Name: 의 분리 및 정제 Drosophila 주변 뉴런 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 배우세요 Drosophila 말단 뉴런을 자기 비드 정렬로 분리 및 정제하는 방법을. CD8-GFP 융합 단백질을 표현하는 뉴런을 항체 코팅 자기 비드로 선택적으로 결합시켜 고순도 세포 집단을 얻습니다.

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우리는 DRS 감사합니다. Yuh - Nung 본 연구에 사용된 비행 주식을 제공하고 월 웨스 Grueber. 저자 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념이 연구의 지원 트러스트 (DNC)와 조지 메이슨 대학 프로보츠 사무소 (EPRI)을 인정합니다.

Drosophila 주변의 뉴런의 마그네틱 비드 정렬에 대한 일반 댓글 (의정서의 완료에 대한 총 타이밍 : 2.5-3 시간) 깨끗하고 RNAse 무료로 환경을 유지하기위한 표준 실험실 절차 RNA 저하를 방지하기 위해 항상 준수해야합니다. Drosophila 애벌레의 표피가 해부 및 세포 분리 버퍼에 배치되면, 주변 신경은 표피에서 분리 마지막 셀 중 하나입니다. 우리는이 속성을 악용 등 근육 사전 검사의 뉴런을 분리하기 위해 지방으로 표피의 불특정 세포의 대부분을 제거하는이 프로토콜을 설계했습니다. 연습, 전체 프로토콜은 성공적으로 약 2.5 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 실험이 시작되기 전에 항체 코팅 구슬의 준비는 완료해야합니다. 1. 바인딩 전지 자기 비즈 준비 : 이 단계는 이전 실험의 시작을 완료해야합니다. 준비 구슬이 필요 ° C까지 4 준비하고 저장할 수 있습니다. <ol><li> 신선한 PBS 500 μl에 resuspending하고 강력한 자장의 각 시간을 pelleting하여 Dynabeads M - 280 Streptavidin 코팅 구슬 PBS로 세 번 100 μl 씻으십시오. </li><li> 마지막 undiluted biotinylated 쥐 방지 마우스 CD8a 항체 (항체 농도가 100 μg / ML)을 100 μl에서 직접 구슬을 resuspend. </li><li> 침전을 방지하기 위해 가끔 약한 vortexing 얼음 1 시간 동안 혼합물을 품어. [Dynabeads M - 280 1 μl는 biotinylated 항체의 0.05-0.10 μg을 바인딩할 수 있습니다]. </li><li> 비드 - 항체 혼합물에게 같은 여분의 항체를 제거하는 단계 1.1에서 설명한 세 번 씻으십시오. 자석 구슬은 지금 항체로 코팅하여 사용 준비가 된 것입니다. 4 1X PBS 100 μl의 비드 - 항체 혼합물을 저장 ° C를 사용까지. </li></ol> 2. (10-15분) : 애벌레를 선택하고 워싱 <ol><li> 30-50 세 일치 셋째 instar의 애벌레를 선택하고 1X 인산의 1-1.2 ML과 1.6ml microfuge 튜브에서 그들을 장소 살린 (PBS)를 버퍼. (3~5분) </li><li> 각 일초에 대한 관 및 최대 설정에 소용돌이를 세 번 닫습니다. </li><li> 불타는 광택 파스퇴르 피펫을 사용하면 완전히 뜨는 폐기하십시오. 세차 (2.1)을 반복하고 뜨는 어떤 음식 입자와 파편의 가시 명확 때까지 와동 (2.2) 3-4 회 단계를 반복합니다. </li><li> 간단히 70 % 에탄올 1 ML로 세척을 반복하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> ddH2O 1 ML과 함께 두 번 애벌레를 세척하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 간단히 RNase - 어웨이 1 ML과 함께 다시 한번 세척을 반복하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> RNase 작별의 완전한 제거를 위해 ddH2O 1 ML에있는 애벌레 세 번 씻으십시오. </li></ol> 3. 해부 : (10-12분) <ol><li> Sylgard 코팅 35mm 페트리 접시의 중앙에 자리 10-12 애벌레. 조금씩 서로 떨어져 그들을 놓습니다. [중요 단계 : 적절한 발달 단계에되지 않는 것 같습니다 어떤 애벌레를 삭제] </li><li> 모든 애벌레에 대한 미세 해부 가위의 쌍을 사용하여 애벌레의 앞쪽에 팁을 오픈 했네요. </li><li> 애벌레 내부 아웃 반전 재미 더몬트 제 5 포셉 한 켤레를 사용합니다. 애벌레 표피 안쪽 뒷부분 끝까지 하나 forcep를 삽입합니다. 표피 (그림 1A) (쉽게 만들기 위해 Sylgard 표면에 표피를 눌러보십시오)의 뒷부분 끝을 잡고 함께 포셉의 팁을 핀치. 포셉의 두 번째 쌍을 사용하여 밖으로 내부의 애벌레 표피 밀어. [중요 단계 : 세포 분리 실험을 시도하기 전에이 방법을 몇 번 연습하십시오. 모든 부드러운 조직이 쉽게 분리를위한 솔루션에 노출되는 것을 보장하기 위해, 완전히 거꾸로 애벌레를보십시오.] </li><li> 3-4 유충을 해부하면, 1.6 ML의 microfuge 관에 신선하고 차가운 PBS (얼음 튜브를 삽입)로 즉시 전송합니다. </li><li> 필요한 모든 애벌레가 (이 프로토콜 30-40 애벌레) 수집되기 전까지는 3.4 단계 3.1 반복합니다. [중요 단계 :. 10~20%의 해부와 분리하는 동안 손실과 계획을 예측 따라] </li></ol> 4. 느슨하게 자기편 아닌 특정 세포의 제거 : (2-3 분) [이 단계는 지방 기관 및 CNS로 느슨하게 자기편 아닌 특정 조직의 비운을 에이즈.] <ol><li> 거꾸로 애벌레 발톱 뿌리의 엷은 피부를 포함하는 1.6 ML의 microfuge 튜브를 타고 신선한 얼음처럼 차가운 PBS의 약 700-800 μl로 뜨는 교체하십시오. </li><li> 펄스 - 와동 microfuge 튜브 최고 속도에서 5 회 (펄스 당 3 초). </li><li> 뜨는을 취소하고 약 700-800 μl 신선하고 차가운 PBS로 바꾸십시오. </li><li> 단계 4.2 4.3 세 번 반복합니다. </li><li> 레스신선하고 차가운 PBS 400 μl의 애벌레 손톱을 uspend </li></ol> 5. 