Name: 6.5 DPC 마우스 태아의 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 6.5 DPC 마우스 태아 해부 기법으로 조기 원시줄기 단계 배아를 분리하는 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 발달생물학에서 유전자 패턴형성과 세포 계통 결정 연구에 필수적인 기술을 제공합니다.

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여성 마우스에서 생식 기관의 해부 <ol><li> 임신 동물 압축 가스를 사용하여 CO 2 질식에 의해 euthanized 있습니다. </li><li> 흡수 패드에있는 동물 부정사를 틀어서 마우스 머리로 절개를 오염의 위험을 줄이기 위해 70 %의 에탄올에 만끽해보세요. </li><li> 피부를 꼬집어하고 정기적으로 수술 가위로 정중선에서 작은 측면 절개합니다. 확고하게 상기와 절개 아래의 피부를 잡고 머리와 복부를 노출 꼬리쪽으로 떨어져 피부를 당기십시오. </li><li> 포셉로 복막을 파악하여 복강을 노출 그만 하죠. </li><li> 이 자궁 뿔을, 수란관과 난소 : 뱃속의 지느러미 지역에서 생식 기관을 찾습니다. </li></ol> 원시 리크 단계 (6.5 DPC) 해부 <ol><li> 수란관 아래 자궁 쥐고하여 자궁 경적을 제거하고 mesometrium 따라 그것이 무료로 잘라. 얼음 차가운 PBS의 해부 자궁 놓으십시오. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_7_8_2/160_figure-1.jpg" alt="그림 1" width="263" height="132"> 그림 1 </li><li> 자궁 호른 함께 주입 사이트간에 절단하여 각 배아를 구분합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_7_8_3/160._figure-2.jpg" alt="그림 2" width="575" height="171"> 그림 2 </li><li> 주변 근육의 레이어와 싸여 decidua 조직 사이의 시계 제조인의 집게를 슬라이딩하여 근육의 자궁 내막을 파악. 다시 근육 계층 껍질, decidua을 알아가는 겁니다. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_4/160_Figure-3.png" alt="그림 3" width="593" height="166"> 그림 3 </li><li> 동봉된 배아의 midventral 또는 말초 팁을 노출됩니다 아펙스 (약 decidua 조직의 1 / 5)에서 노출 decidua의 일부를 클립. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_5/160_Figure-4.png" alt="그림 4" width="589" height="212"> 그림 4 </li><li> 배아는 포셉의 도움말을 사용하여 밖으로 껍질 수 있습니다. 피어스는 배아를 둘러싼 포셉와 오픈 포셉와 decidua 떨어져 decidua 찢어 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_6/160_Figure-5.png" alt="그림 5" width="249" height="200"> 그림 5 </li><li> 일단 배아가 제거되어 Reichart의 멤브레인 여전히 ectoplacental 콘 (trophoblast)뿐만 아니라 첨부할 수 있습니다. 배아는주의 절개로 추가 해부하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_7/160_Figure-6.png" alt="그림 6" width="356" height="222"> 그림 6 </li></ol>

<ol><li>Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).</li>
</ol>

마우스의 Postimplantation 4.5 DPC과 출산 사이에 발생합니다. 이 절개 방법은 이전 또는 이후 5.5-8.5 DPC에 무대 배아를 분리하기 위해 본질적으로 설명, 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>미세 해부용 포셉, 톱니 모양, 직선형</td><td>도구</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5130</td><td>2쌍</td></tr><tr><td>미세 해부용 핀셋 Pattern #55 INOX</td><td>도구</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td>2쌍</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 인산 완충 식염수 (1x)</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 멸균 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>PBS 내 4% 파라포름알데히드</td><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>직선형 날카로운 끝 해부용 가위</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>임신한 암컷 생쥐</td><td>동물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

6.5 dpc 마우스 태아의 해부

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

포유류의 배아 발달의 초기 단계 동안 유전자 발현 패턴 분석 유전자 기능, 세포 - 세포 상호 작용 및 신호 메커니즘 그 가이드 배아 patterning에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있습니다. 그러나, 곧 주입 후 decidua에서 마우스 배아의 해부는 도전적인 절차 될 수 있으며,이 과정에 대한 자세한 단계별 문서는 부족합니다. 여기 이후 주입 (6.5 DPC) 배아가 처음 임신 마우스 (질 플러그가 지정 일 0.5 poist의 coitum의 검출)의 자궁을 해부하고 그 후에 산모 decidua에서 배아를 해부하여 격리하는 방법을 보여줍니다. 레이처트의 막의 절개는 ectoplacental 원추의 제거뿐만 아니라 설명되어 있습니다.

postimplantation - 무대 배아의 격리는 한 유전자 patterning을 연구하고 개발하는 동안 배아 프로세스를 만드는 세포 혈통 결정을 분석할 수 있지만, 초기 배아의 적절한 절개 도전하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 원시 - 연속 단계의 배아를 분리하는 방법을 설명합니다 (~ 6.5 일 이후 coitum [DPC]).

