인간 배아 줄기 세포를 동결 융해

안녕하세요, STEM Gen의 Leah Kent입니다. 오늘은 인간 배아 줄기세포의 해동 및 동결 방법을 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

인간 배아줄기세포를 해동하려면, cryo vial을 액체 질소에서 꺼내어 빠르게 해동합니다. 37 °C 항온수조 내에서, 세포 현탁액을 cryo vial에서 인간 ES 세포 배양 배지가 희석된 conical tube로 옮긴 후 원심분리합니다. 작은 세포 펠릿을 형성하기 위해 상층액을 제거하고, 튜브 내의 세포 펠릿을 신선한 인간 ES 세포 배양 배지로 재현탁한 다음, 이전에 방사선 조사를 통해 처리된 meth feeder layer가 도말된 6-well 세포 배양 플레이트의 한 웰에 플레이팅합니다.

인간 ES 세포를 해동하기 하루 전에, 젤라틴 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 피더 층을 MET 배지에서 플레이팅합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

효율적이고 성공적인 해동을 위해 필요한 모든 장비와 시약을 미리 준비하십시오. 액체 질소에서 human ESL을 꺼내기 전에, 금속 포셉을 사용하여 액체 질소 저장 탱크에서 human E ESL이 들어 있는 극저온 보관 튜브(cryogenic vial)를 꺼냅니다.

장갑을 낀 손으로 바이알을 3~5초 동안 굴립니다. 금속 포셉을 사용하여 바이알 라벨에 기재된 정보를 기록함으로써 성에를 제거합니다. 바이알을 37 °C 항온수조에 담급니다.

바이알을 부드럽게 흔들어주고, 바이알을 빛에 비추어 해동 진행 상황을 자주 하지만 빠르게 확인하십시오. 이는 얼음 결정의 크기를 확인하기 위함입니다. 세포가 오염될 수 있으므로 바이알의 캡 부분이 워터배스에 잠기지 않도록 하십시오.

작은 얼음 결정만 남았을 때, 멸균 생물안전작업대 내에서 바이알을 에탄올에 담가 멸균한 후, 극저온 바이알의 내용물을 15 milliliter 원심 분리관 바닥에 직접 옮깁니다. human ES 세포 배양액 4 milliliter를 튜브에 천천히 첨가합니다.

새 배지를 튜브에 추가하는 동안 튜브를 부드럽게 흔들어 세포가 지속적으로 섞이도록 합니다. human E es 세포를 원심분리기에 넣고 200 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 이전에 준비한 meth 피더 플레이트를 37 °C 인큐베이터에서 꺼내고 세포주, 계대 배수, 해동 날짜와 같이 적절한 human ESL 정보를 기입하여 라벨을 부착합니다.

MEF 배양액을 흡입하여 제거하고 웰에 PBS 1 mL를 첨가합니다. 펠렛 형태의 인간 E ESL을 생물학적 안전 작업대로 다시 옮기고 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이때 세포 펠렛이 함께 흡입되지 않도록 주의하되, 상층액에 동결 보존액의 DMSO가 포함되어 있으므로 가능한 한 최대한 많이 제거하십시오. 재현탁합니다.

2.5 milliliters의 인간 ESL 배양 배지를 첨가하여 펠렛을 매우 부드럽게 현탁합니다. 5 milliliters 유리 피펫을 사용하여 3~4회 피펫팅함으로써 MEF feeder 웰에서 PBS를 흡입하여 제거합니다. 준비된 6-웰 플레이트의 웰에 2.5 milliliters의 인간 ES 세포 현탁액 전체를 천천히 첨가합니다.

플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고, 세포가 웰 전체에 고르게 분산되도록 플레이트를 앞뒤 좌우로 조심스럽게 밀어줍니다. 콜로니가 중앙에 집중되는 것을 방지하기 위함입니다. 플레이트를 원형으로 회전시키지 마십시오.

해동 다음 날, 37 °C 및 5% CO₂ 조건에서 세포를 하룻밤 동안 부착시킵니다. 부유 세포가 포함된 배지를 제거하고, 웰에 2.5 mL의 신선한 인간 ES 세포 배양 배지를 추가합니다.

플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 밤새 배양하고, 콜로니를 계대 배양할 수 있을 때까지 계속 배양합니다. 인간 ES 세포 동결 프로토콜은 6-웰 플레이트에서 배양된 건강한 중간 크기의 인간 ES 세포 콜로니에서 시작합니다. 콜라게나제 4 효소로 배양물을 처리하여 배양한 후, 5 mL 유리 피펫으로 콜로니를 긁어 원추형 튜브에 수집하고 원심 분리하여 느슨한 세포 펠릿을 형성합니다.

상층액을 흡입하여 제거한 후, 세포 펠릿을 재현탁합니다. 먼저 인간 ES 세포 배양 배지로 현탁한 다음, 2배 농도의 동결 보존 배지로 희석합니다. 세포를 1 mL씩 동일하게 분배하여 동결 보관 튜브에 넣고 급속 냉각시킵니다.

세포를 원심분리하는 동안, 안전 캐비닛 내의 냉동 보관 튜브(cryogenic vials)에 세포주의 계대 번호와 동결 날짜를 기입하십시오. 인간 E 배아줄기세포를 동결할 때의 일반적인 밀도는 6-well 플레이트의 1개 well 분량의 세포를 냉동 보관 튜브 1개에 담는 것입니다. 인간 E ESL의 원심분리가 완료되면, 튜브를 다시 생물학적 안전 캐비닛으로 가져오십시오.

튜브에서 상층액을 흡입하여 제거합니다. 느슨하게 뭉쳐 있는 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하면서, 적절한 양의 인간 ESL 배양액으로 세포 펠렛을 재현탁합니다.

냉동 보존용 바이알당 0.5 mL의 인간 ESL 배양 배지를 준비합니다. 인간 E es 세포는 상대적으로 큰 세포 집락 조각 상태로 동결했을 때 회복률이 더 높으므로, 피펫팅 시 매우 주의하십시오. 튜브를 부드럽게 흔들며 천천히 2x 인간 E es 세포 동결 배지를 적당량 첨가합니다.

동결 보존액을 첨가한 후 피펫팅을 통해 매우 부드럽게 혼합하고, 각 냉동 보관 튜브에 세포 현탁액 1 mL를 빠르고 조심스럽게 분주합니다. 튜브를 이소프로판올 동결 컨테이너에 옮겨 -80 °C 냉동고에 하룻밤 동안 보관합니다. 이소프로판올 동결 컨테이너 내에서 세포는 분당 1 °C의 속도로 동결되며, 다음 날 꺼내어 사용합니다.

금속 핀셋을 사용하여 동결된 바이알을 액체 질소 저장 탱크로 빠르게 옮깁니다. 인간 ES 세포를 해동한 후 첫날에는 작은 콜로니가 투명하게 보여 현미경으로 관찰하기 어려울 수 있습니다. 새로 해동된 인간 ESL은 증식 속도가 다소 느린 경향이 있습니다.

확립된 콜로니로 나타나기까지 배양 과정에서 며칠이 걸릴 수 있습니다. 지금까지 인간 배아 줄기세포 배양액을 해동하고 동결하는 방법을 보여드렸습니다. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.