6.5 DPC 마우스 태아의 해부

제 이름은 Kelly Shea이며, Neilsen 실험실의 실험실 관리자이자 연구 기술자입니다. 많은 사람들이 서로 다른 조직층을 구별하는 방법을 모르기 때문에 이 과정이 매우 어렵습니다. 따라서 기본적으로 모든 조직층을 벗겨내어 하부에 있는 배아를 노출시켜야 하는데, 이 시점의 배아는 혈관 형성이 많이 되지 않은 상태입니다. 그래서 매우 투명하며 구별하기가 어렵습니다.

끝이 뭉툭한 핀셋과 가위를 준비합니다. 먼저 동물의 정중선 부위를 집어 첫 절개를 실시합니다. 그런 다음 해당 지점부터 피부를 양옆으로 벌려 동물의 복부를 노출시킵니다.

포셉으로 들어 올릴 수 있는 얇은 복막 층이 있으며, 이를 가위로 절개하여 뒤로 젖혀줍니다. 그 다음 동물의 정중선을 따라 절개하여 중앙에서 연결된 양쪽 자궁각을 분리합니다. 자궁각의 기저부를 바로 절단하면 됩니다.

그 과정에서 지방이 많이 섞여 나올 가능성이 큽니다. 동물의 자궁각 전체를 채취하여 바로 PBS에 넣으십시오.

여기 뿔 부분입니다. 이곳이 이식 부위 1, 2, 3, 4, 5입니다. 이제 이 부위들을 분리해 주면 됩니다.

기본적으로 여기 이 식립 부위 사이를 절개하면 됩니다. 배아의 측면을 잡아 기본적으로 벌려 줍니다. 이 단계에서 아래쪽에 있는 더 스펀지 같은 조직인 dym을 노출하게 됩니다.

따라서 배아는 바로 여기, 정중앙에 위치해야 합니다. 이곳이 유엽의 정단부입니다. 정단부가 위를 향하도록 방향을 잡으십시오.

정단부에서 약 5분의 1 지점을 절단하게 됩니다. 배아는 바로 여기 중앙에 위치해야 합니다. 저는 배아를 옆으로 방향을 잡은 다음, 한 쌍의 핀셋으로 배아를 잡고 다른 핀셋으로 고정한 상태에서 끝부분을 잘라내어 분리합니다.

캡을 제거한 후, 배아를 세로로 세웁니다. 보시다시피 캡을 제거한 부분에 개구부가 있습니다. 그곳으로 핀셋을 밀어 넣으십시오. 네.

이 시점에서 배아는 배낭(deum) 안에 매우 느슨하게 자리 잡고 있습니다. 배낭을 벌려 열면, 배아의 바닥 부분을 잘 받쳐주는 한 기본적으로 매우 쉽게 꺼낼 수 있습니다. 크기가 매우 작습니다.

배아에 여전히 부착되어 있는 몇몇 조직들이 있습니다. 배아의 정점에 위치한 외태반 원추(ecto placental cone)가 있으며, 그 외에도 여전히 부착되어 있는 다른 조직들이 있습니다.

이제 피펫을 사용하여 배아를 흡입합니다. 이 단계에서 배아를 고정해야 하므로, PFA가 담긴 배양 접시를 준비합니다.

우리는 후보 유전자를 조사하고자 했습니다. 기본적으로 전장 표본 RNA-in situ hybridization 기술을 사용하여 배아 내에서 핵산의 생성을 시각화하고 있습니다. 우리가 매우 관심을 가지고 있는 이 특정 유전자들은 추정 생식세포 전구체 마커를 인코딩하며, 추정 생식세포 전구체가 생식세포로 발달하고 성숙하는 데 도움이 되는 특정 시점에 마우스 배아에서 발현될 것으로 예측됩니다.

우리가 우선적으로 매우 관심을 가졌으며, 실제로 이 6.5일 차 배아에서 전장 조직 인시투 하이브리다이제이션(whole mount in situ)을 수행한 첫 번째 인자는 골형성단백질 4(BMP four)였습니다. 이는 TGF-beta 초가족의 일원입니다. BMP four는 매우 중요하며 생식세포 성숙에 반드시 필요합니다.

또한 생식 세포가 배아 전체로 이동하여 배아의 원시선 근처에 위치해야 합니다. BMP4는 이러한 신호 전달과 생식 세포가 원시선에 위치하기 위해 거쳐야 하는 성숙 과정 모두에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 우선, 무엇을 찾아야 하는지, 그 크기가 얼마나 작은지, 어떤 배율로 작업하고 있는지를 정확히 파악하고, 매우 신중하게 계획을 세워야 합니다.

이 기법은 특히 어떤 종류의 실체 현미경을 사용할 것인지가 중요합니다. 기술적인 어려움 중 하나는 배아에 손상을 주지 않도록 매우 세밀한 조작과 아주 안정적인 손 움직임이 필요하다는 점입니다. 따라서 조작 공간이 충분한 실체 현미경을 사용해야 하며, 해부 과정 중 불필요한 조작을 최소화할 수 있도록 실험에 필요한 모든 준비물을 미리 갖추어 놓아야 합니다.

그 외에도, 매우 천천히 진행하며 개별 조직층을 아주 천천히 벗겨내어 현재 작업 중인 부위를 정확히 파악해야 한다고 생각합니다. 그리고 배아가 어디에 위치해 있는지 반드시 확인하십시오.