단일 세포 현탁액에 조직을 Dissociating (18~20분) [중요 단계 : 이상 - 해리는 가난한 세포 수율과 낮은 세포 생존에 선도적인 세포 표면 마커의 손실이 발생할 수 있습니다. 애벌레 조직도 기계적 해리 (sonication, douncing), 효소 분해 (트립신, collagenase 등) 또는이 둘의 조합으로 dissociated 수 있습니다. 이 애벌레 조직이 분열시키다하기가 어렵습니다, 우리는 모두 기계 및 효소 분해의 조합은 최상의 결과를 굴복 것으로 나타났습니다.] <ol><li> PBS 400 μl의 중단 애벌레 표피에 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch 단위 / 유리병) 1.5 μl를 추가합니다. </li><li> 최대 설정 (이것은 솔루션에 표피에서 느슨하게 자기편 세포를 제거한다) 각 일초에 대한 소용돌이 솔루션에게 2-3 번. </li><li> 5 분 실내 온도 (22-25 ° C)에서 솔루션을 품어. [중요 단계 : 부화 시간이 크게 최종 셀 정렬의 효율성에 영향을 미칩니다. 권장 부화 시간은 조직을 느슨해진 충분한해야합니다. 15 분 초과하지 마십시오.] </li><li> 펄스 - 와동 튜브 전속력으로 펄스 당 2 초 최대 설정에서 20-30 시간. 이것은 솔루션에 근육과 다른 조직을 출시한다. 각 단계에서 스테레오 현미경 형광 아래의 솔루션의 작은 샘플을 검사합니다. (경험을 가진 사람이 직접 형광 활성화된 스테레오 현미경 microfuge 관을 관찰하여 분리 수준을 확인할 수 있어야합니다) </li><li> 신선하고 차가운 PBS로 애벌레의 발톱 뿌리의 엷은 피부에게 2-3 번 씻고 마지막 신선한 얼음처럼 차가운 PBS가 포함된 1 % BSA 500 μl 그들을 resuspend. </li><li> 2 ML의 Kontes 조직 분쇄기, 대형 통관 유봉, 사전 코트 조직 분쇄기 및 PBS 용액에 1 % BSA와 BSA의 솔루션을 폐기 린스 간단한 이후 유봉의 유리 표면에 고집 애벌레 표피를 피하려면. 그 후, 불을 광택 파스퇴르 피펫 사용하여 BSA - 코팅 조직 분쇄기 단계로 5.5에서 손톱을 전송. [중요 단계 : 세포 손상 / 용해를 방지하기 위해 몇 분 동안 얼음에 배치하여 사전 멋진 조직 분쇄기 / 유봉]. </li><li> (약 20-30 치기) 얼굴이 볼만을 피하고, 천천히 그리고 계속해서 함께 조직을 다운스. [중요 단계 :. 천천히 그리고 꾸준히 다운스, 그렇지 않으면 세포가 lyse 수 있습니다] </li><li> 세포 분리 수준을 평가하기 위해, 깨끗한 Kimwipe 조직과 조직 분쇄기의 외벽을 닦아, 그리고 스테레오 현미경 형광 하에서 그것을 검사합니다. 뉴런은 표피에서 분리해야하고, 솔루션에 볼 수 있습니다. 이것이 어려운 것으로 판명될 경우, 또는 솔루션의 작은 샘플을 피펫, 그리고 스테레오 현미경 형광 하에서 그것을 관찰합니다. 세포 분리의 좋은 표시는 애벌레 표피에서 뉴런의 부재입니다. 하나는 아직 표피에 연결된 뉴런을 관찰하거나, 불완전하게 dissociated 세포를 관찰하면 세포가 하나의 세포 현탁액을 달성 때까지 그러나, 더 다운스. </li><li> 불타는 광택 파스퇴르 피펫으로 용액, 5 번 씹다가 불을 광택 파스퇴르 피펫 10 배 표준 팁 직경의 약 25 % 줄여주 다음, 표준 팁 직경의 약 50 % 좁게. [중요 단계 : 강력 분쇄는 세포가 손상될 수 있습니다. 단계 사이의 세포를 모니터하고 그에 따라 절차를 조정]. </li><li> 30 μm의 셀 필터를 통해 솔루션을 필터와 1.6 ML의 microfuge 튜브에 세포 여과물를 수집합니다. 그 결과 솔루션은 단일 세포 현탁액으로 이루어져 지금은 자기 세포 분류를위한 준비해야합니다. </li></ol> 6. 마그네틱 비드 셀 정렬 (45-75분, 항체 배양 시간에 따라 다름) <ol><li> 세포 현탁액 500 μl (5.10 단계)에 항체 코팅 자기 구슬 15 μl를 추가합니다. 이후 셀 isolations에 필요한 때까지 나머지 항체 복합 자석 구슬을 저장할 수 있습니다. </li><li> 가끔 손으로 믹싱과 얼음 30-60분에 대한 항체 코팅 자석 구슬로 세포를 품어. [중요 단계 : 부화 높은 온도 또는 긴 시간에서가 아닌 특정 항체 바인딩이 발생할 수 있습니다.] </li><li> 이분의 강력한 자장에 microfuge 튜브를 놓습니다. 언바운드 비즈와 함께 모든 긍정적으로 선택한 세포는 튜브의 측면으로 구분됩니다. </li><li> 천천히 세포 펠렛을 방해하지 않도록하고, 표면에 뜨는를 피펫. </li><li> 남아있는 불특정 세포를 제거하는 신선하고 차가운 PBS에 세포에게 3-4 회 씻으십시오. </li><li> 신선하고 차가운 PBS의 30 μl의 세포를 Resuspend. </li><li> 대략 순결과 세포의 항복하려면 셀 susp의 피펫 5 μlhemocytometer의 광택 표면에 ension 및 스테레오 - 현미경 형광의 모든 보이는 형광 세포를 계산합니다. 또한 비 형광 세포와 불순물의 흔적 금액을 확인합니다. 일반적으로 샘플은 높은 형광 세포에 대한 풍부합니다. </li></ol> 7. 마그네틱 비드 정렬 세포로부터 RNA 분리 : (60-75분) <ol><li> , 펠렛에게 자기 분야에서 세포를 계산 후, 표면에 뜨는를 버리고 PicoPure ™ RNA 격리 키트 (분자 장치)에서 추출 버퍼 20 μl를 추가합니다. 휴대폰 번호에 따라 하나 추출 버퍼의 높은 볼륨을 추가해야 할 수도 있습니다. </li><li> 소용돌이 최대 속도에서 튜브 추출 버퍼와 세포 펠렛의 혼합을 사​​용합니다. </li><li> 30 분 42 ° C에서 튜브를 품어. </li><li> 이전 RNA의 열 정화 (단계 7.5 참조) 자기 구슬의 제거를 보장하기 위해 튜브를 간단히 펠렛 2 분 자성 비즈 2,000 (X) g에 centrifuged입니다. 튜브는 다음 펠렛을 유지하는 강한 자장에 배치하고, 뜨는은 새로운 microfuge 튜브로 전송됩니다. </li><li> 추출 및 열 PicoPure RNA 추출 키트 제조 업체의 지침에 따라 RNA 정화. DNAse 치료는 선택 사항이며, 분석 요구에 따라 RNA 정화 동안 열을 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 사용을위한 준비까지 -80에서 용출 버퍼와 저장 ° C의 작은 볼륨 (11-30 μl)에서 바운드 총 RNA를 elute. 