Name: 소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 학습하세요 토양 및 퇴적물에서 고분자량 게놈 DNA 추출 방법을 통해 미생물 다양성과 대사 잠재력을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 다양한 토양 유형에 적용 가능합니다.

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우리는 산림 토양의 생산성의 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금, 게놈 브리티시 컬럼비아과 숲의 브리티시 컬럼비아 교육부와 범위에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. SL은 미생물 다양성과 발전을위한 기초 자금 툴라 센터에서 화목에 의해 지원되었다.

부품 I : DNA의 추출 절차 1. 8시간는 DNA의 양을 정함을 제외한 6 샘플 처리를 위해, 필요합니다. 당신이 추출을 시작하기 전에, 당신은 사전 진정 박격포, 유봉 및 -20 ° C의 냉동고에 주걱이나 액체 질소를 사용해야합니다. 또한, 얼음 20 ML 클로로포름 isoamyl 알콜 (24:1)를 포함하는 사전 진정 50 ML 튜브. 65 하이브 리다이 제이션 오븐을 설정 ° C 미리 열 수 있습니다. 그것 ° C 크리스탈을 녹일 60 따뜻한 크리스털 경우, CTAB 솔루션을 확인하십시오. 당신이 추출 (아래 제조법 참조)을 시작하기 직전 마지막으로 재료를 추가하여 denaturing 솔루션 및 추출 버퍼를 완료하십시오. 펌 후드의 모든 추출 절차를 실시합니다. 2. denaturing 버퍼와 추출 버퍼를 준비합니다. 참고 : DNA의 수율을 최대화하기 위해서는 정확하게 지침에 따라 버퍼를 만들기 위해 중요합니다. 3. 미리 차게 절구에 흙 2g를 놓습니다. 참고 : 현장에서 수집된 토양은 전송을 위해 드라이 아이스를 동결하고 -80 ° C.에 보관해야 해동 사전 DNA 추출에 2mm의 체 체를 사용하여 토양. 당신이 10 G.까지 토양의 시작 양을 증가시킬 수 4. 흙에 솔루션을 denaturing 1 ML을 추가합니다. 5. 고정과 토양 입자 가루와 동질적인 모양까지 유봉을 사용하여 두 액체 N에있는 흙을 분쇄. 동결 두 번 연삭를 반복합니다. 참고 : 동안 냉동 토양 샘플을 보관, 연삭 완전히 토양 샘플을 커버하기에 충분한 액체 질소를 사용합니다. 연삭 중에 약간 녹아이 허용됩니다. 6. 미리 차게 주걱을 사용하여 50 ML 원뿔 관에 지상 토양을 전송합니다. 참고 : 지상 토양 샘플은 -80 ° C이 시점에서, 필요한 경우에 저장될 수 있습니다. 7. 추출 버퍼 9 ML을 추가합니다. 솔루션 및 토양, 낮은 속도로 소용돌이를 간략하게 혼합합니다. 참고 : 버퍼가 균질되도록하려면 60을 따뜻한 ° C를 사용하기 전에 10~15분하십시오. 추출을 통해 60 ° C에서 버퍼의 나머지 부분을 유지. 속도 8 소용돌이 (10이 최대입니다 규모). 8. 하이브 리다이 제이션 오븐에 65 ° C 40 분 품어. 부화 기간 동안 지속적으로 가장 낮은 속도로 튜브를 회전하거나, 부드럽게 튜브를 매일 10 분 반전. 참고 : 버퍼가 큰 표면적을 통해 흙을 문의할 수 있도록 하이브 리다이 제이션 오븐에 수평으로 튜브를 삽입합니다. 이 솔루션은 부화하는 동안 약간의 점성을 보일 수 있습니다. 9. 14 ° C. - 10 10 분 1,800 X g에서 원심 분리기 20 ML 클로로포름 - isoamyl 알콜 (24:1)이있는 미리 차게 50 ML 원뿔 관에 뜨는 전송, 얼음 계속. 참고 : 뜨는 전송할 때, 유기 층 (바닥 층)을 방해하지 않도록주의합니다. 그것은 깨끗한 표면에 뜨는를 수집하기 위해 필요한 경우 뜨는 1-2 ML 둡니다. 당신은 자주 뜨는 위에 베이지색 레이어를 (두께 약 1-3밀리미터)을 볼 수 있습니다. 뜨는를 수집 때이 레이어를 방해하지 마십시오. 이 베이지색 레이어의 파손을 방지하기 위해 튜브 벽을 따라 팁을 슬라이드보십시오. 뜨는 너무 흐린 경우 뜨는에서 클로로포름 - isoamyl 알콜 추출 한 더 많은 시간을 반복하십시오. 클로로포름를 전송할 때 클로로포름가 플라스틱을 녹일하므로, 일회용 플라스틱 pipettes를 사용하지 마십시오. 유리 피펫을 사용하여, 또는 유리 실린더 졸업 또는 50 ML 원뿔 튜브에 직접 클로로포름을 따라줘. 10. 토양 알약에게 두 번 이상의 압축을 풉니다; 10.1. 토양 알약 5 ML 추출 버퍼를 추가 부드럽게 낮은 속도로 짧은 vortexing 다음 1 ML 팁을 사용하여 섞는다. 참고 : 흔들 어서 사용하기 전에 버퍼를 섞는다. 10.2. 65 ° C 하이브 리다이 제이션 오븐에서 10 분 알을 품다. 14 ° C. - 10 10 분 1,800 X g에서 원심 분리기 9 단계에서 튜브에 뜨는 전송합니다. 튜브 수집 뜨는 및 클로로포름 - isoamyl 알콜로 추출하는 동안 얼음 계속. 