6.5 DPC 마우스 태아의 해부

포유류 배아 발달 초기 단계의 유전자 발현 패턴 분석은 유전자 기능, 세포 간 상호작용...

제 이름은 Kelly Shea이며, Neilsen 실험실의 실험실 관리자이자 연구 기술자입니다. 많은 사람들이 서로 다른 조직층을 구별하는 방법을 모르기 때문에 이 과정이 매우 어렵습니다. 따라서 기본적으로 모든 조직층을 벗겨내어 하부에 있는 배아를 노출시켜야 하는데, 이 시점의 배아는 혈관 형성이 많이 되지 않은 상태입니다. 그래서 매우 투명하며 구별하기가 어렵습니다.끝이 뭉툭한 핀셋과 가위를 준비합니다. 먼저 동물의 정중선 부위를 집어 첫 절개를 실시합니다. 그런 다음 해당 지점부터 피부를 양옆으로 벌려 동물의 복부를 노출시킵니다.포셉으로 들어 올릴 수 있는 얇은 복막 층이 있으며, 이를 가위로 절개하여 뒤로 젖혀줍니다. 그 다음 동물의 정중선을 따라 절개하여 중앙에서 연결된 양쪽 자궁각을 분리합니다. 자궁각의 기저부를 바로 절단하면 됩니다.그 과정에서 지방이 많이 섞여 나올 가능성이 큽니다. 동물의 자궁각 전체를 채취하여 바로 PBS에 넣으십시오.여기 뿔 부분입니다. 이곳이 이식 부위 1, 2, 3, 4, 5입니다. 이제 이 부위들을 분리해 주면 됩니다.기본적으로 여기 이 식립 부위 사이를 절개하면 됩니다. 배아의 측면을 잡아 기본적으로 벌려 줍니다. 이 단계에서 아래쪽에 있는 더 스펀지 같은 조직인 dym을 노출하게 됩니다.따라서 배아는 바로 여기, 정중앙에 위치해야 합니다. 이곳이 유엽의 정단부입니다. 정단부가 위를 향하도록 방향을 잡으십시오.정단부에서 약 5분의 1 지점을 절단하게 됩니다. 배아는 바로 여기 중앙에 위치해야 합니다. 저는 배아를 옆으로 방향을 잡은 다음, 한 쌍의 핀셋으로 배아를 잡고 다른 핀셋으로 고정한 상태에서 끝부분을 잘라내어 분리합니다.캡을 제거한 후, 배아를 세로로 세웁니다. 보시다시피 캡을 제거한 부분에 개구부가 있습니다. 그곳으로 핀셋을 밀어 넣으십시오. 네.이 시점에서 배아는 배낭(deum) 안에 매우 느슨하게 자리 잡고 있습니다. 배낭을 벌려 열면, 배아의 바닥 부분을 잘 받쳐주는 한 기본적으로 매우 쉽게 꺼낼 수 있습니다. 크기가 매우 작습니다.배아에 여전히 부착되어 있는 몇몇 조직들이 있습니다. 배아의 정점에 위치한 외태반 원추(ecto placental cone)가 있으며, 그 외에도 여전히 부착되어 있는 다른 조직들이 있습니다.이제 피펫을 사용하여 배아를 흡입합니다. 이 단계에서 배아를 고정해야 하므로, PFA가 담긴 배양 접시를 준비합니다.우리는 후보 유전자를 조사하고자 했습니다. 기본적으로 전장 표본 RNA-in situ hybridization 기술을 사용하여 배아 내에서 핵산의 생성을 시각화하고 있습니다. 우리가 매우 관심을 가지고 있는 이 특정 유전자들은 추정 생식세포 전구체 마커를 인코딩하며, 추정 생식세포 전구체가 생식세포로 발달하고 성숙하는 데 도움이 되는 특정 시점에 마우스 배아에서 발현될 것으로 예측됩니다.우리가 우선적으로 매우 관심을 가졌으며, 실제로 이 6.5일 차 배아에서 전장 조직 인시투 하이브리다이제이션(whole mount in situ)을 수행한 첫 번째 인자는 골형성단백질 4(BMP four)였습니다. 이는 TGF-beta 초가족의 일원입니다. BMP four는 매우 중요하며 생식세포 성숙에 반드시 필요합니다.또한 생식 세포가 배아 전체로 이동하여 배아의 원시선 근처에 위치해야 합니다. BMP4는 이러한 신호 전달과 생식 세포가 원시선에 위치하기 위해 거쳐야 하는 성숙 과정 모두에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 우선, 무엇을 찾아야 하는지, 그 크기가 얼마나 작은지, 어떤 배율로 작업하고 있는지를 정확히 파악하고, 매우 신중하게 계획을 세워야 합니다.이 기법은 특히 어떤 종류의 실체 현미경을 사용할 것인지가 중요합니다. 기술적인 어려움 중 하나는 배아에 손상을 주지 않도록 매우 세밀한 조작과 아주 안정적인 손 움직임이 필요하다는 점입니다. 따라서 조작 공간이 충분한 실체 현미경을 사용해야 하며, 해부 과정 중 불필요한 조작을 최소화할 수 있도록 실험에 필요한 모든 준비물을 미리 갖추어 놓아야 합니다.그 외에도, 매우 천천히 진행하며 개별 조직층을 아주 천천히 벗겨내어 현재 작업 중인 부위를 정확히 파악해야 한다고 생각합니다. 그리고 배아가 어디에 위치해 있는지 반드시 확인하십시오.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

