Name: 조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 배우세요 조직 공학을 위한 전기방사법으로 광반응성 하이알루론산 섬유 스캐폴드를 제작하는 방법을. 광패턴화와 다중중합체 스캐폴드 형성 기술을 통해 세포 침투 및 조직 분포를 향상시킬 수 있습니다.

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이 작품은 JLI과 국립 연구소 히스 부여 R01AR056624의에 미국 심장 협회 Predoctoral 원정대에 의해 지원되었다.

A. 단일 폴리머 Electrospinning <ol><li> 전에 electrospinning 솔루션을 준비하기 위해 몇 일 동안 37 ° C를 용해하여 탈이온수에 photoinitiator의 0.5 % WT의 솔루션, Irgacure 2959 (I2959)를 확인하십시오. photoreactive 폴리머가 사용되고 있지 않으면이 단계는 필요하지 않습니다. </li><li> 이 WT % MeHA 3 WT %의 최종 농도와 솔루션을 준비하는 methacrylated hyaluronic 산 (MeHA, 버딕 외를 참조하십시오. 합성), 폴리 (에틸렌 옥사이드) (PEO, 900 KDA), 그리고 탈이온수에 I2959을 결합 PEO, 그리고 0.05 % WT의 I2959. 그것이 명확 때까지 솔루션을 혼합하는 소용돌이를 사용합니다. 폴리머 종류와 농도뿐만 아니라 용제 사용은 원하는 발판 특성에 따라이 단계에서 수정할 수 있습니다. </li><li> 주사기로 솔루션을 전송하고 끝까지 18 게이지, 길이 6 인치, 뭉툭한 끝 바늘을 첨부합니다. </li><li> 1.2 ML / HR의 속도로 추출 프로그램에 주사기 펌프. 장치에 주사기와 바늘을 삽입합니다. </li><li> 수집 장치에 높은 전압 전원의 접지 리드를 연결합니다. 무작위로 배포 섬유가 평면 금속 접시를 사용하여 수집하거나, 정렬 섬유를 수집하는 ~ 10m / s의 회전 심봉를 사용할 수 있습니다. 바늘에 긍정적으로 부과 리드를 연결합니다. electrospinning 장치의 구조도 1 그림을 참조하십시오. </li><li> 둘 사이에 15cm 거리가되는 등 바늘이나 수집 장치를 조정합니다. </li><li> 주사기 펌프의 흐름을 시작합니다. 액체가 바늘 끝 시각 경우, 전원 켜고 22 KV로 전압을 설정합니다. </li><li> 컬렉션 (박막 몇 분 거리에 두꺼운 매트를 위해 최대 24 시간) 완료 후 수집 장치에서 비계를 제거하고 그것은 용매의 완전한 제거를 위해 밤새 진공 아래에 저장합니다. </li><li> 스캐닝 전자 현미경 (SEM)를 사용하여 섬유 형태를 시각화, 대표 발판 양쪽 정렬이 아닌 정렬된 구조에 대한 그림 1에 표시됩니다. </li></ol> 참고 : 샘플 유량, 수집 장치로 거리와 전압이 폴리머와 용매 조합에 의존하고 있으며 일반적으로 SEM과 발판의 형태를 관찰하여 각 시스템에 최적화된해야합니다. B.의 Photocrosslinking 및 Photopatterning <ol><li> 발판 매트에서 5mm X 5mm 샘플을 잘라 버릴거야. </li><li> 유리 슬라이드를 덮고 호일에있는 각 발판을 놓는 발판에서 직접 photomask를 삽입, 깨끗한 유리 슬라이드로 덮개와 바인더 클립 양쪽을 클리핑하여 crosslinking 준비. 참고 : 네 샘플을 한번에 할 수 있으며, 패턴이 원하는되지 않은 경우 패턴이없는 투명성이 crosslinking 사용할 수 있습니다. </li><li> 정리 발판은 질소 챔버에 설정할 수 있습니다. crosslinking을 억제 할 수 산소에서 만들 무료 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> ~ 10 MW / cm 5 분 collimating 어댑터 2 365 NM 조명 아래에서 질소 챔버에 넣어 비계 설치. 그림 2에서 설계도를 참조하십시오. </li><li> 각각의 발판과 12 잘 접시에 장소를 제거합니다. </li><li> 각 음, parafilm 37 24 시간 동안 ° C의 물 장소 증발을 방지하기 위해 접시에 탈이온수 2 ML을 추가합니다. 물이 세 번 변경합니다. </li><li> 가벼운 현미경 기공 형성 (그림 2의 예제를 참조) 시각화. 공사장 공중 발판을 이제 사용할 준비가되어 있습니다. </li></ol> 참고 : Photocrosslinking는 고분자의 여러 유형, 그러나 photopatterning에만 photoreactive 폴리머와 함께 사용할 수있는 필요하지 않습니다. 형광 광섬유 시각화와 C. 