참고 : 교차는 샘플 사이에 혼합하지 않고 같은 튜브에 뜨는를 추가하십시오. 10.3. 9.1 및 9.2 한 번 더 반복합니다. 11. 회전 접시를 사용하여 매우 부드럽게 수집 뜨는 (14-19 ML) 10 분 1.25 RPM에서 클로로포름 - isoamyl 알콜이 들어있는 튜브를 바위. 참고 : 누출을 방지하기 위해 매우 단단히 뚜껑을 닫습니다. 어떤 누출이 쉽게 감지 수 있도록 당신이 튜브를 삽입하기 전에 흔들어 대 접시에 종이 타월을 놓는다. 12. 14 ° C. - 10 20 분 1,800 X g에서 원심 분리기 13. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 참고 사항 : 수성 단계 (위 계층)과 유기 계층 (하단 사이의 계면을 방해하지 마십시오층)은 표면에 뜨는를 전송할 때. 오직 깨끗한 뜨는 수집을 보장하기 위해 약 1.5-2 ML이 뜨는 둡니다. 14. 이소 프로필 알코올 (- 21.a 15.a 단계)를 사용하여 DNA를 복구합니다. 또는 Amicon를 사용하여 ® 울트라 - 15 원심 필터 장치 (단계 15.b - 21.b)는 복구하기가 어렵습니다 이소 프로필 알코올 석출에 의해 거의 볼 수 펠렛을 생산합니다 샘플에서 바이오 매스의 매우 낮은 금액을 기대하는 경우. 15.a. 새로운 관 초원 심 분리기에 뜨는를 놓습니다. 16.a. 0.6:1의 음량 비율에서 수집한 뜨는에 이소 프로필 알코올을 추가합니다. 튜브 반전 부드럽게 몇 번 혼합합니다. 실온에서 30 분 17.a의 알을 품다. 18.a. 25 ° C. - 20 20 분 16,000 X g에서 원심 분리기 모든 튜브의 가중치는 원심 분리 단계 전에 잘 균형을 수 있도록. 참고 : 튜브에 원심력의 방향을 표시하므로 DNA 수율이 낮은 때보다 쉽게​​ DNA 펠렛를 검색할 수 있습니다. 19.a. decanting 또는 진공 suctioning에 의해 이소 프로필 알코올을 제거합니다. DNA 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. 참고 사항 : 즉시 원심 분리가 완료되면 이소 프로필 알코올을 제거합니다. DNA 펠렛을 잃지 않도록 매우주의하십시오. DNA 펠렛의 크기는 거의 공개 (~ 9mm 지름) 명확하게 표시에서, 토양 유형에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 그것은 DNA 펠릿 밖으로 흡입에주의 때문에 튜브의 벽을 따라하는 것도 suctioning에 의해 이소 프로필 알코올의 찌꺼기를 제거하는 것이 좋습니다. 20.a. 5 상온에서 건조 DNA 펠릿 - 20 분. 참고 : 건조 DNA 펠렛 이상하지 마십시오, 그렇지 않으면 그것은 DNA를 redissolve하기 어려울 것입니다. 21.a. 200 μl TE에서 DNA 펠렛을 Resuspend. 부드러운 감청하여 섞는다. 1.5 ML 튜브에 DNA 솔루션을 전송합니다. 4 튜브를 유지 ° C 완벽한 DNA를 해산하기 위해 하룻밤. 참고 : 펠렛의 크기에 따라 추가 TE의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 보통 200 - TE 400 μl 잘 작동합니다. * 또는 단계를 수행하십시오 15.b - 21.b. 15.b. Amicon ® 울트라 - 15 원심 필터 장치를 미리 씻고, 10 분 동안 3,500 X g에서 장치와 원심 분리기 15 ML TE를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. 16.b. 단계 13에서 미리 씻어 Amicon 필터로 DNA 솔루션을 놓습니다. DNA의 볼륨이 200 감소까지 3,500 X g에서 원심 분리기 - 500 μl합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. 17.b. 두 TE와 DNA를 세척하고, Amicon 필터 장치 10 ML TE를 추가합니다. DNA의 볼륨이 약 200 μl로 감소까지 3,500 X g에서 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. 한 번만 더 반복합니다. 18.b. 새로운 1.5 ML 튜브에 필터의 DNA 솔루션을 전송합니다. 19.b. Amicon 필터 40 μl TE를 추가합니다. 필터에있는 DNA 성분을 회수하기 위해 최대 pipetting 아래로 필터 세포막의 두 측면을 씻으십시오. 단계 18.b.에서 관이 세척 솔루션 추가 20.b. 필요한 경우, DNA가 Microcon ® Ultracel YM - 30 원심 필터 단위로 더욱 집중 할 수 있으며, 7분에 대한 10,000 X g에서 200 μl TE 및 centrifuging을 추가하여 필터를 미리 씻는다. 1 분 5000 X g에서 필터와 원심 분리기에 DNA 솔루션을 추가합니다. 필터에 DNA 솔루션의 금액은 약 50 μl로 감소 때까지 원심 분리를 반복합니다. 