원하는 경우 1 μl 나누어지는는 Bioanalyzer 2100 (애질런트 테크놀로지 주식 회사)에서 총 RNA의 품질을 평가하기 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 : 마그네틱 비드 정렬은 Drosophila 다 신경을 (그림 1) 분리하기 위해 사용되었다. 이러한 절연 다의 뉴런 (그림 2A)에서 정화 RNA는 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사)에서 분석하면 날카로운 5.8S, 18S 및 28S ribosomal RNA의 봉우리의 존재로 표시로서 우수한 품질의 것을 알았습니다 ( 그림 2B). 30-40 셋째 instar의 애벌레부터 우리는을 사용하여 평균 PPK - GAL4 드라이버를 사용하여 300-500 클래스 IV DA의 뉴런과 뉴런의 1500년에서 2000년까지 DA (클래스 I, II, III 및 IV)에 분리 수 있었다 냄비를 DA 뉴런 특정 GAL4 21-7 드라이버. 우리 고립된 세포의 연결을 특정 농축을 평가하기 위해 두 가지의 연결을 유전자 특정 마커를 (elav 및 futsch)을 사용하여 정량 반대 전사 PCR (qRT - PCR)을 수행. 이러한 분석은 우리의 프로토콜 (그림 3)를 사용을 통해 흐름에 비해 검찰의 뉴런에 매우 구체적인 농축을 나타내는 마커 유전자 모두의 중요한 배 농축을 공개했다. 마지막으로, 팬 - DA의 뉴런과 클래스 IV DA의 뉴런 모두에서 분리된 RNA는 애질런트 Drosophila melanogaster 전체 - 게놈 oligo의 microarrays (4 X 44K) (그림 4)에 transcriptional 표현 프로 파일링을 수행하는 데 사용되었다. 이러한 분석은 이전에 uncharacterized 분자 잠재적 DA 신경 세포 개발에 중요한 기능 역할을 putative 신호 전달 경로의 광범위한 스펙트럼 이외에 다 신경 세포 dendrite의 morphogenesis 수많은 이전에 연루 규제를 발견. DA 뉴런의 개발, 특히 dendrite morphogenesis을 중재에 이러한 이전 uncharacterized 분자의 잠재적인 역할 (들)을 평가하기위한 연구가 현재 진행되고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> 그림 1 :. DA 뉴런 특정 GAL4 베어링 Drosophila 검찰의 뉴런의 자성 비드 분류의 도식 (A) 연령 일치 셋째 instar의 애벌레, UAS - mCD8 - GFP 기자 transgene은 반전 애벌레 표피 안에 아웃을 폭로하여 해부 아르 분리 버퍼 PNS는 얼음처럼 차가운 PBS에 저장됩니다. (B) 효소 분리가 애벌레 표피를 포함하는 솔루션에 Liberase Blendzyme 3 추가하여 수행됩니다. (C) 애벌레 조직은 vortexing, 가루약의 조합에 의해 더 dissociated하고 douncing 같은 지방 단체, 창자 및 CNS. (D, E) 세포 다음 30 μm의 세포 필터를 사용하여 필터링됩니다 아닌 구체적으로 표시된 조직을 제거합니다. 이 솔루션은 상피 조직, 근육 및 신경을 포함한 다양한 세포 유형의 단일 세포 현탁액이 포함되어 있습니다. (F) 안티 마우스 CD8a - 항체 코팅 Dynabeads M - 280이 세포 현탁액에 추가하고, 30~60분 위해 얼음 incubated 수 있습니다. ( g) 자기 구슬이 GFP 융합 단백질. (H, I) 마그네틱 비드 코팅 세포는 강한 자장에 솔루션을 배치로 구분됩니다 태그를 마우스 CD8을 표현하는 검찰의 뉴런에 바인딩합니다. 뜨는은 무시되고 전지 (J) H의 결과, 잔여 불특정 세포를 제거하는 세 번 씻어 아르ighly 뭐냐 뉴런의 인구를 정​​화. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> 그림 2 : 세포 분리 및 마그네틱 비드별로 정렬 절연 긍정적으로 선정, GFP 형광 클래스 IV DA의 뉴런의 (A) 대표 이미지. 뉴런의 결과로 인구가 매우 거의 또는 전혀 오염 세포 불순물이 클래스 IV DA의 뉴런에 풍부하게하는 결정되었습니다. (B) 총 RNA의 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사) electropherogram 자석 비드 정렬 검찰의 뉴런으로부터 격리 같은 5.8S, 18S, 28S 및 rRNAs의 존재로 표시 뛰어난 총 RNA의 품질을 보여주는. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> 그림 3 : 격리 다 뉴런 (GAL421 - 7, UAS - mCD8 - GFP)과 분수를 통해 흐름이 세중의에서 수행된에의 연결 마커 유전자 발현의 qRT - PCR 분석. 두의 연결을 특정 마커 유전자 (elav 및 futsch)의 표현 수준은 qRT - PCR에 의해 평가되었다. 이러한 분석에서 얻은 값은 내생 컨트롤 (rp49)에 정규화되었으며, 분수를 통해 흐름 관찰들에게 상대적인 수준은 ΔΔCτ 방법 6을 사용 계산되었습니다. 분획을 통해 흐름에 비해 elav과 futsch 모두 상당히 고립 DA 뉴런의 인구 풍부하게했다. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> 그림 4 : microarray 이미지 파일 레이블 대표 클래스 - IV DA 뉴런 특정 Cy3. 마그네틱 비드 정렬하여 정화 클래스 IV DA의 뉴런으로부터 격리 Cy3 - labeld 총 RNA와 hybridized 애질런트 Drosophila melanogaster 전체 - 게놈 oligo microarray (4 X 44K)입니다 여기에 표시됩니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">여기를 클릭</a> 그림 4의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
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<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