듀얼 폴리머 Electrospinning <ol><li> 90 % 에탄올에 PEO (200 KDA)의 5 % WT의 솔루션을 준비합니다. 50 ° C 이전 electrospinning 최소한 2 시간 동안 700 rpm으로 저어. </li><li> 주사기로 PEO 솔루션을 전송하고 electrospinning 솔루션 10 MG / ML 농도의 최종 농도에 대한 DAPI를 추가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 주사기를 넣어. </li><li> electrospinning 솔루션에 25 μm의의 최종 농도에 대한 methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B을 (MeRho, 683.24 g / 몰) 추가는 제외하고, 단계 A2에서 설명하는 동일한 솔루션을 준비합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 주사기를 넣어. </li><li> 조심스럽게 심봉의 표면에 methacrylated 유리 coverslips을 (Khademhosseini 외를 참조하십시오.) 보안에 스카치 테이프를 사용합니다. 참고 : 섬유 methacrylated 유리 coverslips에 닿는 될 것입니다. </li><li> luer 잠금 첨부 파일이있는 주사기 중 하나에 실리콘 튜브의 5mm 긴 조각의 한쪽 끝을 연결하고 바늘로 다른 쪽 끝을 연결합니다. 주사기 펌프에 주사기를 삽입하고 부채질하는 사람에있는 구멍을 통해 바늘을 넣어. 심봉 반대 사이트에서 다른 주사기와 부채질하는 사람과 함께 반복합니다. fanners는 리터 번역심봉의 ength하며 결과 발판 두 고분자의 평등한 분배를 보장하기 위해 사용됩니다. 그림 3에 회로도를 참조하십시오. </li><li> 적절한 표 1에 따라 섹션에 설명된 매개 변수를 조정합니다. 바늘 팁이 심봉 중심 있는지 확인합니다. 표 1. 듀얼 폴리머 Electrospinning 매개 변수 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 주사기 </td><td> 부채질하는 사람으로 니들 팁 (cm) </td><td> 심봉 (CM)에 니들 팁 </td><td> 유량 (ML / HR) </td><td> 적용 전압 (KV) </td></tr><tr><td> MeHA </td><td> 6 </td><td> 15 </td><td> 1.2 </td><td> 22 </td></tr><tr><td> PEO </td><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 15 </td></tr></tbody></table> </li><li> 모든이 제대로 정렬되면 불을 끄고 심봉과 주사기 펌프를 켭니다. 주사기에서 알루미늄 호일을 제거합니다. 유체는 두 바늘의 끝부분에 볼 때, 동시에 fanners의 전원 공급 및 플러그 전원을 켜십시오. </li><li> 수집이 완료되면 전원 공급 장치 및 심봉을 해제하고 fanners를 뽑습니다. 조심스럽게 면도날을 사용하여 coverslips와 테이프를 제거합니다. </li><li> rhodamine 및 DAPI에 대한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 섬유를 시각화. 그림 3의 예제를 참조하십시오. 참고 : 시간 ​​(&lt;3 분)의 짧은 기간 동안 electrospun는하지만,이 과정은 특히 유리 coverslips를 사용하지 않고, 두꺼운 구조를 만들려면 시간의 무제한 연장 수있을 때 볼 수있는 형광 섬유는 대부분 명확하다 . </li></ol> 공사장 공중 발판 D.의 심는 셀 <ol><li> 개별로 잘 적절하게 크기 잘 접시의 첨부 electrospun 폴리머 각 coverslip를 놓습니다. 참고 : 섬유와 세포 상호 작용이 methacrylated 유리 coverslips에 electrospinning로 쉽게 볼 수 있습니다. 또한, MeRho 다시 섬유 시각화에 사용할 수 있습니다. </li><li> 용매의 완전한 제거 및 부산물 가능한 모든 leachable을 보장하기 위해 하룻밤 PBS에서 공사장 공중 발판을 품어. </li><li> 우물에서 PBS를 제거합니다. </li><li> 공사장 공중 발판을 소독하기 위해 30 분 동안 층류 후드에 살균 램프 하에서 그들을 놓으십시오. 전체 발판이 씨앗을하는 경우, 또 다른 30 ​​분 동안 살균 램프 아래 위에 발판과 장소를 플립. </li><li> 표준 세포 배양을 수행하고 (예 : 6000 전지 cm -2) 원하는 세포 밀도에 집중 세포 현탁액을 준비합니다. 