참고 : Microcon 필터에 대한 최대 초기 샘플 볼륨 500 μl입니다. 14,000 X G. 이상의 속도로 원심 분리기하지 마십시오 완전히 막 증발까지 원심 분리기를 통해하지 마십시오. 어떤 액체가 계속 원심 분리 후 필터를 다루고 있는지 확인하십시오. 당신은 이상 centrifuged 및 멤브레인가 건조되면 15 μl TE를 추가 30 초 동안 부드럽게 선동하고, 21.b. 단계로 진행 21.b. DNA를 복구 3 분 XG 1000에서 새 Microcon 튜브와 원심 분리기에 거꾸로 필터 장치를 놓습니다. 22. 태 젤로 DNA (0.8 %, 0.5xTAE 4 시간 50 V)를 계량하고, Nanodrop 분광 광도계 또는 피코 - 녹색 분석 및 플레이트 판독기에 의해. 참고 : DNA 금액이 젤에 알려진 농도 (고분자 DNA 마커 또는 λHindIII)와 마커 밴드에 대한 샘플 밴드를 비교하여 추정 수 있습니다. 23. (자세한 내용은 단계 II를 참조하십시오에서 파트 1 %, 1xTAE 젤과 함께 펄스 필드 겔 전기 영동 (PFGE)를 사용하여 높은 분자량의 DNA의 무결성 확인 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id을 = 1387</a> , 도이 : Taupp 외 의해 10.3791/1387 2009).. 참고 : 대신 낮은 용해 아가로 오스의 QC 목적을 위해 정기적으로 아가로 오스 젤을 사용할 수 있습니다. 다음과 같이 간단히, 전기 영동 조건은 다음과 같습니다 2-250킬로바이트, 6 볼트, 초기 전환 시간 : 5 초, 최종 전환 시간 : 15 초, 14에서 12 시간 동안 실행 ° C. SYBR 골드가 젤에서 DNA를 시각화 한 시간 염색법. 24. 추출된 DNA의 분자 가중치를 만족하는 경우, 다음 CsCl 기울기 원심 분리기 단계로 진행합니다. 또는 DNA는 -20 ° C 또는 -80에 저장할 수 있습니다 ° C CsCl 원심 전에. 당신은 큰 삽입 metagenomic의 DNA 라이브러리를 구축하려는 경우 DNA의 평균 크기는 동일 또는 36 KB을 초과해야합니다. 부 II. 세슘 염화물 기울기 ultracentrifugation을 사용하여 DNA의 정화 원심 분리기의 준비 : 1.5 - 이시간 원심 분리 단계 : 18시간 ethidium 브로마이드 (EtBr)를 제거하고 원심 분리 후 DNA 집중 : 3 시간 절차 자세한 내용은 라이트 외를 참조하십시오. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , 도이 : 10.3791/1352 대표 결과 / 결과 이 숲 토양 유기의 g (O 수평선)과 미네랄 호라이즌 (AE, AB, 그리고 BT 호라이즌) (장기 토양 생산성 (LTSP) Skulow 호수, BC, 캐나다에있는 사이트에서 샘플에서 격리 게놈 DNA의 총액 과) 숲 범위 BC 교육부에서 관리하는 10 밀리그램에서 180 밀리그램였다. 60킬로바이트 (그림 1) - 절연 DNA의 평균 크기는 40 사이에 일반적으로되었다. 260 nm/280 NM에서 흡광도의 비율은 1.3-1.6 사이 종종 토양 샘플에서 관찰 humic 산성 오염을 나타낼 수 있습니다 230 NM에서 최고가있었습니다. CsCl 기울기 원심 분리가 대폭이 오염을 감소하며 1.8 280분의 260의 비율을 증가 - 1.9을 그림 2A와 2B와 같이. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="그림 1" /> CsCl ultracentrifugation 전에 추출한 게놈의 DNA의 그림 1. PFGE 사진. lane1 : 1킬로바이트 마커 100 NG, 레인 2 : λHind III 마커 100 NG, 레인 3 : λHind III 마커 250 NG, 레인 4 : λHind III 마커 500 NG, lane5 : Fosmid 36킬로바이트 마커 100 NG, 레인 6과 7 : 게놈 미네랄 토양 수평선 애, 레인 8 9 절연 DNA : Skulow 호수, BC에 위치한 LTSP 사이트의 광물 토양 호라이즌 AB으로부터 격리 게놈 DNA <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" /> 게놈 DNA의 그림 2. Chromograms 전에 분광 광도계에 의해 감지 (A) 및 CsCl ultracentrifugation의 (B) 후. 게놈 DNA의 품질 향상을 나타냅니다 CsCl의 ultracentrifugation, 후 230 nm의 파장에서 흡광도 값의 감소에 유의하십시오. 하시기 바랍니다 <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22AEM%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+insert+environmental+genomic+library+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

