Name: Zebrafish 상악 바벌의 연구 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 학습하세요 제브라피시 상악 바벌의 재생 과정을 연구하는 외과적 절단 및 조직 분석 방법을. 이 기술은 재생 생물학 및 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

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이러한 방법은 지원이 드폴 대학 연​​구위원회와 JT (DE016678)에 NIH / NIDCR R01 부여에 의해 제공되었다 JT의 연구실에서 연구 휴가 동안 장어에 의해 개발되었습니다. 우리는 기꺼이 캐롤라인 헌터, CMRC의 zebrafish 핵심 시설에 동물 보호 기술자와 폴리 Pawluczuk 우리 학부 실험실 조교의 노력을 인정합니다.

Zebrafish 축산 Zebrafish는 표준 방법 1에 따라 위치해와 reared 수 있습니다. 후반 애벌레 기간 과거 zebrafish의 발달 단계는 꼬리 지느러미 (posteriormost hypural 판)의 기지로 윗입술의 anteriormost 시점에서 자사의 표준 길이 (SL) 또는 밀리미터에서 직선 거리로 측정할 수 2. 약 개월 게시물 수정 (10-12밀리미터 SL)에서, 비강과 상악 동의 barbels는 각각의 후각 구덩이 근처와 maxillae의 뒷부분 모서리 등 투명 상피 봉오리를 나타납니다. zebrafish가 성숙으로, barbels가 좁은, 수염 같은 부속으로 연장. 상악 바벌가 큰 (2-3 ㎜)과 조작하기 쉬운이기 때문에, 우리의 프로토콜에만이 특정 부위요 적용, 유사한 기술, 그러나, 작은 코와 수염 적응 수 있습니다. 바벌 클리핑 <ol><li> 시스템 물에 산도 7.0에 버퍼 (에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate) 0.015 % MS - 222에 침수하여 원하는 단계 (예., 1.5-2.5 cm SL ~ 3~6개월 포스트 - 수정)에서 성인 zebrafish을 마취시키다. 수영 동작 그만 때까지 관찰하고 길 환기가 느린 일반됩니다. 물고기의 크기에 따라 완료 마취 약 2~5분 걸립니다. </li><li> 수족관 엄마랑 사용하여 배양 접시에있는 서부 유럽 표준시 종이 타월에 접혀 조각 한 번에 1-3 물고기를 전송합니다. 무딘 주걱을 사용하여, 동양 그들이 서로 왼쪽 측면쪽으로 평행하게되도록 물고기. 절차를 수행하는 동안 피부와 아가미가 촉촉한 유지까지 operculum으로 몸 전체를 덮고 물고기 (길도 포함)의 꼬리 부분에 젖은 종이 타월을 접어 부분입니다. </li><li> 머리 지역을 밝히는 낮은 앵글 입사 광을 사용하여 stereomicroscope 아래의 페트리 접시를 볼 수 있습니다. maxilla의 사후 복부 코너 (그림 1)에서 protrudes 왼쪽 턱의 수염의 기본에 중점을두고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. </li><li> 단단히 maxilla의 가장자리에 약간 말초 바벌의 샤프트를 파악. 바벌 샤프트를 강화하고 포셉 단 근위 미세 밀고 스프링 가위의 문턱을 삽입합니다. 가위는 안정 포셉에 감동하실 수 있습니다. 최첨단의 maxilla의 가장자리에 도달 때까지 바벌의 축을 따라 가위의 문턱을 슬라이드. 바벌 샤프트 잘리는 가위를 닫습니다. 절단 바벌, 아직까지 포셉에 사로잡혔다는 고정 또는 추가 관찰을 위해 제거할 수 있습니다. </li><li> 즉시 표면 곰팡이 감염을 제어하는​​ 파란색 메틸렌 한 방울을 포함하는 청소 시스템 물 (~ 500 ML)의 작은 수조에 물고기를 전송합니다. 물고기가 하루 복구할 수 있습니다. 다음날 아침, 양육 시스템에 물고기를 반환합니다. 바벌 재생 2 주 후에 최대한입니다. </li></ol> 일치하는 바벌의 쌍을 아가르 퍼가기 <ol><li> 적절한 안락사 기술로 물고기를 모아 4 ° C에서 밤새 교반과 호수 (PBS)를 버퍼 4퍼센트 50 ML 튜브 paraformaldehyde - 인산염의 수정. 정착액 볼륨은 조직의 최소 10 배 볼륨해야합니다. 고정 후, 승인된 용기에 paraformaldehyde 폐기물의 처분과 PBS의 여러 변화에 철저하게 조직을 씻어. </li><li> 2 % 250 ML 유리 플라스크 150 ML에서 준비 아가로 오스 (T M ~ 37 ° C) 증류수 인치 완전히 녹아까지 전자 레인지 또는 뜨거운 접시와 열, 주기적으로 agitating. 