동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서

ISTH로 알려진 기법으로 in situ hybridization과 tetra staining을 결합하면 바이러스 항원 특이적 면역 효과기 세포와 바이러스에 감염된 세포 및 조직 간의 상대적인 수와 공간적 관계를 측정할 수 있습니다. ISTH는 새로운 SIV 감염 조직을 아그로에 삽입하는 것으로 시작합니다. 조직은 비브라토를 사용하여 200미크론 두께의 절편으로 절단하고 바이러스 항원을 위해 염색합니다.

fit C 표지 MHC 사합체를 사용하는 특정 CD 8 개의 양성 세포. 동결 후, 이러한 염색 절편을 저온 유지 장치를 사용하여 8마이크로미터 두께의 절편으로 더 절단하고 현장 혼성화를 수행하여 바이러스에 감염된 세포를 국소화합니다. 컨포칼 현미경 검사는 이중 염색 단면을 이미지화하고 궁극적으로 원래의 두꺼운 단면을 재구성하여 면역 효과기와 표적 세포 간의 관계를 밝히는 데 사용됩니다.

초기 SIV 감염을 검사하기 위해 이 절차를 사용하는 것은 후속 질병의 중증도에 대한 좋은 예측 변수임이 입증되었습니다. 안녕하세요, 저는 미네소타 대학교 미생물학과 Ashley HA 실험실 트리의 Chinen Lee입니다. 저는 미네소타 대학의 수의학 생물의학과 조교수인 팸 스키너(Pam Skinner)입니다.

오늘 우리는 연구소 하이브리드화 또는 줄여서 ISTH에서 내부 절차를 보여 드리겠습니다. 오늘 우리가 시연하고 있는 것처럼 inci hybridization과 결합된 inci teer staining을 사용하는 것 외에도, 항원 특이적 CD 8개의 T 세포의 위치, 풍부도 및 단백질 발현 프로파일을 결정하기 위해 면역조직화학과 결합된 inci teer staining을 일상적으로 사용합니다. 오늘 김헌 박사님과 테리 마탈라 박사님께서 두꺼운 절편을 이용한 현장 염색을 도와주시고, 얇은 절편 준비와 현장 혼성화를 도와주실 것입니다.

이 절차를 시작하려면 멸균 PBSH가 포함된 Vibram 욕조를 섭씨 2도로 냉각합니다. 바이브레이터 블레이드 각도를 27도로 설정합니다. 가능하면 신선한 조직을 얼음 위에서 차갑게 보관하고 조직을 채취한 후 24시간 이내에 절차를 시작하십시오.

분해 냉각을 최소화하기 위해 vibram은 또한 신선한 조직을 절단하고 결합 조직을 잘라내고 메스로 표본을 작은 조각으로 자르고 조각을 유청 보트에 넣고 4%의 낮은 용융으로 덮는 것을 용이하게 합니다. PBS의 아그로스는 섭씨 40도 부근에서 녹았다. 티슈가 접시 바닥에 닿았는지 확인하고 티슈 조각이 뜨면 아래로 밀어 넣고 3-5분 동안 얼음 위에서 응고시킵니다.

여기에는 비장 조직이 사용되지만 림프절, 질, 자궁 경부, 자궁 또는 기타 신선한 조직도 메스와 함께 사용할 수 있습니다. 조직 주위의 아그로스를 자르고 집게를 사용하여 아그로스 내장 조직을 조직 블록으로 조심스럽게 옮깁니다. 계속해서 Vibram 조직 블록에 Loctite 접착제를 코팅합니다.

조직 블록에 놓인 조직 조각을 이동하지 마십시오. 얼음에서 약 10분 동안 말리십시오. 다음으로, 바이브레이터에 조직 블록을 장착하고 데드 슬로우 포워드 속도와 상대적으로 높은 진폭을 사용하여 조직을 200마이크로미터 두께의 섹션으로 자릅니다.

페인트 브러시를 사용하여 절단된 부분을 1ml의 냉각된 PBSH로 미리 채워진 24웰 조직 배양 플레이트의 웰에 있는 특수 조직 챔버 세트로 옮깁니다. 각 조직 챔버에 최대 4개의 조직 섹션을 넣습니다. 샘플에 라벨을 붙이고 고무 밴드로 뚜껑을 플레이트에 고정하여 바이러스 특이적 T 세포의 조직 부분을 염색합니다.

ZI 복합 사량체는 먼저 차단 버퍼에서 밀리리터당 nwt 0.5마이크로그램으로 희석됩니다. 용액은 웰당 1ml의 24웰 플레이트에 피펫으로 주입됩니다. 갓 자른 조직은 조직 챔버의 플레이트로 옮겨져 섭씨 4도에서 밤새 흔들릴 수 있습니다.

후속 단계에서 용액의 교차 오염을 방지하기 위해 서로 다른 샘플이 들어 있는 조직 챔버 사이에 빈 웰을 유지하십시오. 이 단계에서 세포 외 또는 세포 표면 단백질에 대한 항체를 추가할 수 있습니다. 세척을 위해 1차 배양 후 냉각된 PBSH가 포함된 24웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다.