조리법 * 솔루션을 Denaturing 4 M 구아니딘의 isothiocyanate 10 MM 트리스 - HCL (산도 7.0) 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5 % 2 - 메르 캅 토 에탄올 <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Denaturing 솔루션 : 총 10 ML </td></tr><tr><td> 구아니딘의 isothiocyanate (MW 118.16) </td><td> 4.73 g </td></tr><tr><td> 1M 트리스 - HCL (산도 7.0) </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> 총 9.95 ML 물을 추가합니다. </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥. </td></tr><tr><td colspan="2"> 바로 사용하기 전에 50 μl 2 - 메르 캅 토 에탄올을 추가합니다. (1 ML Denaturing 솔루션 당 2 - 메르 캅 토 에탄올 5 μl) 참고 : 4 Denaturing 솔루션을 유지 ° C. 일주 이상의 버퍼가 이상 사용하지 마십시오. 가능하면 신선한 버퍼 사용합니다. </td></tr></table> ** 추출 버퍼 100 MM 나트륨 인산염 버퍼 [산도 7.0] 100 MM 트리스 - HCL [산도 7.0] 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) [산도 8.0] 1.5 M NaCl 1 % Hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB) 2퍼센트 SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> 총 1 L에 대한 추출 버퍼 </td></tr><tr><td> 1M 나트륨 인산염 버퍼 [산도 7.0] * </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> 1M 트리스 - HCL [산도 7.0] </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) [산도 8.0] </td><td> 200 ML </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥과 실온에서 보관. </td></tr><tr><td colspan="2"> 200ml, 5 % Hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB, autoclaved) 100 ML, 20 % SDS (autoclaved) 바로 사용하기 전에를 추가합니다. CTAB가 크리스털 경우, 60을 용융 ° C. * 1M 인산 나트륨 완충액 : 57.7 ML, 1M 인산 나트륨 일염기의 (아니 2 PO 4) 42.3 ML, 1M 인산 나트륨 이염 (아니 2 PO 4). 7.0 산도를 조정 참고 :이 석출이있다면 20% SDS를 사용하지 마십시오. 당신이 솔루션에 SDS를 추가할 때 밀키 정학을 볼 정상입니다. 일단, SDS를 추가 60 추출 버퍼를 배치 ° C는 SDS가 잘 일시 중지되도록합니다. </td></tr></table>