50-60 ° C의 물을 욕조에 녹은 솔루션을 평형. </li><li> 단단히 버퍼 챔버의 측면에 대해, 작은 gasketed 젤 곰팡이 (~ 100 ML 젤 볼륨 10 × 10cm) 배치하여 표준 젤 전기 영동 장비를 조립. 2-4 작은 이빨 샘플 빗 (4 X 1.5 mm)을 추가합니다. </li><li> 수준의 표면에 아주 얕은 우물을 형성 빗의 기반을 커버 그냥 금형에 녹아 아가로 오스를 부어. 즉시 온수 욕조에 다시 남은 아가로 오스를 넣어, 이것은 조직을 (9-12 단계) 포함 나중에 사용됩니다. 아가로 오스와 같은 온도로 피펫을 유지 술병에 긴 유리 파스퇴르 피펫 놔. </li><li> 20-30분에 대한 강화로 젤을 허용합니다. 빗를 제거한 후 버퍼 챔버에서 강화된 젤이 들어있는 겔 곰팡이를 제거합니다. 겔가 슬라이드되지 않도록 단단히 실험실 테이프로 겔 금형의 열린 측면을 테이프. 추가 아가로 오스가 (단계 13) 나중에 추가될 수 있도록이 테이프는 아가로 오스의 표면 여러 mm를 확장해야합니다. </li><li> stereomicroscope의 무대에 겔 금형을 놓습니다. 빈 우물을 확대하고 초점에 가장자리를 가져. </li><li> 잘 인접 아가로 오스의 표면에, 물 또는 고정 바벌의 표본 (예, 재생 및 제어)가 포함된 버퍼의 드롭을 피펫. UsiNG는 잘으로 촉촉한 표본을 드래그하여 아래로 밀어, 곤충 핀을 구부 러. 동양 바벌 샤프트의 서로 평행하고 잘의 반대 긴 가장자리에 대한 정렬. 표면 장력 위치에서 조직을 보유 도움이 될 것입니다. </li><li> 언제 포함 준비, 훌륭한 피펫 팁 또는 우물에서 여분 액체를 제거하는 실험실 조직의 모서리를 사용합니다. 조직가 건조하게하지 빨리 이렇게 작동합니다. </li><li> 예열 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 장소에서 바벌 조직을 봉인하기 위해 표본과 주변의 신선한 녹은 아가로 오스를 피펫. 너무 많이 넣다하지 마십시오. 아가로 오스는 견고하게하기 전에, 곤충 핀 지난 분을 조정합니다. </li><li> 잘 옆의 숫자 종이 표본 레이블을 장소와 아가로 오스의 작은 방울로를 확보. </li><li> 반복 표본의 각 잘 10을 통해 6 단계를 반복합니다. </li><li> 이미지 보정을위한 원하는 경우, 인쇄 마이크로 미터 규모 (예, 함께 종이를 삽입 <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> 잘 빈의 맨 아래에). 우물의 바닥에 종이를 평평하게하고 따뜻한 아가로 오스로 커버. </li><li> 표본 모두 포함된 후, 젤의 표면은 아가로 오스의 경화 방울과 함께 불규칙한 것입니다. 평평한 표면에 젤을 놓고 상부 표면이 균일 때까지 부드럽게 녹아 추가 아가로 오스에 부어. 부드러운 표면을 얻기 위해 필요한 아가로 오스의 가장 작은 양을 사용하고 너무 아가로 오스는 전송 - 가벼운 사진을 흐릿하게 것입니다. 하든이 상위 계층을 허용합니다. </li><li> 젤 이제 각 바벌 쌍을위한 총 형태를 기록 stereomicroscope의 무대 사진 수 있습니다. 이미지 보정은 임베디드 마이크로 미터 규모를 사진 촬영하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 전체 젤은 서부 유럽 표준시 종이 타올에 싸여 몇 주 동안 4 명이 한 비닐 봉투에 봉인 저장할 수 있습니다. </li><li> 자세한 분석을 위해, barbels의 일치하는 쌍을 포함하는 한천 블록은 메스 또는 레이저 블레이드로 젤 도려낸 수 있으며, 파라핀의 조직학에 대한 처리 또는 표준 방법에 의해 3,4 cryosectioning. 또는 개인 barbels는 물에 씻어서 잘 바늘과 아가로 오스 밖 해부 및 기타 다운 스트림 응용 프로그램 (예 : 전체 마운트 immunohistochemistry 또는 공촛점 현미경)을 처리할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+length%3A+Not+quite+so+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li>
<li>Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+development+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li>
</ol>