여기에 제시 프로토콜은 자기 비드 셀 정렬 전략을 사용하여 Drosophila 셋째 instar 애벌레의 표피의 내부 표면에 단단히 고수 주변 뉴런의 분리 및 정제에 최적입니다. 우리가 구체적으로 애벌레 또는 개발의 pupal 단계에있는 표피에 맞게 다른 세포 유형의 고립이 프로토콜의 Drosophila 뭐냐 뉴런, 응용 프로그램을 분리하기 위해이 프로토콜을 사용하는 동안 (예 : 상피 조직, 근육, 기타 말초 신경)에 적용할 수 있습니다 세포 유형이나 관심의 종류를 분류 UAS - mCD8 - GFP의 기자 transgenes는 몇 가지 매개 변수를 변화 독특한 GAL4를 사용합니다. 또한,이 프로토콜은 관심사의 유전자가 하나 직접하는 GAL4 transgene와 결합 수있는 UAS - mCD8 - GFP의 transgene에 복제됩니다 손실의 기능과 이득의 기능의 접근법 모두에서 사용할 수있는 유전자를 구체적인 손실의 기능 (예 : UA...

장비 <ul><li> 또는 ™ -2 DynaMag (10) 네오디뮴 자석 블록 (K &amp; J 자기학, 주식, 고양이. # B444B), (Invitrogen, 고양이를. # 123 - 21D)를 사용할 수 있습니다. </li><li> 대형 통관 유봉과 함께 Kontes 유리 조직 그라인더, 2 ML 작업 능력 (Cat. # 885300-0002) </li><li> 세포 필터 예 맥 사전 분리 필터 (Miltenyi Biotec, 고양이. # 130-041-407) </li><li> 35mm 배양 - 요리 Sylgard (다우 코닝 주식 회사, 고양이. # 3097358-1004)로 코팅 </li><li> 해부 도구 : 더몬트 제 5 포셉 두 쌍 (파인 과학 도구, 고양이 # 11251-20). </li><li> Vannas 봄 마이크로 해부 가위 (파인 과학 도구, 고양이. # 15000-08) </li><li> 일회용 팁을 Pipettes (P - 1000, P - 100, P - 10) </li><li> 셀 및 견적 순도를 계산하는 표준 hemocytometer </li><li> 표준 직경 화재 광택 팁을 파스퇴르 pipettes은 표준 직경 ~ 50 % 범위를 압축 및 분쇄를위한 표준 직경 ~ 25 % 줄여주 </li><li> 테이블 상단 마이크로 원심 분리기 (1-16,000 (X) G) </li><li> 와동 </li><li> 형광등 스테레오 현미경 (Leica MZ16FA이 프로토콜에 사용되었습니다) </li></ul>