예를 들어, 22mm X 22mm의 coverslip에 대한 세포 현탁액의 100 ML을 사용합니다. 1 시간 동안 인큐베이터에 놓습니다. </li><li> 각 잘하기 위해 세포 배양 매체의 적절한 금액을 추가합니다. 인큐베이터에 다시 공사장 공중 발판을 놓으십시오. </li><li> 상업적으로 사용 가능한 라이브 / 데드 키트를 사용하여 세포를 얼룩. 참고 사항 : DAPI (세포 핵)과 찬란 라벨 phalloidin (굴지 스트레스 섬유)와 같은 세포 얼룩의 다른 유형의 세포를 시각화하기 위해 적용할 수 있습니다. </li><li> 세포 TRITC 및 FITC에 대한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 섬유를 시각화. 그림 4의 예제를 참조하십시오. </li></ol> 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="그림 1" /> 그림 1. 비 - 정렬 발판 형성 (상단)과 정렬 발판 형성 (아래)의 장치 설정을 보여주는 도식. 발판의 각 유형의 예 스캐닝 전자 현미경 이미지는 표시됩니다. 스케일 바 = 5μm. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="그림 2" /> 그림 2. patterning 방식의 도식. 패턴은 photocrosslinking 동안 광원과 발판 사이 photomask을 배치하고 멀리 unreacted 폴리머를 세척하여 형성됩니다. 기공 형성과 lyophilization 후 공사장 공중 발판의 Photomask 및 SEM 이미지. 스케일 바 = 100 μm의. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="그림 3" border="0" /> 그림 3 여러 고분자 electrospinning 설정하고 필요한 처리 매개 변수의 도식뿐만 아니라,이 섬유 집단 (예 : 빨간색 MeHA 및 파랑 PEO)의 혼합의 대표적인 형광 이미지. 멀티 폴리머 비계를 형성하는 동시에 electrospun되었습니다 . 스케일 바 = 100 μm의. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">여기를 클릭하십시오</a> 큰 versio를보고그림 3 N. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="그림 4" /> 그림 4. 인간 mesenchymal 줄기 세포와 electrospun 섬유와의 상호 작용의 예를 들어 데드 / 라이브 얼룩 이미지. 스케일 바 = 100 μm의. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">여기를 클릭</a> 그림 4의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li>
<li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li>
<li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+on+the+Straight+and+Narrow%3A+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+B%22%5BJournal%5D)">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., Von Recum, H. avon <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Electrospinning는 고분자의 섬유 공사장 공중 발판을 준비하는 데 사용되었다. Photocrosslinkable 빛의 노출이 crosslinking에 대해 필요한 설명의 예제로 사용되었던 hyaluronic 산성에 기반 공사장 공중 발판. 같은 MeHA 같은 반응 macromers의 사용으로 이전에 향상된 세포 분포를 보여준 채널은 매크로와 마이크로 다공성 공사장 공중 발판을 형성 photocrosslinking 동안 마스크를 사용하여 공사장 공중 발판에 통합되었습니다. 또한, 두 개의 폴리머 동시에 우리의 사용자 정의 장치를 사용하여 electrospun되었습니다. 두 개의 섬유 집단의 존재는 나중에 형광 현미경을 사용하여 조회되었습니다 각 electrospinning 솔루션에 형광 염료의 추가와 함께 확인했다. 멀티 고분자 공사장 공중 발판은 셀룰러 유통뿐만 아니라, 단일 중합체 electrospun의 공사장 공중 발판에 비해 특정 응용 프로그램에 더 나은 조정 역학 및 발판의 저하를 개선하는 데 사용할 수 있습...