zebrafish 턱의 수염은 zebrafish 여​​러 세포 유형의 성장, 유지 보수 및 재생을 공부 underutilized 조직 시스템입니다. 바벌의 돌출부가 더 인간 아날로그가 없다지만, 그것이 포함하고있는 세포 종류 고도 그것이 가능한 광학 명확하고 해부학적인 몸의 구조도 단순 원통형 구조로 피부 땀샘, melanocytes, 순환기 혈관과 신경을 연구하고, 보존하고 있습니다. 잘 공부 꼬리 지느러미와 마찬가지로, 바벌 조직이 절단하여 재생을 유도하실 수 있습니다. 해부 학적 랜드마크로 maxilla의 경계를 사용하여 절단 평면은 바벌 regrowth의 측정을 용이하게, 정확하게 삽입할 수 있습니다. 경험 교환 원을 연결 하시려면, 각각의 수술은 단 몇 초 정도 걸립니다. 복구는 신속하고, 우리는 지금까지 물고기의 행동에 아무런 단기 또는 장기 영향을 감지 없습니다. 한 상악 바벌 수영과 Zebrafish는 최대 6 개월 수술 후, 식사 및 비 수술 컨트롤처럼 효과적으로 번식하고, 조직 컬렉션의 시간을 비교 생존 있습니다. 이 수술의 생리적 영향 1) 바벌에서 실시 extraoral 입맛도 입술, 뺨과 머리 5 포함한 생선 상피의 다른 많은 부분에서 찾을 수 있기 때문에 최소한의 것으로 예측하고, 2) 차별 입맛이에 나타납니다 72 시간 내에 재생 바벌은 (레클레어 외., 게시되지 않은 데이터가 없습니다.) 이것은 상악 바벌 성인 척추의 컨텍스트 내에서 상처 치유, revascularization, 그리고 reinnervation 공부를위한 법으로서 시스템을 만듭니다. 중생의 수술 유도 후, barbels는 고정 조직의 morphometric 측정 및 / 또는 미세한 분석을위한 간격에서 수집된하실 수 있습니다. 편리, 상악 바벌는 cryosectioning 전체 마운트 immunohistochemistry, 그리고 현장에서 파라핀의 조직학 등 많은 표준 프로토콜의 응용 프로그램을 촉진 약 길이 (2-3 ㎜)와 zebrafish 배아의 직경 (1백~2백밀리미터)입니다 하이브 리다이 제이션. 함께 촬영이 기능은 턱뼈 ​​바벌 조직 수리 및 재생을 공부에 대한 생체내 모델에서 매우 가능합니다.

