플레이트에서 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건으로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 준비된 피더 플레이트의 MEF 피더 층 위에 ES 세포를 웰당 50,000 cells 밀도로 분주합니다. 이때 SC1을 원하는 농도(본 실험에서는 100 nM, 300 nM, 1 µM 사용)로 보충한 성장 배지를 사용합니다.대조군으로, 1000 µg/mL의 LIF를 첨가한 웰을 추가합니다. 이제 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 지속적인 배양을 위해 배지를 교체합니다. 48시간마다 배지를 교체하고, 초기 파종 밀도와 유사한 밀도를 유지하기 위해 3~4일마다 세포를 1:10 비율로 계대 배양합니다. 5회 계대 배양 후에는 면역화학법을 사용하여 전형적인 다능성 마커의 발현을 확인하여 줄기세포의 면역화학 분석을 시작할 수 있습니다.먼저 PBS로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. 4% para formaldehyde 500 µL로 상온에서 20분 동안 세포를 고정합니다. PBS로 세포를 세 번 더 세척한 후, blocking buffer 500 µL를 사용하여 상온에서 1시간 동안 비특이적 결합을 차단합니다.다음으로, 1차 항체 250 µL를 세포에 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 본 실험에서는 nano SOX2, SSEA1 및 OCT4 항체를 사용하여 배양합니다. 다시 한번 세척 과정을 거친 후, 형광 염료가 결합된 2차 항체 250 µL를 세포에 첨가하여 실온에서 빛이 차단된 상태로 2시간 동안 배양합니다. 마지막으로 세포를 세척하며, 이때 마지막 세척액에 DAPI를 최종 농도 1 µg/mL가 되도록 첨가합니다.그 후, 핵을 염색하기 위해 세포를 5분 동안 배양합니다. 마지막으로, 형광 현미경으로 세포를 분석합니다. 여기에는 미분화 상태의 자가 재생을 유지하기 위해 LIF 또는 SC one이 존재하는 상태에서 공급 세포(feeder cells) 상에서 배양된 마우스 ES 세포의 명시야 이미지가 제시되어 있습니다.여기 5회 계대 배양된 마우스 ES 세포가 나타나 있습니다. 세포를 고정하고 SSEA-1, OCT4, Nanog 및 SOX2에 대해 면역세포화학 염색으로 분석하였습니다. C1에서 배양된 세포의 마커 발현은 LIF에서 배양된 세포와 유사하였습니다.지금까지 저분자 화합물 SC one을 사용하여 마우스 배아줄기세포의 자가 재생을 유지하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 테스트되지 않은 세포주에 사용하기 전 적정(titration)을 통해 SC one의 최적 농도를 결정하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

마우스 배아 섬유아세포는 전사 인자 Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc의 강제 발현에 의해 낮은 효율로 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍할 수 있습니다. 재프로그래밍 반응의 드문 중간체는 세포 표면 제작자 Thy-1.2, Ssea-1 및 Epcam에 대한 항체 표지를 통해 분리된 FACS입니다.

재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

여기, 우리는 순진 primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 양적 및 확장 프로토콜을 제시한다.

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

선물이 epigenomically 안정 순 preimplantation epiblast 같은 만능 상태로, 대량, 효율적이 고 신속한 화학 귀선 기존의 혈통 액 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 대 한 프로토콜. 이 방법은 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에 걸쳐 감소 혈통 액 유전자 발현과 감독된 multilineage 차별화에 표시 되어 있는 개선에 발생합니다.

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

다음은 Saccharomyces cerevisiae에서증가 된 복사 번호 억제기 화면을 통해 유전 적 상호 작용을 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 단명한 효모 돌연변이체에서 억제제를 식별, 복제 및 테스트할 수 있습니다. 우리는 autophagy null 돌연변이의 수명에 SIR2의 복사 수 증가의 효과를 테스트합니다.

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

단백 분해 효소 형광 탐지 키트는 fluorometry를 사용하는 프로 테아제 활동의 측정을 위해 설계되었습니다. 그것은 또한 프로 테아제 오염 성분의 검출에 적합합니다. 방법은 FITC - 카제인 표시 기판의 독자적인 배합의 proteolytic hydroysis을 기반으로합니다.

단백 분해 효소의 활동을 확인하는 프로 테아제 형광 검출 키트의 사용

학습하세요 SC1을 사용하여 LIF 없이 마우스 배아줄기세포의 자기 갱신을 유지하는 방법을. 면역화학법으로 다능성 마커 발현을 분석하고 비용 효율적인 대안을 확인하세요.

난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용

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