소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 미생물학 및 면역학과의 스티븐 할렘 연구실의 산 리입니다. 오늘 우리는 다양한 토양 및 퇴적물 유형에도 적용할 수 있는 고분자량 유전체, 숲에서 토양으로의 DNA 추출 절차를 보여줍니다. 우리는 고분자량 유전체, DNA를 사용하여 토양 미생물 군집의 산림 미터 라이브러리를 구축합니다.

이러한 라이브러리를 통해 우리는 서로 다른 토양 지평선 사이를 분할하는 미생물 군집의 다양성과 대사 잠재력을 연구할 수 있습니다. 시작하겠습니다. 이 프로토콜은 세포 용해로 시작합니다.

첫 번째 단계는 베타 메르 캡토 에탄올을 0.5% 농도로 첨가하여 변성 완충액을 완성하는 것입니다.최상의 결과를 얻으려면 변성 용액을 매번 새로 만드십시오. 또는 섭씨 4도로 유지된 1주일 미만의 버퍼를 사용합니다. 다음 단계에서는 액체 질소와 오토클레이브, 미리 냉각된 모르타르 절구공이 필요합니다.

2g의 냉동 토양 샘플을 미리 식힌 모르타르에 넣습니다. 변성 용액 1ml를 추가합니다. 그런 다음 액체 질소를 첨가하여 토양을 완전히 덮습니다.

미리 식힌 절굿공이를 사용하여 토양 입자가 가루처럼 균일하게 보이고 샘플이 녹기 시작할 때까지 샘플을 분쇄합니다. 그런 다음 액체 질소를 더 넣고 분쇄 단계를 반복합니다. 이것으로 사전 냉각된 주걱을 사용하여 세포 용해 단계가 완료됩니다.

분쇄 샘플을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 보관하여 DNA 추출 단계로 즉시 진행하거나 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 리터 사용의 경우, DNA 추출을 시작하기 직전에 헥사 데코 트리메틸 암모늄 브로마이드 또는 CTAB 및 SDS를 추가하여 추출 버퍼를 완성합니다. 첫.

CTAB이 결정화되었는지 확인하고, 결정화되어 있는 경우 진행하기 전에 섭씨 60도에서 용해합니다. 그런 다음 1%의 총 농도를 위해 용액에 첨가하십시오.다음으로, 20% SDS 용액을 2%The 유백색 현탁액의 최종 농도에 첨가하십시오. 그 형태는 정상입니다.

SDS가 추가되면 10-15분 후에 섭씨 60도에서 보관하여 완성된 추출 버퍼를 균일하게 유지합니다. 추출 버퍼가 잘 용해되고 균질해지면 토양 샘플에 9ml의 추출 버퍼를 추가하고 저속으로 잠시 소용돌이하여 혼합합니다. 추출 버퍼가 있는 샘플을 섭씨 65도의 혼성화 오븐에서 40분 동안 배양합니다.

배양 중에는 10분마다 튜브를 부드럽게 뒤집거나 로터의 가장 낮은 속도로 튜브를 계속 회전시킵니다. 배양 중에는 용액이 배양 후 약간 점성이 나타날 수 있습니다. 다음 단계는 클로로포름 이소아밀 알코올을 사용하여 용해 혼합물의 유기 물질에서 DNA를 정제

후드에서 약 섭씨 10-14도에서 1800Gs로 10분 동안 샘플을 원심분리하는 것으로 시작하고, 상단의 베이지색 층과 하단의 유기층을 피하면서 튜브 측면을 따라 피펫 팁을 조심스럽게 밀어 상층액이 포함된 DNA를 수집합니다. 상등액을 20밀리리터의 클로로포름 ISL 알코올이 들어 있는 미리 냉각된 50밀리리터 튜브로 옮기거나 다음으로 동일한 샘플에서 추출 과정을 두 번 더 반복합니다. 한편, DNA 추출물과 클로로포름 i a a를 후드의 얼음에 보관하십시오.

두 번째 DNA 추출의 경우 잔류 추출 버퍼가 있는 토양 펠릿이 들어 있는 튜브로 돌아가서 추출 버퍼를 5ml씩 더 추가합니다. 1밀리리터 팁으로 부드럽게 저어 섞고 짧게 소용돌이쳐 이전과 같이 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이번에는 섭씨 65도에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 1800Gs에서 10분 동안 원심분리합니다. 후드에서 약 섭씨 10도에서 14도에서 클로로포름, 이소 아밀 알코올 또는 클로로포름 ia와 이전 추출의 상등액이 들어있는 튜브로 상등액을 옮깁니다. 전체 추출 과정을 한 번 더 반복하여 토양 샘플에서 가능한 한 많은 DNA를 추출합니다.