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td> 시약</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>I2959</td><td>시약</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEO 200 kDa</td><td></td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17503</td><td></td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>메타크릴록시에틸 티오카바모일 로다민 B</td><td>시약</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>DMSO로 스톡 용액을 조제하십시오.</td></tr><tr><td>Live/Dead 염색 키트</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Calcein(살아있는 세포를 녹색으로 염색) 및 ethidium homodimer(죽은 세포를 적색으로 염색)를 포함함</td></tr><tr><td>주입 펌프</td><td>장비</td><td>KD 사이언티픽</td><td>KDS100</td><td>이중 고분자 방사(dual polymer spinning)를 위해 두 개가 필요합니다.</td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>장비</td><td>감마 고전압</td><td>ES30P-5W</td><td>이중 폴리머 방사를 위해서는 두 개가 필요합니다.</td></tr><tr><td>모터</td><td>장비</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>자체 제작한 맨드릴(mandrel)에 부착해야 함</td></tr><tr><td>회전속도계</td><td>장비</td><td>네트워크 툴 웨어하우스</td><td>ESI-330</td><td>맨드릴 속도 모니터링에 사용하십시오.</td></tr><tr><td>콜리메이팅 어댑터가 장착된 Omnicure UV 스팟 경화 시스템</td><td>장비</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td>장비</td><td>McMaster-Carr</td><td>51135K151</td><td></td></tr><tr><td>루어 록 암컷 어댑터</td><td>장비</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td></td></tr><tr><td>루어 락 수형 어댑터</td><td>장비</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td></td></tr><tr><td>바늘</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>장비</td><td>Corning</td><td>2875-22</td><td></td></tr></tbody></table>