의 분리 및 정제 drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

<em&gt; Drosophila</em&gt; 주변 신경계 (PNS)는 기능과 분자 수준에서의 연결을 개발 및 dendrite의 morphogenesis의 복잡한 프로세스를 조사위한 강력한 모델입니다. 이러한 분석에 도움이하기 위해, 우리는 PNS의 신경의 하위 클래스의 고립을위한 전략 돌기 arborization (DA) 널리 dendrite morphogenesis을 공부에 사용되었습니다 뉴런이라는 개발<sup&gt; 1,2</sup&gt;. 이들 뉴런은 힘든 chitinous 애벌레 표피 아래에 위치를 도달하기 어려운 매우 순수 인구로 분리하기 어려운 그들의 매우 낮은 발생하는 부분 때문에 그들입니다. 우리의 새로 개발된 방법은 이러한 문제를 극복하고, 항체 - 코팅 자기 구슬을 사용하여 신속하고 특정 세포 강화에 따라 달라집니다. 우리 자기 비드 정렬 연구, 우리는 마우스 CD8 태그 GFP 융합 단백질을 (표현 나이에 일치하는 세번째 instar의 애벌레를 사용한<em&gt; UAS - mCD8 - GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; 클래스 IV의 돌기의 arborization 하나의 제어하에 (DA) 신경 세포 특정<em&gt; 소매치기 (PPK) GAL4</em&gt; 드라이버<sup&gt; 4</sup&gt; 또는 팬 - DA 뉴런 특정 GAL4의 통제<sup&gt; 21-7</sup&gt; 드라이버<sup&gt; 5</sup&gt;. 이 프로토콜은 몇 가지 매개 변수를 변화하여 애벌레 표피의 내부 벽에 연결된 PNS 세포를 분리에 최적화된되어 있지만, 같은 프로토콜의 애벌레 또는 pupal 단계에서 표피에 부착된 여러 세포 유형을 분리하는 데 사용될 수 개발 (예 : 상피 조직, 근육, oenocytes 등), 또는 GAL4 특정 드라이버 표현 패턴에 따라 애벌레 기관에서 다른 세포 유형. 이 방법에 의해 분리된 RNA는 높은 품질이며 쉽게 이러한 microarray 유전자 발현 프로 파일링 연구로 하류 게놈 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 격리에 대한 연구를 수행하는 강력한 새로운 도구를 제공합니다<em&gt; Drosophila</em따라서 dendrite morphogenesis를 기본 분자 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공&gt; 돌기 arborization (DA) 뉴런.