티슈 챔버를 미리 채워진 플레이트에 20분 동안 옮겨 두 번 세척한 후, 옮기기 전에 티슈 챔버에서 대부분의 액체를 배출해야 합니다. 또한 조직 챔버를 이동할 때 한 샘플의 내용물을 다른 샘플로 떨어뜨리지 말고 조직 챔버의 섹션을 모니터링하여 측면에 달라붙지 않는지 확인하십시오. 고정 후 PBS에서 신선한 4%paraldehyde로 섹션을 실온에서 2시간 동안 고정합니다.

사량체의 신호를 증폭하기 위해 매번 5분 동안 차가운 PBSH로 두 번 세척합니다. 1-3일 동안 차단 완충액에서 1:10, 000의 비율로 토끼 항 fitzy 항체로 절편을 배양합니다. 이 단계에서 세포 내 항원결정기에 대한 항체를 추가할 수 있습니다.

항체를 추가하기 전에 세포를 침투시키고 비특이적 부위를 차단하는지 확인합니다. 신호를 증폭하기 위한 두 번째 긴 배양 후에도 항원 검색이 필요할 수 있습니다. PBSH에서 섹션을 최소 20분, 최대 몇 시간 동안 세 번 세척합니다.

적절한 형광 표지된 항체로 최종 배양을 수행합니다. 예를 들어, 염소 항 토끼 SI 3을 사용하여 토끼 항 피지 항체와 결합하여 사량체 염색 세포가 붉게 형광을 발하도록 할 수 있습니다. 킬러 T 세포를 시각화하기 위해 CD 8과 같은 관심 단백질을 counterstaining하기 위해 마우스 항체를 사용한 경우, goat anti-US Alexa 488을 사용하여 마우스 항체에 결합하고 항체 염색 세포를 녹색으로 염색하여 각 항체의 희석을 경험적으로 측정해야 합니다.

1-3일 동안 배양하면 이 배양 기간 동안 플레이트와 은박지를 싸서 섹션을 빛으로부터 보호하고 그 후에는 빛이 꺼지면 식물이 떨어집니다. 마지막으로 섹션을 다시 고정하여 사합체와 항체를 제자리에 고정합니다. 세척하고 밀리리터 N 프로파일 갈레이트당 4밀리그램을 함유한 글리세롤 젤라틴으로 현미경 슬라이드에 장착하여 섭씨 영하 20도에서 현장 혼성화를 위한 얇은 절편을 준비할 때까지 보관합니다.

이제 인사이튜 테트라머 염색 단면을 컨포칼 현미경으로 분석하여 항원 특이적 CD 8개의 양성 T 세포의 국소화 풍부도 및 단백질 발현 패턴을 확인할 수 있으며, 이미지에 표시된 SIV에 감염된 오목한 부분의 비장 조직 절편을 개그 테트라머로 염색하여 SIV 특이적 CD 8개의 양성 T 세포, CD 20개의 항체 및 CD 3개의 항체를 라벨링했습니다. 항체로 염색된 계수기는 다음 단계에서 손실되기 때문입니다. 계속 진행하기 전에 현장 사량체를 분석하는 것이 중요합니다.

슬라이드에서 두꺼운 부분을 분리하기 위해 열 블록에서 섭씨 200도에서 200미크론 두께의 부분을 섭씨 70도에서 5분 동안 가열하여 얇은 절단 절차를 시작합니다. 섹션이 분리되면 먼저 플라스틱 금형 바닥에 OCT를 채워 드라이 아이스에 OCT에 삽입합니다. 그런 다음 조직을 OCT 위에 놓고 OCT로 덮습니다.

저온 유지 장치를 사용하여 OCT 내장 섹션에서 8미크론 두께의 절편을 절단하고 8미크론 절편을 사일로화된 슬라이드에 부착합니다. 그런 다음 슬라이드는 후속 현장 교잡을 위해 밀봉된 상자에 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 표준 in situ hybridization은 S 35 표지된 바이러스 특이적 늑골 프로브를 통해 바이러스에 감염된 세포를 검출하는 데 사용됩니다.

이 절차에는 핵 트랙 에멀젼이 있는 코팅 섹션과 장착 슬라이드도 포함됩니다. 형광등과 호환되는 파라마운트 매체에서 공초점 이미지는 에피 튜브 청색 반사 장치가 장착된 BioRad MRC 1000 컨포칼 현미경을 사용하여 획득됩니다. 인사이트 테트라 염색은 적색 테트라 형광 색소에 대해 EPI one 605를 사용하고 인사이트 혼성화를 위해 녹색 CD 8 형광 색소에 대해 EPI 2 522 DF 32를 사용하여 시각화됩니다.

