Name: 조립, 조정 및 단백질 이미징을위한 Apertureless 니어 필드 적외선 분광 현미경의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-25T03:33:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 배우세요 근접장 적외선 현미경 조립 및 정렬 방법을 사용하여 단백질 응집체를 관찰하는 기법입니다. 가시광 레이저를 활용한 정렬 과정으로 신경과학 및 생물물리학 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+the+surface+of+self-assembled+polystyrene-b-poly%28methyl+methacrylate%29+diblock+copolymer+films+using+apertureless+near-field+IR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy.</a> Langmuir. 24, 6946-6951 (2008).</li>
<li>Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared-reflection-mode+near-field+microscopy+using+an+apertureless+probe+with+a+resolution+of+lambda%2F600%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600.</a> Opt. Lett. 21, 1315-1317 (1996).</li>
<li>Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+visible+and+mid-infrared+scattering-type+near-field+optical+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Performance of visible and mid-infrared scattering-type near-field optical microscopes.</a> J. Microsc. 210, 311-314 (2003).</li>
<li>Kim, Z. H., Leone, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-selective+mapping+of+near-field+intensity+and+phase+around+gold+nanoparticles+using+apertureless+near-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy.</a> Optics Express. 16, 1733-1741 (2008).</li>
<li>Bridger, P. M., McGill, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nanometer-scale+optical+property+discrimination+by+use+of+a+near-field+scanning+apertureless+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope.</a> Opt. Lett. 24, 1005-1007 (1999).</li>
<li>Stebounova, L., Akhremitchev, B. B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+weak+scattered+signal+in+apertureless+near-field+scanning+infrared+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 74, 3670-3674 (2003).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Pollack, S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apertureless+Scanning+Near-Field+Infrared+Microscopy+of+a+Rough+Polymeric+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface.</a> Langmuir. 17, 2774-2781 (2001).</li>
<li>Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D. W., Novotny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facts+and+Artifacts+in+Scanning+Near-Field+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 81, 2492-2498 (1997).</li>
<li>Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact-free+near-field+optical+imaging+by+apertureless+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy.</a> Appl. Phys. Lett. 77, 621-623 (2000).</li>
<li>Palanker, D. V., Simanovskii, D. M., Huie, P., Smith, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Contrast+Parameters+and+Topographic+Artifacts+in+Near-Field+Infrared+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 88, 6808-6814 (2000).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G. C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir. 18, 5325-5328 (2002).</li>
<li>Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+Spectroscopic+Mapping+of+Single+Nanoparticles+and+Viruses+at+Nanoscale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution.</a> Nano Lett. 7, 1307-1310 (2006).</li>
<li>Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nano-chemical+mapping+performed+by+an+AFM-based+%28%22AFMIR%22%29+acousto-optic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique.</a> Ultramicroscopy. 107, 1194-1200 (2007).</li>
<li>Yang, D. S., Yip, C. M., Huang, T. H. J., Chakrabartty, A., Fraser, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+Amyloid-%CE%B2+Aggregation+Pathway+with+Chemical+Chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones.</a> J. Biol. Chem. 274, 32970-32974 (1999).</li>
<li>Meadows, P. Y., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Microscopy+Studies+of+Fibronectin+Adsorption+and+Subsequent+Cellular+Adhesion+to+Substrates+with+Well-Defined+Surface+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries.</a> Langmuir. 21, 4096-4107 (2005).</li>
</ol>

조립, 조정 및 단백질 이미징을위한 apertureless 니어 필드 적외선 분광 현미경의 사용

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

본 논문은 회절 한계 이상의 이미징을위한 적외선 니어 필드 현미경의 조립 및 운영에 독자를 지시하는 것을 목표로하고있다. apertureless 니어 필드 현미경 써카 20 nm의 해상도에서 적외선 스펙트럼을 제공하는 광 산란 형태의 악기이다. 구성 요소와 사용하기 위해 단계별로 프로토콜의 전체 목록이 제공됩니다. 조립 및 악기 튜닝에 일반 오류가 설명합니다. 아밀로이드 근모의 차 구조를 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

이미징 단백질 집계에 nearfield 적외선 현미경의 어셈블리가 설명되어 있습니다.

조립, 조정 및 단백질 이미징을위한 Apertureless 니어 필드 적외선 분광 현미경의 사용

본 논문은 회절 한계를 넘어서는 이미징을 위한 적외선 근접장 현미경의 조립 및 작동 방법을 독자에게 안내하는 것을 목적으로 합니다. ...