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 dna의 추출

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

토양 microbiome이 속속들이 지상파 생태계 내에서 영양과 에너지 흐름과 관련된 게놈 다양성과 신진 대사 혁신의 광대한 상대적으로 미개척 저수지입니다. 또한 metagenomic로 알려진 육성 독립 환경 게놈, 접근 방식은 높은 가치 치료 및 바이오 매스 변환 프로세스에 대한 경로 재건 및 기능 검사와 관련이 유전 정보에 대한 전례없는 접근을 약속드립니다. 그러나, 토양 microbiome은 여전히​​ 큰 삽입 라이브러리 생산을위한 충분한 품질의 높은 분자량의 DNA를 얻는의 어려움으로 인해 크게 도전 남아있다. 여기 우리는 토양과 퇴적물에서 높은 분자량, 미생물 지역 사회 게놈 DNA를 추출하기위한 프로토콜을 소개합니다. 절연 게놈의 DNA의 품질은 하류 시퀀싱 및 심사 애플 리케이션을위한 대형 삽입 환경 게놈 라이브러리를 구축에 이상적입니다. 절차는 세포 용해와 함께 시작합니다. 세포 벽 및 미생물의 세포막은 두 기계 (연삭)와 화학 세력 (β - 메르 캅 토 에탄올)에 의해 lysed 있습니다. 게놈 DNA는 다음 추출 버퍼, 클로로포름 - isoamyl 알콜과 이소 프로필 알코올을 사용하여 격리됩니다. 용해와 추출 단계에 대한 고용 버퍼는 구아니딘의 isothiocyanate 및 높은 분자량의 게놈의 DNA의 무결성을 유지 hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB)를 포함합니다. 귀하의 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 분리된 게놈의 DNA가 더 세슘 염화물 (CsCl) humic 지방산을 포함하여 불순물을 감소 기울기 ultracentrifugation을 사용하여 정화 수 있습니다. 첫 번째 절차, 추출, DNA의 양을 정함 단계 제외한 약 8 시간 정도 소요됩니다. CsCl ultracentrifugation 기울기는 이틀 과정입니다. 전체 절차를 수행하는 동안, 게놈 DNA는 전단을 방지하기 위해 부드럽게 다루어야하는, 심각한 vortexing을 방지하고, 거칠 반복적인 pipetting.

토양 미생물 커뮤니티의 높은 분자량과 높은 품질의 게놈 DNA를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

토양 마이크로바이옴은 유전적 다양성과 대사 혁신의 방대하고 상대적으로 미개척된 저장소이며, ...와 밀접하게 연관되어 있습니다.