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 electrospinning

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

조직 공학 분야는 진화로 더 복잡한 장기와 조직의 요구 사항 (예, 기계 부품과 vascularity) 주소 위해 더 적합한 소재 및 가공 기술을 생산하기 위해 엄청난 수요가있다. Electrospinning는 원래 세포외 기질의 구조 및 크기의 규모를 모방 섬유 공사장 공중 발판을 만드는 인기있는 기술입니다. 섬유 줄기 세포 분화 (Mauck하여 광범위한 리뷰보기 포함한 세포 동작을 직접하는 데 사용될 수 있기 때문에 이러한 섬유 공사장 공중 발판은 또한 세포 배양 기판으로 유용합니다<em&gt; 외.</em&gt; 및 실<em&gt; 외.</em&gt; 자세한 내용). 이 문서에서는, 우리는 폴리머를 electrospinning의 일반적인 과정을 설명하고 예를 들어, electrospin 가벼운 노출과 crosslinking 수있는 반응 hyaluronic의 산성 (참조 Ifkovits<em&gt; 외.</em&gt; photocrosslinkable 자료에 대한 검토를 위해). 우리는 또한 photopatterning 및 멀티 폴리머 비계 형성과 같은 추가 처리 능력을 소개합니다. Photopatterning는 세포 침투와 조직 분포를 높이기 위해 채널과 다중 스케일 다공성과 공사장 공중 발판을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 다중 폴리머 공사장 공중 발판을 더 나은 세포 침투를위한 맞춤형 다공성 포함한 비계의 속성을 (역학 및 파괴), 조정에 유용합니다. 또한, 이러한 기술은 성공적인 조직 설계 구조의 개발에 필요한 단서를 제공 복잡한 공사장 공중 발판을 만드는 폴리머와 반응 macromers의 다양한 배열을 포함하도록 확장될 수 있습니다.

조직 공학 및 세포 배양을위한 폴리머를 electrospinning의 과정은이 문서에서 해결되었습니다. 특히 photopatterning 멀티 고분자 electrospinning의 추가 처리 능력과 photoreactive macromers의 electrospinning이 설명되어 있습니다.

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

조직 공학 분야가 발전함에 따라, ...을 해결하기 위해 더욱 적합한 재료와 공정 기술을 개발해야 한다는 막대한 수요가 존재합니다.

