소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물학 및 면역학과의 Stephen Harlem 교수님 연구실 소속 San Lee입니다. 오늘은 산림 토양뿐만 아니라 다양한 종류의 토양 및 퇴적물에 적용 가능한 고분자량 게놈 DNA 추출 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 토양 미생물 군집의 forest meter 라이브러리를 구축하기 위해 고분자량 게놈 DNA를 사용합니다.

이렇게 준비된 라이브러리를 통해 서로 다른 토양 층위에 따라 구분된 미생물 군집의 다양성과 대사 잠재력을 연구할 수 있습니다. 이제 시작하겠습니다. 본 프로토콜은 세포 용해 단계부터 시작합니다.

첫 번째 단계는 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)을 첨가하여 변성 완충액의 최종 농도를 0.5%로 맞추는 것입니다. 최상의 결과를 얻으려면 변성 용액을 매번 새로 조제하십시오. 또는 4°C에서 보관한 지 일주일이 되지 않은 완충액을 사용하십시오. 다음 단계를 위해 액체 질소 용기, 오토클레이브, 그리고 미리 냉각시킨 막자사발과 스패튤라가 필요합니다.

미리 냉각시킨 막자사발에 2 g의 냉동 토양 시료를 넣습니다. 변성 용액 1 mL를 첨가합니다. 그다음 토양이 완전히 잠길 때까지 액체 질소를 넣습니다.

미리 냉각시킨 막자로 토양 입자가 가루 형태의 균일한 모습이 되고 샘플이 녹기 시작할 때까지 갈아줍니다. 그런 다음 액체 질소를 더 추가하고 분쇄 단계를 반복합니다. 이렇게 하면 미리 냉각시킨 스패튤라를 이용한 세포 용해 단계가 완료됩니다.

분쇄된 시료를 50 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 즉시 DNA 추출 단계로 진행하려면 시료를 얼음 위에 보관하고, 그렇지 않으면 minus 80 degrees Celsius에서 보관하십시오. 나중에 사용하기 위해 DNA 추출을 시작하기 직전에 hexa deco trimethyl ammonium bromide(CTAB)와 SDS를 추가하여 추출 버퍼를 완성하십시오.

CTAB이 결정화되었는지 확인하고, 결정화되었다면 진행하기 전 60 °C에서 용해하십시오. 그다음, 최종 농도가 1%가 되도록 용액에 첨가하십시오. 다음으로, 최종 농도가 2%가 되도록 20% SDS 용액을 첨가하십시오. 이때 우윳빛 현탁액이 형성되는 것은 정상입니다.

SDS를 첨가한 후, 10분에서 15분 뒤에 60 °C에서 보관하여 완성된 추출 버퍼의 균질성을 유지하십시오. 추출 버퍼가 잘 용해되어 균질해지면, 토양 샘플에 추출 버퍼 9 mL를 넣고 저속으로 짧게 볼텍싱하여 혼합합니다. 추출 버퍼가 포함된 샘플을 65 °C 하이브리다이제이션 오븐에서 40분 동안 배양하십시오.

배양하는 동안 10분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞거나, 로터의 최저 속도로 튜브를 지속적으로 회전시키십시오. 배양하는 동안 또는 배양 후에 용액의 점도가 약간 높아질 수 있습니다. 다음 단계에서는 클로로포름-이소아밀 알코올을 사용하여 용해 혼합물 내의 유기 물질로부터 DNA를 정제합니다.

먼저 흄후드 내에서 샘플을 약 10~14 °C로 1800 Gs에서 10분 동안 원심분리한 후, 피펫 팁을 튜브 벽면을 따라 조심스럽게 내려 상단의 베이지색 층과 하단의 유기층을 피해 DNA가 포함된 상층액을 수집합니다. 이 상층액을 20 mL의 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform-isoamyl alcohol)이 들어 있는 미리 냉각된 50 mL 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 동일한 샘플에 대해 추출 과정을 두 번 더 반복합니다. 그동안 DNA 추출물과 클로로포름-이소아밀알코올은 흄후드 내의 얼음 위에 보관합니다.

두 번째 DNA 추출을 위해, 잔류 추출 버퍼와 함께 토양 펠릿이 들어 있는 튜브로 돌아가 추출 버퍼 5 mL를 추가로 넣습니다. 1 mL 팁으로 부드럽게 저어 혼합한 후, 이전과 같이 짧게 볼텍싱하여 펠릿을 재현탁합니다. 이번에는 65 °C에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 1800 Gs에서 10분 동안 원심분리합니다. 후드 내 약 10~14 °C 환경에서, 상층액을 클로로포름-이소아밀알코올(chloroform, isoamyl alcohol 또는 chloroform i a a)과 이전 추출 단계의 상층액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 토양 샘플에서 가능한 한 많은 DNA를 추출하기 위해 전체 추출 과정을 한 번 더 반복합니다.