초기 개발 단계 동안 원시 종자 세포로 차별화하는 배아 새싹 세포의 능력은 암, 불임에 관한 우리의 가설을 해결하기 위해 완벽한 모델​​입니다. 이 프로토콜은 10.5-11.5 일 게시 coitum 마우스 배아의 개발 생식선에서 원시 종자 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

쥐 척수로 감각 afferents의 틀에 박힌 예상 단일 axons의 추적을 통해 axonal 분기를 공부하기 위해 쉽게 액세스할 실험 시스템을 제공합니다.

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

태아 얼굴 외배엽과 mesenchyme의 분리를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 우리는 먼저 전체 배아를 취급하는 전체 얼굴 프로미넌스 prominences을 해부하기 위해 Dispase II를 사용하고 얼굴 외배엽과 mesenchyme 구분합니다.

마우스 배아 얼굴 외배엽과 Mesenchyme의 분리

일차 분리된 배아 해마 신경 세포 배양은 뉴런 사멸과 관련된 신호 전달 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다. 해마의 분리 및 해리 전에 배아를 성별화하면 남성과 여성을 분리하여 배양을 준비할 수 있으며, 이를 통해 연구자는 성별에 따른 세포 신호를 식별하고 조사할 수 있습니다.

허혈성 세포 사멸 경로를 연구하기 위한 성 계층화된 신경 배양

노드 및 notochordal 플레이트는 일시적 이며, 여러 가지 기술을 사용 하 여 시각 될 수 있는 마우스 배아 개발 주최 신호 여기, 우리가 자세히 설명 두 그들의 구조 및 morphogenesis 연구 기법을 수행 하는 방법: 1) 스캐닝 전자 현미경 (SEM); 그리고 2) 전체 마운트 면역 형광 검사 (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

여기에서는 축 신장 및 세분화의 맥락에서 마우스 배아의 세 가지 및 네 차원 이미지 데이터를 시각화하고 분석 할 수있는 계산 도구 및 방법을 설명하고, 토토 광학 투영 단층 촬영에서 얻은 다중 광자 현미경을 사용하여 라이브 이미징 및 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행합니다.

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

고전적으로, 마우스 배아 판막 원초의 심내막은 횡단, 관상 또는 시상 절편을 사용하여 분석되었습니다. 판막 형성 영역에서 심내막의 2차원 이미징에 대한 우리의 새로운 접근 방식은 판막 발달 중 심내막의 평면 극성 및 세포 재배열 분석을 가능하게 합니다.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

배우세요 6.5 DPC 마우스 태아 해부 기법으로 조기 원시줄기 단계 배아를 분리하는 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 발달생물학에서 유전자 패턴형성과 세포 계통 결정 연구에 필수적인 기술을 제공합니다.

6.5 DPC 마우스 태아의 해부

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