이 비디오에서는 조직 공학 및 세포 배양에서 널리 사용되는 기술로, 천연 세포외 기질의 구조와 크기 규모를 모방한 섬유 지지체를 제작하는 전기방사 폴리머 공정을 보여줍니다. 본 영상에서는 빛 노출을 통해 가교 결합이 가능한 광반응성 히알루론산을 전기방사하며, 세포 침투와 조직 분포를 증가시키기 위해 채널, 지지체 및 다중 규모 기공을 생성하는 광 패턴 형성과 같은 추가 가공 응용법을 소개합니다. 또한, 두 가지 서로 다른 폴리머를 동일한 매트에 전기방사할 수 있는 다중 폴리머 지지체 형성법을 사용하여, 지지체의 역학적 성질과 분해 속도를 조절하고 세포 침투를 위한 기공성을 최적화하는 방법을 제시합니다.안녕하세요, 저는 펜실베이니아 대학교 바이오공학과 Jason Burdick 교수님 연구실의 Jamie Kovi입니다. 안녕하세요, 저 또한 Burdick 연구실의 Harini Swin입니다. 오늘은 조직 공학을 위한 전기 방사 섬유 지지체 제작 절차를 보여드리겠습니다.또한 광패턴화(photo patterning) 및 다중 폴리머 스캐폴드 형성의 추가적인 가공 기능에 대해 소개하겠습니다. 저희 실험실에서는 히알루론산 스캐폴드 내에서 HMSE 세포의 상호작용과 침투를 연구하기 위해 이러한 절차를 사용합니다. 또한, 반월판이나 심근과 같은 섬유 강화 조직을 연구하기 위해 다양한 다른 폴리머에 이 기술들을 적용하고 있습니다.그럼 시작하겠습니다. 광개시제 0.5% 중량 용액을 준비하십시오. Irgacure 2959(또는 I 2959)를 탈이온수에 넣고 37°C에서 수일 동안 용해시켜 제조합니다.전기방사(electro spinning)를 위해 광반응성 폴리머가 필요한 경우 I cure를 사용합니다. 탈이온수 내 최종 농도가 2%weight 메틸화 히알루론산(methylated hyaluronic acid) 또는 MEHA, 3%weight 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide) 또는 PEO, 그리고 0.05%weight I 2 9 5 9 용액이 되도록 혼합하여 전기방사 용액을 준비하며, 5분 동안 볼텍싱(vortex)한 후 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 용액을 용해시키기 위해, 용액을 시린지에 옮기고 끝부분에 18게이지, 6인치 길이의 뭉툭한 바늘(blunt end needle)을 부착합니다.다음으로, 시린지 펌프를 사용하여 토출 속도를 1.2 milliliters per hour로 설정합니다. 시린지 엔진 바늘을 시린지 펌프에 삽입합니다. 고전압 전원의 접지 리드를 수집 장치에 연결합니다.본 절차에서는 약 10 meters per second의 속도로 회전하는 맨드릴을 사용합니다. 정렬된 섬유를 수집하려면, 양극 리드를 바늘에 연결하고 바늘과 수집 장치 사이의 거리가 15 centimeter가 되도록 조정하십시오. 시린지 펌프의 유량을 시작하고 바늘 끝에 유체가 보이면, 전원을 켜고 전압을 22 kilovolts로 설정하십시오.원하는 두께에 도달할 때까지 스캐폴드 위에 섬유를 수집합니다. 수집 시간은 원하는 두께와 사용된 전기방사 용액의 부피에 따라 달라집니다. 광패턴 형성(photo patterning)을 위해, 본 연구에서는 16시간 동안 전기방사한 매트를 사용합니다.수집이 완료되면 수집 장치에서 스캐폴드를 제거하고, 용매를 완전히 제거하기 위해 하룻밤 동안 진공 상태로 보관하십시오. 가위로 스캐폴드 매트에서 5 mm × 5 mm 크기의 샘플을 잘라냅니다. 각 스캐폴드를 호일로 덮인 유리 슬라이드 위에 올려 가교 결합을 준비하고, 스캐폴드 위에 포토마스크를 직접 올린 후 깨끗한 유리 슬라이드로 덮고 바인더 클립으로 슬라이드의 양끝을 고정합니다.질소 챔버를 사용하여 스캐폴드를 퍼지함으로써 산소 노출로 인한 가교 결합의 감소를 억제합니다. 스캐폴드 설정을 콜레이팅 어댑터와 함께 약 10 milliwatts per centimeter square 365 nanometer 광원이 있는 질소 챔버 내에 5분 동안 둡니다. 각 스캐폴드를 꺼내어 12웰 조직 배양 플레이트에 옮깁니다.각 웰에 탈이온수 2 mL를 넣습니다. 물의 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하고 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 8시간마다 진공 피펫을 사용하여 웰 내의 탈이온수를 흡입해 제거하고 새로운 물로 교체합니다.핫플레이트에서 90% ethanol에 PEO를 5%weight 용액으로 준비합니다. 실험 절차 시작 전, 50 °C에서 700 RPM으로 최소 2시간 동안 교반합니다. 