다중 모드 AFM 및 광학 현미경을 설치함으로써 광학 설정의 초기 조립을 완료합니다. 보이지 않는 적외선 빔의 정렬은 먼저 가시광선 적색 헬륨 네온 레이저를 이용해 정렬함으로써 더 쉽게 수행할 수 있습니다. 적외선 빔을 겹치게 하기 위해 실선을 사용하며, 점선을 통해 레이저 광이 캔틸레버 팁 정점과 적외선 검출기에 닿는 것을 관찰하는 것이 목적입니다.원하는 근접장 신호가 얻어졌을 때 적절한 형태의 1F 신호를 얻기 위해 광학 현미경의 위치와 거울을 조정하여 적외선 빔의 최종 정렬을 수행합니다. 동시에 NanoScope 소프트웨어를 사용하여 AM 지형도와 근접장 이미지를 수집합니다. 안녕하세요, 토론토 대학교 화학과의 Gilbert Walker 교수입니다.안녕하세요, 저는 Gilbert Walker 연구실의 Melissa Paulite입니다. 오늘은 aperture list 근접장 적외선 주사 현미경의 초기 조립 및 정렬 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 단백질 응집체를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. 이미징 시스템의 조립 및 조정을 설명하기에 앞서, 전체 시스템의 간략한 개요를 살펴보겠습니다. 이 영상에서 설명할 이미징 시스템의 구성 요소에는 광학 테이블, 멀티모드 원자힘 현미경(AFM)의 베이스, 멀티모드 AFM의 스캐너, 높낮이 조절이 가능한 광학 브레드보드, 가이드 미러, 아이리스와 센터가 포함된 광학 튜브가 포함됩니다.아연 셀레나이드 부분 반사경으로 광학 큐브를 차단하고, 승강 플랫폼에 설정을 고정하는 데 사용되는 광학 튜브를 설치합니다. 적외선 대물렌즈와 후방 산란광 수집을 위한 광학 튜브를 배치합니다. 축외 포물면 거울이 포함된 큐브와 게르마늄 플레이트를 45도로 유지하는 큐브를 설치합니다.현미경 접안렌즈, XY 스테이지에 장착된 핀홀, 그리고 수은 카드뮴 텔루라이드(MCT) 적외선 검출기를 준비합니다. 적외선 검출기 프리앰프, 빔 위치를 이동시키기 위한 XY 스테이지, 빔 초점을 맞추기 위한 승강 테이블, 적외선 검출기의 위치를 조절하기 위한 Z 스테이지 및 X 스테이지를 준비합니다. 광학 장치 조립을 시작하려면, 튜닝 미러를 사용하여 헬륨 네온 빔이 광학 테이블과 평행하도록 위치시킵니다.다음으로 큐브 내에 빔 스플리터가 없는 상태에서 큐브의 반대편 끝에 연장 광학 튜브를 배치하고, 헬륨 네온 빔이 튜브 양 끝에 부착된 아이리스를 통과하도록 조정합니다. 이제 스캐너

assembly-tuning-use-an-apertureless-near-field-infrared-microscope

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

기판 상에 세포 접착의 토폴로지는 가변 앵글 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터의 정밀도로 측정됩니다.

가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology

단백질 기능의 주요 단계, 특히 골격 구조 변화와 양성자 전달 반응은 종종 마이크로초에서 밀리초 사이의 시간 척도에서 발생합니다. 이러한 역학 과정은 시간 분해 단계 스캔 푸리에 변환 적외선 분광법으로 연구할 수 있으며, 특히 빛에 의해 기능이 트리거되는 단백질의 경우 연구할 수 있습니다.

에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

선물이 단일 레이블이 없는 단백질의 실시간 광학 탐지에 대 한 프로토콜으로 그들은 살아있는 세포에서 분 비 됩니다. 이 간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 다양 한 다른 생물 학적 시스템 및 구성에 적용 될 수 있는 기반으로 합니다.

레이블 무료 이미징의 단일 단백질 분 비 iSCAT 현미경 검사 법을 통해 살아있는 세포에서

이 프로토콜은 시험관 내 표면 분석법을 사용하여 미세 소관의 무, 고대비, 고속 이미징을 위한 표준 형광 현미경에 간섭 반사 현미경 을 구현하기 위한 가이드입니다.

마이크로소관의 라벨이 없는 고속 이미징을 위한 간섭 반사 현미경 검사법 구현

여기서, 우리는 뇌 영역에서 단백질을 분석 하기 위해 면역 조직 화학 및 고해상도 스캔과 함께 근 적외선 염료를 사용 하는 프로토콜을 제시 합니다.

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

우리는 개시 및 발달과 밀접하게 연관되는 올리고머 응집체 및 아밀로이드 섬유로 단백질 자기 조립의 과정을 구상하기 위하여 적외선 나노 스펙트로스카 및 고해상도 원자력 현미경 검사법의 응용을 기술합니다 인간의 신경 퇴행성 질환의 넓은 범위의.

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&amp;B) 분석을 기반으로 합니다.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

원자력 현미경-적외선 분광법(AFM-IR)은 세균 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공하여 나노 스케일 해상도를 달성할 수 있습니다. 둘 다, 세포 외 변화의 매핑 (예를 들어, 세포 분열시) 뿐만 아니라 화학 조성의 비교 연구 (예를 들어, 약물 내성에서 발생) 박테리아의 단일 세포 수준에서 수행 될 수있다.

원자력 현미경 검사법은 단일 박테리아 화학을 조사하는 도구로 적외선 분광법과 결합

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

배우세요 근접장 적외선 현미경 조립 및 정렬 방법을 사용하여 단백질 응집체를 관찰하는 기법입니다. 가시광 레이저를 활용한 정렬 과정으로 신경과학 및 생물물리학 연구에 활용됩니다.

조립, 조정 및 단백질 이미징을위한 Apertureless 니어 필드 적외선 분광 현미경의 사용

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