이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을 제시<em&gt; Drosophila</em빠른 자석 구슬 도움 셀 정렬 전략을 사용하기&gt; 주변 뉴런. 분리된 세포에서 얻은 RNA는 쉽게 microarray 분석을 포함하여 하류 어플 리케이션에 사용할 수 있습니다.

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

초파리(Drosophila)의 말초신경계(PNS)는 신경세포 발달 및 수지상 돌기(dendrite)의 복잡한 과정을 연구하는 데 매우 유용한 모델입니다...

뉴런 특이적 CD8 GFP 융합 리포터 트랜스진을 보유한 초파리 유충을 사용하여 DA 뉴런을 분리합니다. 유충의 큐티클을 뒤집어 말단 신경계를 노출시킴으로써 해부합니다. 뒤집힌 유충을 효소 처리로 해리시킨 후, 볼텍싱과 파이펫팅을 통한 기계적 해리를 수행합니다.그 다음 세포를 여과하여 주로 상피 근육과 뉴런을 포함하는 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 항체가 코팅된 자성 비드를 세포 현탁액에 첨가하면, CD eight 태그가 붙은 GFP 융합 단백질을 발현하는 뉴런에 비드가 결합합니다. 마지막으로, 용액을 강한 자기장 속에 놓아 자성 비드가 코팅된 뉴런을 분리함으로써 고순도의 뉴런 집단을 확보합니다.안녕하세요, 저는 조지 메이슨 대학교 Krasno 고등연구소 분자 및 미생물학과에서 온 Dan Cox입니다. 안녕하세요, 저는 Dan Cox 박사님 연구실의 Ish AER입니다. 오늘은 자기 비드 소팅을 이용한 DLO 말초 뉴런의 분리 및 정제 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 클래스 특이적 및 우측 형태 형성을 조절하는 분자적 기전을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 연령이 일치하는 3단계 유생 30~50마리를 선택하여 1X PBS 1~1.2 mL가 들어 있는 1.6 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.튜브를 닫고 최대 설정으로 1초씩 3회 볼텍싱합니다. 화염 멸균한 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거합니다. PBS 1 mL를 첨가하고, 상층액에서 음식물 입자와 부스러기가 더 이상 보이지 않을 때까지 세척 및 볼텍싱 단계를 3회 반복합니다.70% ethanol 1 mL로 가볍게 세척을 반복합니다. 그 다음, 2회 증류수 1 mL로 유충을 세척합니다. 마지막으로, RNAase-away 1 mL로 다시 한번 세척하고 증류수 1 mL로 3회 세척하여 RNAase-away를 완전히 제거합니다. 이제 유충을 해부할 준비가 되었습니다.실 가드(sill guard)가 코팅된 35 millimeter 페트리 접시 중앙에 유충 10~12마리를 놓습니다. 유충들이 서로 약간 떨어지도록 배치하고, 적절한 발달 단계에 있지 않은 것으로 보이는 유충은 폐기합니다. 다음으로, 미세 해부 가위와 뭉툭한 dumont 핀셋을 사용하여 유충의 앞쪽 끝부분을 절개합니다.다섯 번째로, 포셉입니다. 유충을 뒤집어 줍니다. 포셉 하나를 유충의 큐티클 내부로 넣어 후단까지 완전히 밀어 넣는 것으로 시작합니다.포셉 끝을 오므려 큐티클의 후단을 잡습니다. 큐티클을 실 가드(syl guard) 표면에 눌러 고정하면 작업이 더 수월해집니다. 두 번째 포셉을 사용하여 유충의 큐티클을 뒤집어 밖으로 밀어냅니다.용액 내에서 모든 연조직이 노출되어 세포 해리가 용이하도록 유충이 완전히 뒤집혔는지 확인하십시오. 세포 해리를 시도하기 전에 이 과정을 몇 번 연습하십시오. 3~4마리의 유충을 해부한 후, 즉시 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 신선하고 차가운 PBS로 옮기십시오.비특이적 세포를 제거하기 전에 필요한 30~40마리의 유충이 수집될 때까지 반복합니다. 모든 유충을 해부하는 과정에서 해부 및 결합 중 10~20%의 손실이 예상됨을 유념하십시오. 지방체 및 중추 신경계 세포와 같이 느슨하게 부착된 비특이적 조직을 제거합니다.뒤집힌 유충 큐티클이 들어 있는 튜브의 상층액을 700에서 800 µL의 신선하고 차가운 PBS로 교체하십시오. 마지막으로, 마이크로 튜브를 최대 속도로 한 번에 3초씩 5회 펄스 보텍싱하십시오.그 다음 상층액을 버리고 약 700에서 800 µL의 신선한 차가운 PBS로 교체합니다. 이 단계를 세 번 반복하고, 마지막으로 유충 큐티클을 400 µL의 신선한 얼음 위에서 현탁합니다.수지상 돌기 분지 또는 유충 뉴런을 분리하기 위해 세포를 해리시키기 전, 차가운 PBS를 사용하십시오. 효소적 해리와 기계적 해리를 병행하여 사용합니다. 과도한 해리는 세포 표면 마커의 손실을 유발하여 세포 회수율과 세포 생존율을 낮출 수 있으므로 주의하십시오.PBS 400 µL에 부유시킨 유충 큐티클에 28 units/vial 농도의 1x liase zyme three 1.5 µL를 첨가하여 해리를 시작합니다. 큐티클에서 느슨하게 부착된 세포들이 용액 속으로 떨어져 나오도록 최대 설정에서 1초씩 2~3회 볼텍싱합니다.그 후 용액을 상온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 시간은 최종 세포 분리 효율에 큰 영향을 미치므로, 배양 펄스 종료 시 15분을 초과하지 마십시오.튜브를 최대 속도로 2초씩 20~30회 펄스 형태로 볼텍싱합니다. 이렇게 하면 근육 및 기타 비특이적 조직이 용액으로 방출됩니다. 형광 스테레오 현미경으로 샘플을 주기적으로 관찰하여 주변 뉴런이 여전히 큐티클에 부착되어 있는지 확인하십시오.형광 기능을 갖춘 실체 현미경으로 마이크로 원심분리 튜브를 직접 관찰하여 용액의 소량 샘플을 검사함으로써 해리 수준을 확인합니다. 해리 과정의 각 단계에서 이 작업을 계속 수행하며, 주변 신경세포가 큐티클에서 용액으로 해리되기 시작하기 전에 볼텍싱을 중단하십시오. 1 mL씩의 신선한 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번에서 세 번 교체하여 유충 큐티클을 짧게 세척합니다.마지막으로, 재현탁합니다. 