개발된 라디오 사인에서 현장 혼성화 신호로 인한 은 입자에 대해 EPI 2개의 청색 반사를 사용합니다. 이미지 획득을 시작하려면 각 섹션의 이미지를 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 획득하고 인접 이미지와 약 20% 겹치도록 각 이미지를 캡처해야 합니다. 재구성된 몽타주 이미지의 공백을 방지하려면 Excel 파일의 bro 및 column에 따라 각 이미지의 이름을 지정합니다.

슬라이드에서 데이터 수집이 완료되면 공초점 보조 소프트웨어를 사용하여 작성자가 제공하는 Photoshop 7 작업 절차를 사용하여 각 채널의 Z 직렬 이미지를 단일 이미지로 투사하고 3개 채널에서 투사된 이미지를 하나의 RGB 이미지로 자동 병합합니다. 그런 다음 병합된 이미지를 레이어로 함께 연결하여 전체 섹션의 몽타주 이미지를 생성합니다. 개별 은 입자 및 사량체 염색을 metamorph 또는 Photoshop을 사용하여 몽타주의 세포와 연결합니다.

바이러스 RNA 양성 및 사합체 양성 세포의 중심 또는 OID의 XY 좌표를 할당합니다. OID 데이터를 각 셀의 숫자 숫자로 Excel 파일로 내보내고 Excel 파일에 수집된 데이터를 사용하여 섹션에 있는 사량체 양성 및 바이러스 RNA 양성 세포의 총 수에서 바이러스 표적 또는 T 세포에 대한 면역 효과기 또는 e 세포의 비율을 결정하여 사합체 양성 세포와 RNA 양성 세포 간의 공간적 관계를 캡처합니다. Excel 파일의 해당 플롯을 복사하여 Photoshop의 Photoshop 문서에 붙여넣습니다.

레이어의 불투명도를 줄여 색상과 일치하도록 그리드를 정렬하고 크기를 조정하고 선택한 다음 복사하여 새 레이어에 붙여넣습니다. 파란색 RNA 양성 세포의 위치는 그리드를 정렬하는 데 사용되는 층을 버리고 사량체 양성 및 바이러스 RNA 양성 세포의 위치가 평평한 이미지에서 드러납니다. 여기에 표시된 ISTH 방법을 사용하여 이 진입 포털과 감염이 퍼지는 림프 조직에서 질 내 접종 후 SIV 감염에 대한 면역 반응을 추적할 수 있습니다.

감염 후 10일이 지나면 이러한 조직 부위에 많은 수의 감염된 세포가 있지만 늦게는 3일 후에도 녹색 염색 CD A 양성 세포가 있지만 아직은 아닙니다. 빨간색으로 염색된 SIV 특이적 테트라 양성 세포. 따라서 면역 반응은 감염을 제거하기에는 너무 늦습니다.

그러나 감염 후 3주가 지나면 감염된 세포의 감소가 뚜렷하게 나타나며, 특히 입구에서 더욱 그러합니다. 우리는 ISTH를 사용하여 감소 정도가 공간적 근접성 및 테트라머 양성 면역 효과기 세포의 상대적 수와 상관관계가 있음을 보여주었습니다. N-S-I-V-R-N-A 양성 표적 세포를 in vivo E 대 T 비율이라고 합니다.

이 감염된 림프절에서 적색의 effector 세포와 파란색의 바이러스 표적과 함께 이 방법을 사용하여 공간 관계를 쉽게 시각화할 수 있습니다. 많은 effector 세포와 target cell이 매우 근접해 있으며, 많은 effector cell이 단일 S-I-V-R-N-A positive cell을 둘러싸고 있는 영역이 있는 반면, 다른 영역에는 S-I-V-R-N-A positive cell이 단독으로 존재합니다. ETT의 비율은 셀의 위치가 결정되고 엑셀 파일에서 각각의 숫자로 기록됨에 따라 간단히 계산됩니다.

바이러스 감염에 대한 최선의 통제는 녹색 표적에 비해 적색 효과기가 43 대 1로 크게 초과되는 것과 관련이 있습니다. 이 경우, 감염이 시작된 자궁경부와 질에서 림프절의 ETT 비율이 더 낮았다. 높은 ETT 비율과 피크 대비 바이러스 부하 감소 사이의 긍정적인 상관관계는 진입 관문에서 보다 강력한 면역 반응이 감염을 더 잘 통제한다는 것을 나타냅니다.

지금까지 매우 특이적인 CDAT 세포와 바이러스 감염 세포를 현장에서 동시에 검출하는 방법을 보여드렸습니다. 이 기술을 사용하면 조직에서 항원 특이적 T 세포와 바이러스에 감염된 세포를 동시에 시각화할 수 있습니다. 이 기술은 이 절차를 수행할 때 CD 8 양성 T 세포 기반 백신과 기타 비가치 병원체 및 숙주 상호 작용을 평가하는 데 적용할 수 있습니다.

인사이트를 하이브리드화하기 전에 모든 시약 RNA를 무료로 유지하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.