조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

이 비디오에서는 조직 공학 및 세포 배양에서 널리 사용되는 기술로, 천연 세포외 기질의 구조와 크기 규모를 모방한 섬유 지지체를 제작하는 전기방사 폴리머 공정을 보여줍니다. 본 영상에서는 빛 노출을 통해 가교 결합이 가능한 광반응성 히알루론산을 전기방사하며, 세포 침투와 조직 분포를 증가시키기 위해 채널, 지지체 및 다중 규모 기공을 생성하는 광 패턴 형성과 같은 추가 가공 응용법을 소개합니다. 또한, 두 가지 서로 다른 폴리머를 동일한 매트에 전기방사할 수 있는 다중 폴리머 지지체 형성법을 사용하여, 지지체의 역학적 성질과 분해 속도를 조절하고 세포 침투를 위한 기공성을 최적화하는 방법을 제시합니다.

안녕하세요, 저는 펜실베이니아 대학교 바이오공학과 Jason Burdick 교수님 연구실의 Jamie Kovi입니다. 안녕하세요, 저 또한 Burdick 연구실의 Harini Swin입니다. 오늘은 조직 공학을 위한 전기 방사 섬유 지지체 제작 절차를 보여드리겠습니다.

또한 광패턴화(photo patterning) 및 다중 폴리머 스캐폴드 형성의 추가적인 가공 기능에 대해 소개하겠습니다. 저희 실험실에서는 히알루론산 스캐폴드 내에서 HMSE 세포의 상호작용과 침투를 연구하기 위해 이러한 절차를 사용합니다. 또한, 반월판이나 심근과 같은 섬유 강화 조직을 연구하기 위해 다양한 다른 폴리머에 이 기술들을 적용하고 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 광개시제 0.5% 중량 용액을 준비하십시오. Irgacure 2959(또는 I 2959)를 탈이온수에 넣고 37°C에서 수일 동안 용해시켜 제조합니다.

전기방사(electro spinning)를 위해 광반응성 폴리머가 필요한 경우 I cure를 사용합니다. 탈이온수 내 최종 농도가 2%weight 메틸화 히알루론산(methylated hyaluronic acid) 또는 MEHA, 3%weight 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide) 또는 PEO, 그리고 0.05%weight I 2 9 5 9 용액이 되도록 혼합하여 전기방사 용액을 준비하며, 5분 동안 볼텍싱(vortex)한 후 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 용액을 용해시키기 위해, 용액을 시린지에 옮기고 끝부분에 18게이지, 6인치 길이의 뭉툭한 바늘(blunt end needle)을 부착합니다.

다음으로, 시린지 펌프를 사용하여 토출 속도를 1.2 milliliters per hour로 설정합니다. 시린지 엔진 바늘을 시린지 펌프에 삽입합니다. 고전압 전원의 접지 리드를 수집 장치에 연결합니다.

본 절차에서는 약 10 meters per second의 속도로 회전하는 맨드릴을 사용합니다. 정렬된 섬유를 수집하려면, 양극 리드를 바늘에 연결하고 바늘과 수집 장치 사이의 거리가 15 centimeter가 되도록 조정하십시오. 시린지 펌프의 유량을 시작하고 바늘 끝에 유체가 보이면, 전원을 켜고 전압을 22 kilovolts로 설정하십시오.

원하는 두께에 도달할 때까지 스캐폴드 위에 섬유를 수집합니다. 수집 시간은 원하는 두께와 사용된 전기방사 용액의 부피에 따라 달라집니다. 광패턴 형성(photo patterning)을 위해, 본 연구에서는 16시간 동안 전기방사한 매트를 사용합니다.

수집이 완료되면 수집 장치에서 스캐폴드를 제거하고, 용매를 완전히 제거하기 위해 하룻밤 동안 진공 상태로 보관하십시오. 가위로 스캐폴드 매트에서 5 mm × 5 mm 크기의 샘플을 잘라냅니다. 각 스캐폴드를 호일로 덮인 유리 슬라이드 위에 올려 가교 결합을 준비하고, 스캐폴드 위에 포토마스크를 직접 올린 후 깨끗한 유리 슬라이드로 덮고 바인더 클립으로 슬라이드의 양끝을 고정합니다.

질소 챔버를 사용하여 스캐폴드를 퍼지함으로써 산소 노출로 인한 가교 결합의 감소를 억제합니다. 스캐폴드 설정을 콜레이팅 어댑터와 함께 약 10 milliwatts per centimeter square 365 nanometer 광원이 있는 질소 챔버 내에 5분 동안 둡니다. 각 스캐폴드를 꺼내어 12웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다.

각 웰에 탈이온수 2 mL를 넣습니다. 물의 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하고 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 8시간마다 진공 피펫을 사용하여 웰 내의 탈이온수를 흡입해 제거하고 새로운 물로 교체합니다.

핫플레이트에서 90% ethanol에 PEO를 5%weight 용액으로 준비합니다. 실험 절차 시작 전, 50 °C에서 700 RPM으로 최소 2시간 동안 교반합니다. 교반 후, 최종 농도가 10 µg/mL가 되도록 DPI를 첨가합니다.