1% BSA가 포함된 500 µL의 신선하고 차가운 PBS에 부유시킵니다. 세포의 기계적 분리를 계속하기 위해 1% BSA-PBS 용액이 담긴 2 mL 용량의 조직 분쇄기(tissue grinder)와 넓은 간격의 페스틀(pestle)을 사용합니다. 잠시 헹군 후 BSA 용액을 제거합니다.이렇게 하면 유충 큐티클이 유리 표면에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 이어서 세포 손상이나 용해를 막기 위해 조직 분쇄기와 유발을 얼음 위에 몇 분 동안 두어 미리 냉각하십시오. 그런 다음 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐티클을 조직 분쇄기로 옮깁니다.이제 거품이 생기지 않도록 주의하며 약 20~30회 정도 천천히 그리고 일정하게 조직을 눌러줍니다. 반드시 천천히 일정하게 눌러야 합니다. 그렇지 않으면 세포가 파괴될 수 있습니다.세포 해리 수준을 평가하려면, 깨끗한 Kim wipe 티슈로 조직 분쇄기의 벽면을 닦아낸 후 형광 실체 현미경으로 관찰하십시오. 뉴런은 큐티클에서 분리되어 용액 속에서 관찰되어야 합니다. 세포 해리가 잘 되었는지 확인하는 좋은 척도는 유충 큐티클에 뉴런이 남아 있지 않은 상태입니다.하지만, 여전히 큐티클에 부착된 뉴런이 관찰되거나 완전히 해리되지 않은 세포가 보인다면, 세포가 단일 세포 현탁액 상태가 될 때까지 추가로 분해하십시오. 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 기계적 해리를 계속합니다. 표준 팁 직경의 약 50% 정도로 좁힌 피펫으로 용액을 5회 파이펫팅한 후, 다시 화염 연마된 파스퇴르 피펫으로 10회 반복하십시오.표준 팁 직경의 약 25% 수준으로 좁힙니다. 강한 회전은 세포를 손상시킬 수 있으므로 주의하십시오. 단계 사이에 세포 상태를 모니터링하고 그에 따라 절차를 조정하십시오.용액을 30 µm 셀 필터로 여과한 후, 세포 여과액을 1.6 mL 마이크로 퓨즈 튜브에 수집하여 마무리합니다. 결과 용액은 단일 세포 현탁액 상태여야 하며, 이제 자기 세포 분리(magnetic cell sorting)를 수행할 준비가 되었습니다. anti-CD8 항체가 코팅된 자기 비드.수반되는 서면 프로토콜에 설명된 대로 준비하였으며, DA 뉴런은 항체에 의해 표적되는 CD8-GFP 융합 단백질을 발현합니다. 500 µL의 세포 현탁액에 15 µL의 항체 코팅 자성 비드를 첨가하여 세포 분리를 시작하십시오. 항체 코팅 자성 비드와 함께 세포를 얼음 위에서 30~60분 동안 배양하며 가끔씩 손으로 혼합하십시오. 더 높은 온도에서 배양하거나 배양 시간을 늘리면 비특이적 항체 결합이 발생할 수 있습니다.다음으로 마이크로 튜브를 강한 자기장 속에 2분 동안 둡니다. 양성 선택된 모든 세포와 결합되지 않은 비드들이 튜브 벽면에 부착됩니다. 세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 천천히 흡입하여 제거하고, 신선한 얼음 냉각 PBS로 세포를 3~4회 세척합니다. 이 단계는 남아있는 비특이적 세포를 제거하는 과정입니다.마지막으로, 세포의 순도와 수득량을 추정하기 위해 신선하고 차가운 PBS 30 µL에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액 5 µL를 혈구계수기의 연마된 표면에 분주하고, 형광 입체 현미경 하에서 보이는 모든 형광 세포의 수를 셉니다. 또한, 비형광 세포의 양과 불순물의 징후가 있는지 확인합니다.일반적으로 샘플에는 형광 세포가 고도로 농축됩니다. 마지막으로, pico pure RNA isolation kit를 사용하여 비드에 결합된 세포로부터 RNA를 분리합니다. 분리된 세포에 추출 버퍼를 추가하되, 컬럼 정제 단계 이전에 자석을 사용하여 비드를 제거하십시오. 추출된 RNA 1 µL를 사용하여 Agilent Bioanalyzer 2100에서 총 RNA 품질을 평가합니다.분리된 DA 뉴런에서 정제된 RNA는 Agilent 2100 Bioanalyzer로 분석했을 때 5.8 s 및 28 s 리보솜 RNA 피크가 선명하게 나타나 매우 우수한 품질임을 확인할 수 있었습니다. 30~43일령의 star larvae에서 PPK gal four 드라이버를 사용하여 평균 300~500개의 4급 DA 뉴런을 분리할 수 있었으며, 1, 2, 3, 4급 DA 뉴런은 1500~2000개를 분리할 수 있었습니다. panda 뉴런 특이적 gal four 드라이버를 사용하고 뉴런 특이적 마커인 L 11 fch로 정량적 R-T-P-C-R을 수행한 결과, 두 마커 모두 유의미한 배수 농축이 확인되어 flow through와 비교했을 때 본 실험에서 제시한 프로토콜을 통해 DA 뉴런이 매우 특이적으로 농축되었음을 나타냈습니다. 최종적으로 panda 뉴런과 4급 DA 뉴런에서 분리한 RNA를 사용하여 Agilent Drosophila Melanogaster 전유전체 올리고 마이크로어레이로 전사체 발현 프로파일링을 수행하였으며, 이를 통해 DA 뉴런의 형태 형성과 관련된 많은 인자들을 식별하였습니다.본 영상에서는 3령 유충 발달 단계에서 자기 비드 분리법을 통해 초파리 말초 신경세포를 분리 및 정제하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 효소적 및 기계적 해리 단계의 균형을 맞추는 것이 중요합니다. 과도한 효소적 해리는 CD8 세포 표면 마커의 분해를 초래하여 세포 분리 효율이 떨어지거나 실패하는 원인이 될 수 있습니다.또한, 분리된 뉴런에서 정제된 RNA의 무결성을 유지하기 위해 전체 과정 동안 RNase-free 조건을 유지하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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이 비디오는 자기 세포 분류를 사용하여 마우스 뇌의 탈수초 병변에서 미세아교세포를 추출하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 미세아교세포를 포함하는 병변된 뇌 조직을 절개하고, 특정 효소로 조직을 처리하여 단세포 현탁액을 얻고, 미세아교세포 수용체 특이적 자기 비드를 사용하여 미세아교세포를 분리하는 것이 포함됩니다.