현미경 장비 전송 및 사고 광섬유 조명과 입체 해부 현미경은 바벌 클리핑과 한천 포함 필요합니다. 바벌 클리핑 <ul><li> 생선 시스템 물 </li><li> 이 zebrafish 크로싱 탱크 </li><li> MS - 222 (에틸 -3 - aminobenzoate methanesulfonate, 시그마 화학 # E10521 - 10G) </li><li> 무균 120 mm 페트리 접시 </li><li> 서부 유럽 표준시 종이 타올 </li><li> 뭉툭한 금속 주걱 </li><li> 더몬트 # 55 바이오 Inox 집게 (파인 과학 도구 # 11255-20) </li><li> 미니 Vannas 스프링 가위 (파인 과학 도구 # 15000-00) </li><li> 메틸렌 블루 antifungal 에이전트 (Drs. 포스터 &amp; 스미스 # CD - 905781) </li><li> 작은 수족관 엄마랑 </li></ul> 조직 수집과 한천 삽입 <ul><li> 1X의 4 % paraformaldehyde 인산염 버퍼 호수 (PF - PBS), 50 ML 원뿔 튜브에 aliquoted 및 -20 ° C에서 냉동 저장까지 사용 </li><li> 1X 인산염 버퍼 호수 (산도 7.27-6) </li><li> 250 ML 유리 술병 </li><li> 2퍼센트 증류수의 아가로 오스 </li><li> 표준 작은 아가로 오스 겔 전기 영동의 장비 (겔 크기 = ~ 10cm 정사각형) </li><li> 작은 이빨 전기 샘플 빗 (빗 사이즈 4 X 1.5 mm) </li><li> 온수 욕조 (50-60 ° C) </li><li> 실험실 테이프 </li><li> 블랙은 곤충 핀, 크기 000 (파인 과학 도구 # 26000-25) 에나멜 </li><li> 1-2 핀 홀더 (파인 과학 도구 # 26016-12) </li><li> 9 인치 유리 파스퇴르 피펫 </li><li> 피펫 벌브 또는 펌프 </li><li> 실험실 조직 </li><li> 작은 종이 라벨 </li><li> (옵션) 인쇄 교정 척도 </li><li> 서부 유럽 표준시 종이 타올 </li><li> 지퍼 - 폐쇄 비닐 봉투 </li><li> 메스 / 면도기 블레이드 (한천 블록을 잘라) </li></ul>

zebrafish 상악 바벌의 연구 방법

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels는 어류, 파충류와 양서류에서 발견 피부 감각 부속됩니다. zebrafish, Danio rerio는 barbels - 짧은 코에 한쌍과 긴 상악 쌍 이쌍을 개발하고 있습니다. 바벌 조직은 피부 세포, 땀샘, 입맛, melanocytes, 순환기 혈관과 감각 신경을 포함한 ectodermal, mesodermal 및 신경 크레스트 원산지 세포를 포함하고 있습니다. 대부분의 성인 조직과는 달리, 턱의 수염은 우리가 수명주기 전반에 걸쳐 이러한 조직 유형의 개발 및 유지 보수를 시각화 수 있도록 광학 분명하다. 이 동영상은 상악 바벌 (약 일개월 후 수정을 시작)의 조기 개발을 보여줍니다 및 성인 돌출부 (&gt; 삼개월 후 수정)의 재생을 유도하는 외과 프로토콜을 보여줍니다. 간단히, anesthetized 물고기의 왼쪽 상악의 수염은 maxilla의 꼬리 가장자리에 단지 말초 살균 포셉로 고가이다. 좋아, 멸균 스프링 가위는 절단 평면에 대한 해부 랜드마크를 설립,이 수준에서 바벌 샤프트를 잘라 포셉에 대한 위치입니다. 재생 성장하고, contralateral 바벌에 비해이 비행기와 관련하여 측정할 수 있습니다. 바벌 조직이 부상 2 주 이내에 최대한의 regrowth에 도달, 빠르게 다시 생성합니다. 재생 바벌을 분석하는 기술은 표준 DNA 전기 영동 젤의 우물에서 barbels의 일치하는 쌍 (재생 및 컨트롤)를 해부하고 삽입 등이 있습니다. 임베디드 표본이 편리 총 형태학 및 morphometry위한 stereomicroscope 아래 사진되며, 사전 등 파라핀의 조직학으로 하류 애플 리케이션에 몇 주 동안 저장 cryosectioning 및 / 또는 전체 탑재 immunohistochemistry 수 있습니다. zebrafish의 유전자 컨텍스트 내에서 다중 셀 유형의 재생 능력을 학습에 대한 생체내 조직 시스템의 소설로 상악 바벌 수립 이러한 방법.