토양 샘플에 대해 총 3회의 추출을 완료한 후, 수집된 상층액과 클로로포름이 들어 있는 튜브를 회전판 위에서 1.25 rpm으로 10분 동안 매우 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 이 혼합 단계 후, 튜브를 약 10~14 °C에서 1800 Gs로 20분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면, 수성 상과 유기 상 사이의 계면이 흐트러지는 것을 방지하기 위해 상층액 1~2 mL를 남겨두고 수성 상을 새로운 초원심 분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 이제 DNA를 침전시키기 위해 0.6 mL의 isopropyl alcohol을 첨가합니다.

수집한 상층액 1 mL당 튜브를 몇 번 가볍게 뒤집어 혼합합니다. 이 단계에서 DNA가 긴 실 형태로 침전되는 것을 관찰할 수 있습니다. 그 후 DNA를 이소프로판올과 함께 실온에서 30분 동안 배양합니다.

배양 후, 원심분리를 통해 DNA를 펠릿화합니다. 원심분리기에 튜브를 넣을 때 한쪽 모서리에 표시를 하여 DNA 펠릿이 형성될 위치를 확인할 수 있도록 합니다. 20~25 °C에서 16,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 디캔팅 또는 진공 흡입 방식으로 이소프로판올을 제거합니다. 추출 효율과 토양 샘플의 바이오매스에 따라 크기가 거의 보이지 않는 수준에서 최대 9 mm 너비까지 다양하므로 DNA 펠릿을 소실하지 않도록 주의하십시오. DNA 펠릿을 상온에서 5~20분 동안 건조합니다. 펠릿이 건조될 때까지 기다리되, 과하게 건조되지 않도록 주의하십시오.

DNA를 200에서 400 µL의 TE에 재현탁합니다. 가볍게 쳐서 혼합합니다. DNA 용액을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.

DNA를 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 토양 샘플에서 DNA를 추출한 후 DNA를 완전히 용해시키기 위해, 샘플의 농도 및 DNA 무결성을 확인하는 나머지 단계는 표준 절차를 따르며, 이는 Hallam 연구실의 다른 JoVE 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 원하는 방법을 사용하여 DNA 농도를 측정하십시오.

또한, pulsed field gel electrophoresis 또는 PFGE를 사용하여 DNA 샘플 10에서 20 µL를 전기영동함으로써 고분자량 DNA의 무결성을 확인하십시오. DNA의 중앙값 크기는 이후 응용 단계에 따라 36 kb 이상이어야 합니다. 다음의 cesium chloride 밀도 구배 원심분리 단계로 진행하십시오. 또는, 초원심분리 전에 DNA를 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.

다음 단계는 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리를 사용하여 불순물을 제거함으로써 DNA를 추가로 정제하는 것이며, 이후 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리 농축 과정을 거쳐 AmCon 및 MicroCon 원심 여과 장치를 이용해 DNA를 추가 정제합니다. 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리는 고순도 DNA를 얻는 데 핵심적인 과정이며, 이에 대한 자세한 내용은 Hallam 연구실의 다른 JoVE 프로토콜에 기술되어 있습니다. 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리와 농축 단계를 수행한 후, 원하는 방법을 사용하여 DNA 농도를 확인하십시오.

다음으로, DNA의 소량을 PFGE로 분석하여 고분자량 DNA의 무결성을 다시 한번 확인합니다. 세슘 클로라이드 초원심분리 전후의 겔 결과에서 알 수 있듯이, 2g의 강제 토양에서 분리된 전체 게놈 DNA 양은 10에서 180 µg 범위입니다. 분리된 DNA의 크기 범위는 보통 40에서 60 kb 사이이며, 여기에는 세슘 클로라이드 초원심분리 전후 게놈 DNA 샘플의 크로마토그램이 나타나 있습니다.

이 단계는 DNA의 순도를 높여 260/280 비율을 이전의 1.3에서 1.6으로, 이후에는 1.8에서 1.9까지 증가시킵니다. 또한, 휴믹산 오염을 의미하는 230 nanometers에서의 최대 흡광도가 원심분리 후 성공적으로 감소했습니다. 지금까지 토양 미생물 군집에서 고분자 게놈 DNA를 분리하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 지침에 따라 추출 및 변성 완충액을 정확하게 제조하는 것이 중요합니다. 또한 isopropyl alcohol 침전 후 DNA 펠릿에 손이 닿지 않도록 주의하십시오. 염화물 밀도 구배 원심분리 후 DNA 밴드를 회수하십시오.

DNA 회수율을 극대화하기 위해 시린지를 TE로 헹구는 것을 잊지 마십시오. 마지막으로, 제안된 모든 단계에서 분리된 DNA의 양과 품질을 확인하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.