안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물학 및 면역학과의 Stephen Harlem 교수님 연구실 소속 San Lee입니다. 오늘은 산림 토양뿐만 아니라 다양한 종류의 토양 및 퇴적물에 적용 가능한 고분자량 게놈 DNA 추출 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 토양 미생물 군집의 forest meter 라이브러리를 구축하기 위해 고분자량 게놈 DNA를 사용합니다.이렇게 준비된 라이브러리를 통해 서로 다른 토양 층위에 따라 구분된 미생물 군집의 다양성과 대사 잠재력을 연구할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 본 프로토콜은 세포 용해 단계부터 시작합니다.첫 번째 단계는 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)을 첨가하여 변성 완충액의 최종 농도를 0.5%로 맞추는 것입니다. 최상의 결과를 얻으려면 변성 용액을 매번 새로 조제하십시오. 또는 4°C에서 보관한 지 일주일이 되지 않은 완충액을 사용하십시오. 다음 단계를 위해 액체 질소 용기, 오토클레이브, 그리고 미리 냉각시킨 막자사발과 스패튤라가 필요합니다.미리 냉각시킨 막자사발에 2 g의 냉동 토양 시료를 넣습니다. 변성 용액 1 mL를 첨가합니다. 그다음 토양이 완전히 잠길 때까지 액체 질소를 넣습니다.미리 냉각시킨 막자로 토양 입자가 가루 형태의 균일한 모습이 되고 샘플이 녹기 시작할 때까지 갈아줍니다. 그런 다음 액체 질소를 더 추가하고 분쇄 단계를 반복합니다. 이렇게 하면 미리 냉각시킨 스패튤라를 이용한 세포 용해 단계가 완료됩니다.분쇄된 시료를 50 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 즉시 DNA 추출 단계로 진행하려면 시료를 얼음 위에 보관하고, 그렇지 않으면 minus 80 degrees Celsius에서 보관하십시오. 나중에 사용하기 위해 DNA 추출을 시작하기 직전에 hexa deco trimethyl ammonium bromide(CTAB)와 SDS를 추가하여 추출 버퍼를 완성하십시오.CTAB이 결정화되었는지 확인하고, 결정화되었다면 진행하기 전 60 °C에서 용해하십시오. 그다음, 최종 농도가 1%가 되도록 용액에 첨가하십시오. 다음으로, 최종 농도가 2%가 되도록 20% SDS 용액을 첨가하십시오. 이때 우윳빛 현탁액이 형성되는 것은 정상입니다.SDS를 첨가한 후, 10분에서 15분 뒤에 60 °C에서 보관하여 완성된 추출 버퍼의 균질성을 유지하십시오. 추출 버퍼가 잘 용해되어 균질해지면, 토양 샘플에 추출 버퍼 9 mL를 넣고 저속으로 짧게 볼텍싱하여 혼합합니다. 추출 버퍼가 포함된 샘플을 65 °C 하이브리다이제이션 오븐에서 40분 동안 배양하십시오.배양하는 동안 10분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞거나, 로터의 최저 속도로 튜브를 지속적으로 회전시키십시오. 배양하는 동안 또는 배양 후에 용액의 점도가 약간 높아질 수 있습니다. 다음 단계에서는 클로로포름-이소아밀 알코올을 사용하여 용해 혼합물 내의 유기 물질로부터 DNA를 정제합니다.먼저 흄후드 내에서 샘플을 약 10~14 °C로 1800 Gs에서 10분 동안 원심분리한 후, 피펫 팁을 튜브 벽면을 따라 조심스럽게 내려 상단의 베이지색 층과 하단의 유기층을 피해 DNA가 포함된 상층액을 수집합니다. 이 상층액을 20 mL의 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform-isoamyl alcohol)이 들어 있는 미리 냉각된 50 mL 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 동일한 샘플에 대해 추출 과정을 두 번 더 반복합니다. 그동안 DNA 추출물과 클로로포름-이소아밀알코올은 흄후드 내의 얼음 위에 보관합니다.두 번째 DNA 추출을 위해, 잔류 추출 버퍼와 함께 토양 펠릿이 들어 있는 튜브로 돌아가 추출 버퍼 5 mL를 추가로 넣습니다. 1 mL 팁으로 부드럽게 저어 혼합한 후, 이전과 같이 짧게 볼텍싱하여 펠릿을 재현탁합니다. 이번에는 65 °C에서 10분 동안 배양합니다.그런 다음 1800 Gs에서 10분 동안 원심분리합니다. 후드 내 약 10~14 °C 환경에서, 상층액을 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform, isoamyl alcohol 또는 chloroform i a a)과 이전 추출 단계의 상층액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 토양 샘플에서 가능한 한 많은 DNA를 추출하기 위해 전체 추출 과정을 한 번 더 반복합니다.