zebrafish 턱의 수염은 ectodermal, mesodermal 및 신경 크레스트 파생 상품을 포함 외피의 감각 기관이다. 중요한 것은 어른 바벌은 근위 절단 후 재생하실 수 있습니다. 이 동영상은 상악 바벌 개발을 소개하고 바벌의 표본의 수집, 퍼가기 및 다운 스트림 이미지 다음 재생을 유도하는 외과 프로토콜을 보여줍니다.

Zebrafish 상악 바벌의 연구 방법

수염(Barbels)은 어류, 파충류 및 양서류에서 발견되는 피부 감각 부속기관입니다. 제브라피시(Danio rerio)는 두 쌍의 수염, 즉 짧은 비강...

마블(Marbles)은 양서류, 파충류 및 어류에서 발견되는 감각 구조의 이질적인 집합체입니다. 제브라피시는 작은 비강 쌍과 더 큰 상악 쌍이라는 두 쌍의 마블을 발달시킵니다. 이러한 투명한 부속 기관은 여러 제브라피쉬 세포 유형의 발달, 유지 및 재생을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.이 영상에서는 상악 마블(maxillary marble) 발달을 소개하고 재생을 유도하기 위한 수술 프로토콜을 시연합니다. 며칠 또는 몇 주 후에 가시(barbs)를 수집하고, 이어서 재생 조직과 대조군을 해부 및 포매합니다. 안녕하세요, DePaul 대학교 LeClair 연구실의 Elizabeth LeClair입니다. 그리고 Northwestern 대학교 의과대학 및 Children's Memorial 연구 센터의 Ya Chesky입니다.오늘은 제브라피시 상악골 마블(maxillary marble)을 연구하기 위한 몇 가지 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 이 절차들을 사용하여 제브라피시 마블의 성장과 발달을 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다.수정 후 약 30~40일이 되면, 상악 수염(maxillary barbell)이 상악의 후방 복측 모서리 부근에서 투명한 상피아(epithelial bud) 형태로 나타납니다. 제브라피쉬가 성장함에 따라, 수염은 수 밀리미터 길이의 좁은 수염 다리 부속기관으로 확장됩니다. 성숙한 수염에는 색소 세포, 선 세포, 맛봉오리, 혈관 및 수초화된 신경을 포함한 여러 중요한 세포 유형이 포함되어 있습니다.가장 큰 장점은 marble이 발달의 모든 단계에서 투명하다는 점입니다. 다른 제브라피쉬 장기와 마찬가지로, 상악 수염(maxillary barbell)은 근위부 절단 후 재생될 수 있습니다. 본 섹션에서는 상악 기저부에서 수염을 절단하는 절차를 시연합니다.이는 일측 적출술이라고도 할 수 있습니다. 수술 당일에 물고기 물을 담은 작은 수조 두 개를 준비하며, 하나는 마취용이고 다른 하나는 회복용입니다. 마취 수조에는 pH 7.0으로 완충된 0.015% trica가 포함됩니다.어류 유지수 내의 회복 수조에는 물고기, 물, 그리고 진균 감염을 제어하기 위한 메틸렌 블루 한 방울이 들어 있습니다. 성체 제브라피시 1~3마리를 trica 수조에 침지시켜 마취시키고, 유영 동작이 멈추고 아가미 환기가 느리고 일정해질 때까지 관찰합니다. 물고기의 크기에 따라 완전한 마취까지 2~5분 정도 소요될 수 있습니다.어항용 뜰채를 사용하여 물고기를 페트리 접시 위의 젖은 종이 타월로 옮깁니다. 뭉툭한 스패튤라를 사용하여 물고기들이 서로 평행하도록 정렬합니다. 왼쪽 측면이 위를 향하게 한 상태에서, 물고기의 수분을 유지할 수 있도록 종이 타월의 일부를 물고기 위로 접어 덮어줍니다.다음으로, 저각 입사광을 사용하여 머리 부분을 조명하면서 실체 현미경으로 페트리 접시를 관찰합니다. 미세 핀셋을 사용하여 왼쪽 상악 마블(maxillary marble)의 기부에 초점을 맞춥니다. 상악의 경계에서 약간 원위부(distal)에 있는 마블 샤프트를 단단히 잡습니다.