교반 후, 최종 농도가 10 µg/mL가 되도록 DPI를 첨가합니다.PEO 및 DPI 용액을 3 mL 주사기에 옮기고, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감쌉니다. 다음으로, 두 번째 섹션에서 설명한 전기 방사 용액을 준비하고, 최종 농도가 25 µM이 되도록 methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B를 마이크로 파이펫으로 3 mL 주사기에 첨가합니다. 그리고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감쌉니다.스코치테이프를 사용하여 22 millimeter by 22 millimeter 크기의 메틸화 유리 커버슬립의 가장자리를 맨드릴 표면에 고정하여, 커버슬립이 맨드릴의 둘레에 맞게 배치되도록 합니다. 5 millimeter 길이의 실리콘 튜브를 사용하여 한쪽 끝을 루어락(lure lock) 커넥터가 있는 주사기 중 하나에 연결합니다. 반대쪽 끝은 바늘에 연결하고, 주사기를 주사기 펌프에 삽입한 뒤 바늘을 팬의 구멍에 통과시킵니다.패너(fanner)는 맨드릴의 길이를 따라 이동하며, 결과물인 스캐폴드 내에서 두 폴리머가 균일하게 분포되도록 하는 역할을 합니다. MEHA가 담긴 시린지의 바늘 끝이 맨드릴의 중심에 위치하도록 확인하십시오. 바늘 끝을 맨드릴로부터 15 cm 거리에 배치하고, 패너를 바늘 끝으로부터 6 cm 거리에 설정하십시오.시린지 펌프가 시간당 1.2 milliliters를 주입하도록 설정하고 전원 공급 장치를 22 kilovolts로 맞춥니다. PEO가 담긴 시린지도 동일한 방식으로 설치하되, 바늘 끝의 위치를 맨드릴로부터 10 centimeters 거리에 두고 전원 공급 장치를 15 kilovolts로 설정합니다. 그 다음, 조명을 끄고 맨드릴과 시린지 펌프를 작동시킵니다.두 바늘의 끝에 액체가 보이면 주사기에서 알루미늄 호일을 제거하십시오. 수집이 완료되면 전원 공급 장치를 켜고 동시에 팬을 연결하십시오. 전원 공급 장치와 맨드렐의 전원을 끄고 팬의 플러그를 조심스럽게 뽑으십시오.면도날을 사용하여 커버슬립과 테이프를 제거합니다. 섬유는 루민(rumine) 및 dpi 필터가 장착된 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 전기방사 고분자가 부착된 각 커버슬립을 6웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.웰 플레이트의 스캐폴드를 2 mL의 PBS에 담가 하룻밤 동안 배양하여 용매와 오염 물질을 완전히 제거합니다. 24시간 후, 진공 흡입기로 웰 플레이트에서 PBS를 제거하고, 층류 후드(laminar flow hood) 내의 살균용 UV 램프 아래에서 30분 동안 스캐폴드를 둡니다. 멸균을 위해 표준 세포 배양을 수행하고, 원하는 세포 밀도로 농축된 세포 현탁액을 준비합니다.예를 들어, 22 by 22 millimeter 커버슬립 하나당 100 milliliters의 세포 현탁액을 사용합니다. 이를 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 배양합니다. 각각에 적절한 양의 세포 배양 배지를 추가합니다.스캐폴드를 다시 인큐베이터에 넣습니다. Invitrogen에서 판매하는 상용 live dead 키트를 사용하여 세포를 염색한 후, TRITC 및 FITC 필터가 장착된 형광 현미경을 통해 세포와 섬유를 관찰합니다. 접지된 평판 위에 수집된 스캐폴드에서는 기대한 대로 무작위로 분포된 섬유가 생성됩니다. 회전 맨드릴에 수집된 스캐폴드에서도 무작위로 분포된 섬유가 생성됩니다.스캐닝 전자 현미경(scanning electron microscopy)으로 관찰했을 때 정렬된 섬유를 생성하기 위해, 스캐퍼폴을 탈이온수와 비반응성 ha에 침지시킨 후 스캐퍼폴과 광원 사이에 포토마스크를 배치하여 광가교를 진행합니다. 빛이 차단된 영역의 PEO는 제거되며, 형광 염료를 통해 확인할 수 있듯이 거대기공이 형성되는 것을 볼 수 있습니다. MEHA와 PEO 제트를 동시에 전기방사하면 각각의 폴리머로 구성된 뚜렷한 섬유 집단들을 포함하는 복합 스캐퍼폴이 생성됩니다.HMC는 섬유와 긍정적으로 상호작용하는 것으로 보입니다. 녹색 염색으로 확인되듯 세포의 생존력이 유지될 뿐만 아니라, 빨간색 섬유를 따라 정렬되도록 방향을 잡는 것으로 보입니다. 지금까지 조직 공학을 위한 섬유 지지체를 전기 방사하는 방법을 살펴보았습니다.또한 광 패턴 형성 및 다중 고분자 전기 방사와 같은 추가 기능을 도입했습니다. 이 절차를 수행할 때, 추가 실험을 시도하기 전에 균일한 섬유를 형성하도록 각 고분자의 전기 방사 파라미터를 최적화하는 것이 중요합니다. 이상으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