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting(자기 활성화 세포 분류를 사용한 마우스 뇌 탈수초 병변에서 미세아교세포 분리)

초파리의 조직은 종종 세포 유형의 이종 혼합물을 포함한다. 특정 조직으로부터 특정 세포 유형에서의 유전자 발현을 조사하기 위해, 핵 유전자 태그이어서 궁합 기반 접근 방식을 사용하여 단리 할 수​​있다. 격리 핵은 유전자 발현 분석 및 면역 침전과 같은 염색질 하류 애플리케이션에 사용될 수있다.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

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희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

장기 특이적 감각 뉴런은 식별하기 어렵습니다. Fast Blue 추적은 세포 분류를 위해 기도에 신경을 분포시키는 노도즈(nodose) 뉴런을 식별하는 데 사용됩니다. 분류된 노도즈(nodose) 뉴런은 염기서열분석을 위해 고품질 리보핵산(RNA)을 추출하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 기도 특이적 뉴런의 유전자 발현을 측정합니다.

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마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

여기, 우리 세포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 초파리 비주얼 시스템 내에서 낮은 풍부에 효율적으로 하기 위한 셀 분리 프로토콜을 제시.

Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

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Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting  

배우세요 Drosophila 말단 뉴런을 자기 비드 정렬로 분리 및 정제하는 방법을. CD8-GFP 융합 단백질을 표현하는 뉴런을 항체 코팅 자기 비드로 선택적으로 결합시켜 고순도 세포 집단을 얻습니다.

의 분리 및 정제 Drosophila 주변 뉴런

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