대리석을 들어 올리고, 안정성을 위해 포셉 바로 근위 쪽에 끝이 뾰족한 스프링 가위를 삽입합니다. 가위는 포셉이나 페트리 접시 바닥에 닿아도 무방합니다. 가위 날의 절단면이 상악골 가장자리에 접근할 때까지 대리석의 축을 따라 가위 날을 미끄러뜨립니다.대리석 축을 절단하고 절단된 대리석을 제거합니다. 이 조직은 별도로 고정하여 분석할 수 있습니다. 수술 후 물고기를 회복 탱크로 옮깁니다.물고기가 몇 시간에서 하룻밤 동안 회복될 수 있도록 한 후, 사육 시스템으로 돌려보냅니다. 가시 재생이 일어날 때까지 1~2주를 기다립니다. 다음 섹션에서는 분석을 위해 고정된 marble 조직을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.이 절차는 수술 후 수일, 수주 또는 수개월 후에 수집 및 고정된 대리석어(marble fish)로 시작합니다. 완충 식염수로 고정된 조직을 헹구고 머리 왼쪽에서 재생된 수염을 절제하십시오. 임시 보관용 대조군으로 사용될 오른쪽 수염을 잊지 마십시오.짝을 맞춘 구슬 한 쌍씩을 페트리 접시 위의 생리식염수 한 방울에 피펫으로 옮깁니다. 덮개를 덮고 벤치 위에 그대로 둔 채 자리를 뜹니다. 2% agarose 150 milliliters를 완전히 용해될 때까지 가열하여 겔을 만듭니다.용액을 50~60°C의 워터배스에서 평형 상태로 둡니다. 다음으로, 표준 겔 전기영동 장치를 조립하고 1~4개의 작은 콤(comb)을 샘플 슬롯에 넣습니다. 녹은 아가로스를 수평면 위의 겔 몰드에 붓되, 매우 얕은 웰(well)이 형성될 정도로만 적당량을 추가합니다.남은 aros를 즉시 온수조로 되돌립니다. 긴 유리 파스퇴르 피펫을 삽입하여 피펫이 aros와 동일한 온도에 도달하게 합니다. 겔이 식으면 콤을 제거한 다음 겔 몰드를 제거합니다.겔을 단단히 고정하기 위해 선호하는 색상의 실험실용 테이프로 양쪽 면을 테이핑하십시오. 나중에 추가적인 agarose를 부을 수 있도록 테이프가 agarose 표면보다 수 밀리미터 더 높게 올라오도록 해야 합니다. 겔 몰드를 실체 현미경의 스테이지 위에 놓으십시오. 빈 웰을 확대하고 가장자리의 초점을 맞추십시오.구부러진 곤충 핀이 장착된 핸들을 사용하여 페트리 접시의 마블을 웰 인접한 겔 표면으로 피펫팅합니다. 마블을 웰 안으로 끌어당겨 바닥까지 밀어 넣습니다. 바벨을 서로 평행하게 맞추고 웰의 긴 가장자리에 밀착시킵니다. 고정하기 전에 미세 피펫이나 실험용 티슈를 사용하여 과잉 액체를 제거합니다.따뜻해진 유리 피펫을 사용하여 조직 주변에 갓 녹인 agros를 천천히 첨가하십시오. agros가 굳기 전에 마지막으로 위치를 조정하고, 웰을 과하게 채우지 않도록 주의하십시오. 근처에 작은 번호표를 추가하여 시료 번호를 기록하십시오.모든 표본의 매립이 완료되면, 젤 상단에 aros를 얇게 부어 윗면을 평평하게 다듬습니다. 사진 촬영 시 젤의 투명도가 유지될 수 있도록 가능한 한 적은 양을 사용하십시오. 젤이 굳으면 실체 현미경 아래에서 촬영하여 각 구슬 쌍의 크기와 모양을 기록하고, 추가 분석을 위한 형태 측정값을 수집할 수 있습니다.짝을 맞춘 구슬 쌍이 포함된 아가 블록을 메스나 면도날을 사용하여 젤에서 잘라낼 수 있습니다. 이렇게 분리한 블록은 표준 방법으로 파라핀 조직학 또는 동결 절편 제작을 위해 처리할 수 있습니다. 또는 물로 헹군 미세 바늘을 사용하여 아가에서 개별 구슬을 해부해낸 후, 전체 마운트 면역조직화학법이나 공초점 현미경 관찰과 같은 다른 하위 응용 단계로 처리할 수 있습니다.마지막으로, 젤 전체를 봉투에 넣어 밀봉한 후 냉장 보관할 수 있습니다. 표본은 수 주 동안 보존됩니다. 지금까지 상악골 바의 발달 및 재생 과정을 관찰하고 분석하는 방법을 살펴보았습니다.제브라피쉬에서 새롭게 구축된 시스템이므로, 앞으로 발견될 내용이 많을 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