토양 샘플에 대해 총 3회의 추출을 완료한 후, 수집된 상층액과 클로로포름이 들어 있는 튜브를 회전판 위에서 1.25 rpm으로 10분 동안 매우 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 이 혼합 단계 후, 튜브를 약 10~14 °C에서 1800 Gs로 20분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면, 수성 상과 유기 상 사이의 계면이 흐트러지는 것을 방지하기 위해 상층액 1~2 mL를 남겨두고 수성 상을 새로운 초원심 분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 이제 DNA를 침전시키기 위해 0.6 mL의 isopropyl alcohol을 첨가합니다.수집한 상층액 1 mL당 튜브를 몇 번 가볍게 뒤집어 혼합합니다. 이 단계에서 DNA가 긴 실 형태로 침전되는 것을 관찰할 수 있습니다. 그 후 DNA를 이소프로판올과 함께 실온에서 30분 동안 배양합니다.배양 후, 원심분리를 통해 DNA를 펠릿화합니다. 원심분리기에 튜브를 넣을 때 한쪽 모서리에 표시를 하여 DNA 펠릿이 형성될 위치를 확인할 수 있도록 합니다. 20~25 °C에서 16,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 디캔팅 또는 진공 흡입 방식으로 이소프로판올을 제거합니다. 추출 효율과 토양 샘플의 바이오매스에 따라 크기가 거의 보이지 않는 수준에서 최대 9 mm 너비까지 다양하므로 DNA 펠릿을 소실하지 않도록 주의하십시오. DNA 펠릿을 상온에서 5~20분 동안 건조합니다. 펠릿이 건조될 때까지 기다리되, 과하게 건조되지 않도록 주의하십시오.DNA를 200에서 400 µL의 TE에 재현탁합니다. 가볍게 쳐서 혼합합니다. DNA 용액을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.DNA를 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 토양 샘플에서 DNA를 추출한 후 DNA를 완전히 용해시키기 위해, 샘플의 농도 및 DNA 무결성을 확인하는 나머지 단계는 표준 절차를 따르며, 이는 Hallam 연구실의 다른 JoVE 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 원하는 방법을 사용하여 DNA 농도를 측정하십시오.또한, pulsed field gel electrophoresis 또는 PFGE를 사용하여 DNA 샘플 10에서 20 µL를 전기영동함으로써 고분자량 DNA의 무결성을 확인하십시오. DNA의 중앙값 크기는 이후 응용 단계에 따라 36 kb 이상이어야 합니다. 다음의 cesium chloride 밀도 구배 원심분리 단계로 진행하십시오. 또는, 초원심분리 전에 DNA를 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.다음 단계는 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리를 사용하여 불순물을 제거함으로써 DNA를 추가로 정제하는 것이며, 이후 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리 농축 과정을 거쳐 AmCon 및 MicroCon 원심 여과 장치를 이용해 DNA를 추가 정제합니다. 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리는 고순도 DNA를 얻는 데 핵심적인 과정이며, 이에 대한 자세한 내용은 Hallam 연구실의 다른 JoVE 프로토콜에 기술되어 있습니다. 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리와 농축 단계를 수행한 후, 원하는 방법을 사용하여 DNA 농도를 확인하십시오.다음으로, DNA의 소량을 PFGE로 분석하여 고분자량 DNA의 무결성을 다시 한번 확인합니다. 세슘 클로라이드 초원심분리 전후의 겔 결과에서 알 수 있듯이, 2g의 강제 토양에서 분리된 전체 게놈 DNA 양은 10에서 180 µg 범위입니다. 분리된 DNA의 크기 범위는 보통 40에서 60 kb 사이이며, 여기에는 세슘 클로라이드 초원심분리 전후 게놈 DNA 샘플의 크로마토그램이 나타나 있습니다.이 단계는 DNA의 순도를 높여 260/280 비율을 이전의 1.3에서 1.6으로, 이후에는 1.8에서 1.9까지 증가시킵니다. 또한, 휴믹산 오염을 의미하는 230 nanometers에서의 최대 흡광도가 원심분리 후 성공적으로 감소했습니다. 지금까지 토양 미생물 군집에서 고분자 게놈 DNA를 분리하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때, 지침에 따라 추출 및 변성 완충액을 정확하게 제조하는 것이 중요합니다. 또한 isopropyl alcohol 침전 후 DNA 펠릿에 손이 닿지 않도록 주의하십시오. 염화물 밀도 구배 원심분리 후 DNA 밴드를 회수하십시오.DNA 회수율을 극대화하기 위해 시린지를 TE로 헹구는 것을 잊지 마십시오. 마지막으로, 제안된 모든 단계에서 분리된 DNA의 양과 품질을 확인하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 정화를 위해 세슘 염화물 밀도 기울기 원심 분리 다음 0.22 μm의 Sterivex 필터에 집중 planktonic의 바이오 매스에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출을위한 방법을 설명합니다.