정렬 electrospun 섬유는 체외에서 뉴런의 성장을 직접 신경 재생 공사장 공중 발판의 잠재적인 구성 요소입니다. 우리는 electrospun 섬유 기판 및 기본 쥐 E15 감각 (DRG)와 모터 뉴런의 혈청이없는 문화를 준비 절차를 설명합니다. immunocytochemistry에 의해 뉴런의 시각화도 포함되어 있습니다.

차 모터 및 Electrospun 폴리 - L - lactide Nanofiber 공사장 공중 발판을에 정의된 미디어 감각 뉴런의 문화

Electrospun의 공사장 공중 발판은 조직 공학 응용 프로그램을위한 포스트 프로덕션을 처리할 수 있습니다. 여기 불임 (무균 생산 또는 멸균 포스트 생산)을 달성하기 위해하고 적절한 biomechanical 속성을 달성위한 두꺼운 공사장 공중 발판을 (멀티 layering이 열을 사용하거나 증기가 풀림으로) 제작을 위해, 복잡한 공사장 공중 발판을 (연속 회전으로) 회전하는 방법을 설명합니다.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

이 프로토콜은 전기 방사와 마이크로 스피어를 결합하여 뉴런을 지시하는 조직 공학 골격을 개발합니다. 신경 성장 인자는 PLGA 미세구 내에 캡슐화되어 히알루론산(HA) 섬유 골격으로 전기 방사되었습니다.  단백질 생체 활성은 기본 병아리 Dorsal Root Ganglia를 골격에 파종하고 4-6일 동안 배양하여 테스트했습니다.

섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

폴리 (글리세롤 도데)라는 이름의 새로운 생분해 성 고분자에서 새로운 디자인의 컬렉터를 통해 더 큰 예금 영역에 걸쳐 전기 방사 장 섬유 (PGD)의 합성 및 제조가보고되었다. 마우스 섬유는 다 능성 줄기 세포로부터 유도 된 세포의 성장을지지 할 수 있었다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 조직 공학을위한 폴리의 전기 방사 섬유 발판 (글리세롤 dodecanedioate)

여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.

섬유 조직의 그라데이션으로 전기 방사 나노 섬유 공사장 공중 발판

생체 재료 기술의 발전으로 3차원 다세포 유형의 구조를 개발할 수 있게 되었습니다. 우리는 기도의 주요 구조 세포를 배양하기 위해 3개의 개별 골격을 생산하여 기도 세기관지 벽의 3D 체외 모델을 제공하는 전기 방사 프로토콜을 개발했습니다.

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델

이 프로토콜은 폴리머와 전기를 통해 건설 기계를 조작 하는 포괄적인 지침 직접 쓰기 모드에 녹아 있습니다. 우리는 체계적으로 과정을 약술 하 고 타겟된 비 계 구조를 달성 하기 위한 적절 한 매개 변수 설정 정의.

조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

이 문서에서는 덜한 CO2 의 depressurization 통해 3 차원 (3D) 비 계에 전통, 2 차원 (2D) electrospun nanofiber 매트를 확장 하는 기술을 보여 줍니다. 이러한 증강된 건설 기계는 3D, 밀접 하 게 모방 세포 nanotopographic 신호, 고는 nanofibers 캡슐화 하는 생물 학적 분자의 기능을 보존 한다.

건설 기계 3-차원으로 2 차원 Electrospun Nanofiber 매트의 확장

조직 공학 실험 접근법

배우세요 조직 공학을 위한 전기방사법으로 광반응성 하이알루론산 섬유 스캐폴드를 제작하는 방법을. 광패턴화와 다중중합체 스캐폴드 형성 기술을 통해 세포 침투 및 조직 분포를 향상시킬 수 있습니다.

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

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