신경 및 비 신경 질환의 많은 지브라 피쉬의 모델 성어보다는 배아 / 유생으로 연구되어 있기 때문에, 우리는 성인 zebrafish의 질병 모델에 적용 할 수있는 양적 측면 라인 회생 분석법을 개발 하였다. 분석은 1) neuromast 2) 개별 머리 세포 수준의 해상도를하고있었습니다.

성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Finite Element Analysis는 하중을 받는 구조물의 기계적 성능을 조사하는 데 자주 사용되는 도구입니다. 여기에서 우리는 제브라피시 턱의 생체 역학을 모델링하는 데 그 사용을 적용합니다.

Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

이 원고는 성인 제 브라 피시에서 행동 하는 스트레스를 측정 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 이 접근법은 zebrafish가 스트레스가 많은 상태일 때 탱크의 아래쪽 절반을 선호 하는 타고 난 경향을 활용 합니다. 우리는 또한 약리학으로 분석을 결합 하는 방법을 설명 합니다.

제 브라 피시에서 선천적인 스트레스를 연구 하는 행동 접근법

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

이 프로토콜은 in vivo 재생 중 제브라피쉬의 엘라스모이드 비늘을 채취하고 시각화하는 방법을 설명합니다. 또한, 수확 후 최대 7일 동안 이러한 스케일의 생체 외 배양이 제시됩니다.

토토에서의 제브라피시 비늘 재생 및 비늘의 Ex Vivo 배양

여기에 설명된 프로토콜은 생후 5일 된 제브라피쉬 유충의 두개안면 연골을 염색하고 해부하기 위한 간단하고 따라하기 쉬운 절차를 제시합니다. 다양한 발달 조건에서 이러한 구조의 해부학, 모양 및 크기를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Alcian Blue로 염색한 Zebrafish 두개안면 조직의 해부

이 연구는 무료 소프트웨어(tpsDigs2, MorphoJ, PAST)를 사용하여 제브라피시 유생의 얼굴 구조 변화를 측정하기 위한 두개안면 연골 형태를 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.

형태 측정 분석: 제브라피시에서 두개안면 형태 정량화를 위한 분석 소프트웨어 툴박스

학습하세요 제브라피시 상악 바벌의 재생 과정을 연구하는 외과적 절단 및 조직 분석 방법을. 이 기술은 재생 생물학 및 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

Zebrafish 상악 바벌의 연구 방법

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