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

이 동영상은 포르말린 고정 파라핀 - - 임베디드 물질로부터 DNA 추출을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이것은 조직 섹션 크실렌과 deparaffinized하는 멀티 일 절차, 에탄올과 rehydrated 이후 유전자의 특정 또는 게놈 차원의 분석을 위해 DNA를 정화하고 분리 proteinase K로 처리됩니다.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

우리는 hypersaline 미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA를 추출하기위한 개선된 프로토콜을 제공합니다. 미생물 세포는 DNA 추출 및 정화하기 전에 매트 매트릭스에서 분리됩니다. 이것은 농도, 품질 및 DNA의 크기를 향상시킵니다. 프로토콜은 다른 내화물 샘플에 사용할 수 있습니다.

미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출

타액에서 DNA를 추출하면 분해/단편화가 거의 또는 전혀 없이 쉽게 구할 수 있는 고분자량 DNA를 제공할 수 있습니다.  이 프로토콜은 타액 채취/저장 및 DNA 추출을 위한 최적화된 매개변수를 제공하여 고품질 요구 사항을 가진 다운스트림 DNA 분석을 위한 충분한 품질과 양을 제공합니다.

차세대 시퀀싱에 대한 수집 및 타액 DNA의 추출

빙권은 과거 환경 조건에서 유지 보존 생물에 대한 액세스를 제공합니다. 프로토콜은 수집하고 토양과 얼음의 영구 동토층 코어 오염을 제거하기 위해 제공됩니다. 외인성 DNA와 콜로니의 부재가 검출 된 미생물 또는 드릴링 처리에서 재료보다는 오염을 나타낸다는 것을 시사한다.

고대 생물 커뮤니티 숨겨 내부를 조사하기 위해 냉동 코어의 바깥 부분에서 외인성 물질의 제거

여기에 설명된 방법은 장기 판독 게놈 염기서열 분석에 사용하기 위해 절대 생물영양 진균 병원균인 흰가루병에서 게놈 DNA를 추출, 정제 및 품질 관리하는 방법입니다.

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

여기에서는 저분자량 세포외 DNA의 비율을 향상시켜 환경적 항생제 내성(AMR)을 평가하는 간단한 기술을 제시합니다. 20%-30% PEG 및 1.2M NaCl로 사전 처리하면 게놈 및 수평 전달 AMR 유전자를 모두 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 최적화를 통해 키트가 없는 프로세스에 적합합니다.

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화 

이 프로토콜은 단단하고 마이콜산이 풍부한 세포벽이 제기하는 도전을 극복하여 마이코박테리아로부터 고품질 DNA를 추출하는 CTAB 방법을 설명합니다. 이 과정은 효소 소화, CTAB를 이용한 세포 용해, 유기 추출과 에탄올 침전을 통한 DNA 정제를 포함합니다. 이 방법은 분자 연구에 적합한 DNA를 생성하며, 균세균 연구에 신뢰할 수 있습니다.

세틸트리메틸암모늄 브로마이드 기법을 이용한 마이코박테리아 종에서 전체 게놈 디옥시리보핵산 추출

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

학습하세요 토양 및 퇴적물에서 고분자량 게놈 DNA 추출 방법을 통해 미생물 다양성과 대사 잠재력을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 다양한 토양 유형에 적용 가능합니다.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

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