PEO 및 DPI 용액을 3 mL 주사기에 옮기고, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감쌉니다. 다음으로, 두 번째 섹션에서 설명한 전기 방사 용액을 준비하고, 최종 농도가 25 µM이 되도록 methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B를 마이크로 파이펫으로 3 mL 주사기에 첨가합니다. 그리고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감쌉니다.

스코치테이프를 사용하여 22 millimeter by 22 millimeter 크기의 메틸화 유리 커버슬립의 가장자리를 맨드릴 표면에 고정하여, 커버슬립이 맨드릴의 둘레에 맞게 배치되도록 합니다. 5 millimeter 길이의 실리콘 튜브를 사용하여 한쪽 끝을 루어락(lure lock) 커넥터가 있는 주사기 중 하나에 연결합니다. 반대쪽 끝은 바늘에 연결하고, 주사기를 주사기 펌프에 삽입한 뒤 바늘을 팬의 구멍에 통과시킵니다.

패너(fanner)는 맨드릴의 길이를 따라 이동하며, 결과물인 스캐폴드 내에서 두 폴리머가 균일하게 분포되도록 하는 역할을 합니다. MEHA가 담긴 시린지의 바늘 끝이 맨드릴의 중심에 위치하도록 확인하십시오. 바늘 끝을 맨드릴로부터 15 cm 거리에 배치하고, 패너를 바늘 끝으로부터 6 cm 거리에 설정하십시오.

시린지 펌프가 시간당 1.2 milliliters를 주입하도록 설정하고 전원 공급 장치를 22 kilovolts로 맞춥니다. PEO가 담긴 시린지도 동일한 방식으로 설치하되, 바늘 끝의 위치를 맨드릴로부터 10 centimeters 거리에 두고 전원 공급 장치를 15 kilovolts로 설정합니다. 그 다음, 조명을 끄고 맨드릴과 시린지 펌프를 작동시킵니다.

두 바늘의 끝에 액체가 보이면 주사기에서 알루미늄 호일을 제거하십시오. 수집이 완료되면 전원 공급 장치를 켜고 동시에 팬을 연결하십시오. 전원 공급 장치와 맨드렐의 전원을 끄고 팬의 플러그를 조심스럽게 뽑으십시오.

면도날을 사용하여 커버슬립과 테이프를 제거합니다. 섬유는 루민(rumine) 및 dpi 필터가 장착된 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 전기방사 고분자가 부착된 각 커버슬립을 6웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.

웰 플레이트의 스캐폴드를 2 mL의 PBS에 담가 하룻밤 동안 배양하여 용매와 오염 물질을 완전히 제거합니다. 24시간 후, 진공 흡입기로 웰 플레이트에서 PBS를 제거하고, 층류 후드(laminar flow hood) 내의 살균용 UV 램프 아래에서 30분 동안 스캐폴드를 둡니다. 멸균을 위해 표준 세포 배양을 수행하고, 원하는 세포 밀도로 농축된 세포 현탁액을 준비합니다.

예를 들어, 22 by 22 millimeter 커버슬립 하나당 100 milliliters의 세포 현탁액을 사용합니다. 이를 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 배양합니다. 각각에 적절한 양의 세포 배양 배지를 추가합니다.

스캐폴드를 다시 인큐베이터에 넣습니다. Invitrogen에서 판매하는 상용 live dead 키트를 사용하여 세포를 염색한 후, TRITC 및 FITC 필터가 장착된 형광 현미경을 통해 세포와 섬유를 관찰합니다. 접지된 평판 위에 수집된 스캐폴드에서는 기대한 대로 무작위로 분포된 섬유가 생성됩니다. 회전 맨드릴에 수집된 스캐폴드에서도 무작위로 분포된 섬유가 생성됩니다.

스캐닝 전자 현미경(scanning electron microscopy)으로 관찰했을 때 정렬된 섬유를 생성하기 위해, 스캐퍼폴을 탈이온수와 비반응성 ha에 침지시킨 후 스캐퍼폴과 광원 사이에 포토마스크를 배치하여 광가교를 진행합니다. 빛이 차단된 영역의 PEO는 제거되며, 형광 염료를 통해 확인할 수 있듯이 거대기공이 형성되는 것을 볼 수 있습니다. MEHA와 PEO 제트를 동시에 전기방사하면 각각의 폴리머로 구성된 뚜렷한 섬유 집단들을 포함하는 복합 스캐퍼폴이 생성됩니다.

HMC는 섬유와 긍정적으로 상호작용하는 것으로 보입니다. 녹색 염색으로 확인되듯 세포의 생존력이 유지될 뿐만 아니라, 빨간색 섬유를 따라 정렬되도록 방향을 잡는 것으로 보입니다. 지금까지 조직 공학을 위한 섬유 지지체를 전기 방사하는 방법을 살펴보았습니다.

또한 광 패턴 형성 및 다중 고분자 전기 방사와 같은 추가 기능을 도입했습니다. 이 절차를 수행할 때, 추가 실험을 시도하기 전에 균일한 섬유를 형성하도록 각 고분자의 전기 방사 파라미터를 최적화하는 것이 중요합니다. 이상으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.