토양 샘플에서 총 3 번의 추출을 완료하면, 수집 된 수프라 나탄트와 클로로포름 i a a 가 들어있는 튜브를 1.25 RRP m에서 10 분 동안 회전 플레이트에 아주 부드럽게 흔든다.이 혼합 단계 후 1800 Gs에서 튜브를 약 섭씨 10-14도에서 20 분 동안 원심 분리한다. 원심분리 후, 수성상을 새로운 초원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고, 수성상과 유기상 사이의 계면을 방해하지 않도록 1-2밀리리터의 SNAT를 남겨둡니다. 이제 DNA를 침전시키기 위해 0.6 밀리리터의 이소 프로필 알코올을 첨가하십시오.

수집된 상등액의 각 밀리리터에 튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집어 섞습니다. 이 시점에서, DNA가 긴 실로 침전되는 것을 볼 수 있을 것이다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 DNA에 이소프로판올을 배양합니다.

외피 후에, 당신이 16, 20에서 25 섭씨 온도에 20 분 동안 DNA 펠릿 회전급강하를 예상하기 위하여 어디 알고 있다 그래야 당신이 원심분리기로 그것을 둘 때 관의 1개의 구석을 원심분리에 의하여 원심분리에 의하여 DNA를 표하는 것은 검약하는 시간이고, decanting 그리고/또는 진공 흡입에 의하여 이소프로필 알콜을 제거한다. 토양 샘플의 추출 효율과 바이오매스에 따라 거의 보이지 않는 것부터 9mm 너비까지 다양한 크기의 DNA 펠릿을 잃지 않도록 주의하고 DNA 펠릿을 실온에서 5분에서 20분 동안 건조시킵니다. 펠릿이 건조될 때 과도하게 건조되지 않도록 주의하십시오.

DNA를 200-400 마이크로 리터의 te에 재현탁시킵니다. 가볍게 두드려 섞습니다. DNA 용액을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

DNA를 하룻밤 동안 섭씨 4도로 유지하십시오. 토양 샘플에서 DNA를 추출한 후 DNA를 완전히 용해하기 위해 샘플의 농도 및 DNA 무결성을 확인하기 위한 나머지 단계는 표준 절차이며, 이는 Hallam 실험실의 다른 JoVE 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 원하는 방법을 사용하여 DNA 농도를 측정하십시오.

또한 펄스장 겔 전기영동 또는 PFGE를 사용하여 10-20마이크로리터의 DNA 샘플을 추출하여 고분자량 DNA의 무결성을 확인하십시오. DNA 크기의 중앙값은 다운스트림 애플리케이션에 따라 36 kilobase 이상이어야 합니다. 다음 염화세슘 구배 원심분리 단계로 진행하거나, 초원심분리 전에 DNA를 섭씨 영하 20도 또는 영하 80도에서 저장할 수 있습니다.

다음 단계는 염화세슘 구배 원심분리를 사용하여 염화세슘 구배 원심분리 농축액에 이어 불순물을 제거하여 DNA를 추가로 정제하고 AmCon 및 MicroCon 원심 분리 필터 장치를 사용하여 DNA를 추가로 정제하는 것입니다. 염화세슘 구배 원심분리는 고품질 DNA를 달성하기 위한 핵심이며 Hallam 실험실의 또 다른 JoVE 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 염화세슘 구배 원심분리 및 농도 단계를 수행한 후 원하는 방법을 사용하여 DNA 농도를 확인합니다.

다음으로, PFGE를 사용하여 DNA의 작은 샘플을 실행하여 고분자량 DNA의 무결성을 한 번 더 확인합니다. 2g의 강제 토양에서 분리된 게놈 DNA의 총량은 염화 세슘 초원심분리 전후의 겔 실행에서 볼 수 있듯이 10에서 180마이크로그램 사이입니다. 분리된 DNA의 크기 범위는 일반적으로 40-60 kilobases이며, 여기에 표시된 것은 염화 세슘 초원심분리 전후의 게놈 DNA 샘플의 크로마토그램입니다.

이 단계는 DNA의 순도를 향상시켜 2개의 80 비율에 비해 2개의 60을 이전에는 1.3에서 1.6으로, 나중에는 1.8에서 1.9로 증가시킵니다. 또한, 230나노미터에서의 최대 흡광도는 원심분리 후 부식산 오염을 성공적으로 감소시켰습니다. 지금까지 토양 미생물 군집으로부터 고분자 게놈 DNA를 분리하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 지침에 따라 정확하게 추출 및 변성 버퍼를 만드는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그리고 이소프로필 알코올 침전 후 DNA 입천장에 도달하지 않도록 주의하십시오. 염화물 구배 중심화 후 DNA 밴드를 회복할 때.

DNA 회수를 최대화하기 위해 TE로 주사기를 헹구는 것을 잊지 마십시오. 마지막으로, 제안된 모든 단계에서 분리된 DNA의 양과 질을 확인합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.