에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila

새로운 형질전환 IRFP 리포터 초파리 라인은 I 성충판(imaginal disc)의 특정 세포에서 적색 형광 단백질(RFP)을 발현합니다. 이 형질전환 라인은 발달 중인 눈에서 특정 세포 유형을 식별, 해부 및 표지하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 눈 성충판을 해부하기 위해, 방랑기 3령 유충을 스패튤러를 사용하여 바이알 측면에서 제거합니다.

그 후 유충을 실 가드 디쉬(sill guard dish) 위의 PBS 한 방울에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 안구 디스크가 부착된 구강 부위를 유충의 나머지 부분에서 분리한 다음, 안구 디스크를 슬라이드로 옮겨 구강 부위 및 뇌로부터 박리합니다. 안녕하세요, 저는 킹스 칼리지 런던의 울프슨 노화 관련 질환 센터(Wolfson Center for age related diseases)에 있는 Joseph Bateman 연구실의 Amna Cole입니다.

오늘은 Drosophila의 성충 원기 눈 디스크(imaginal eye discs)를 해부하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 신경발생에 관여하는 유전자를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

눈 성상체(eye imaginal discs) 해부를 시작하려면, Sylgard가 코팅된 페트리 접시에 PBS 한 방울을 떨어뜨립니다. 해부 현미경 하에서 Sylgard 코팅은 해부 과정 중 핀셋이 손상되는 것을 방지하는 역할을 합니다. 다음으로, 스파툴라를 사용하여 3령 유충(third instar larva) 한 마리를 집어 PBS 방울 위에 놓습니다. 양손에 핀셋을 쥐고, 한쪽 핀셋으로 유충의 후단 방향으로 약 2/3 지점을 잡습니다. 이제 다른 쪽 핀셋을 사용하여 유충 전단에 있는 어두운 색의 구강 부위를 잡습니다.

핀셋을 서로 반대 방향으로 움직여 유충을 부드럽게 벌립니다. 이때 구강 부위가 안구-뇌 복합체가 부착된 상태로 나머지 몸체에서 분리되어야 합니다. 다음으로 슬라이드 글라스 위에 PBS 한 방울을 떨어뜨리고, 구강 부위를 잡고 원반들을 PBS 방울 위로 옮깁니다.

이제 실체 현미경을 형광 모드로 전환하십시오. 눈 성충판(eye imaginal discs)만 RFP를 발현하므로, 구형의 시엽(optic lobes) 위에 겹쳐진 적색 형광 조직으로 쉽게 식별하여 성충판의 대비를 높일 수 있습니다. 광섬유 냉광원을 슬라이드에 비스듬한 각도로 비추십시오. 눈 성충판은 후방으로는 시신경절(optic stalk)을 통해 시엽에, 전방으로는 촉각 성충판(antenna disc)에서 뻗어 나온 줄기를 통해 구강 부위에 부착되어 있습니다.

안구 상상판을 분리하기 위해, 한 쌍의 핀셋으로 조직을 고정하고 다른 한 쌍의 핀셋을 사용하여 유충 뇌에서 안구 상상판을 분리하십시오. 다음으로, 안구 상상판에서 구강 부위를 분리하십시오. 구강 부위가 안구 상상판에서 분리되면, 이를 슬라이드에서 제거하십시오.

이제 안구 성판(eye imaginal discs)이 슬라이드 위에 평평하게 놓여 있어야 하며, 뇌 조직을 포함한 기타 불필요한 조직이 제거된 상태여야 합니다. 나머지 안구 성판들에 대해서도 해부를 계속 진행하십시오. 모든 안구 성판의 해부가 완료되면, 슬라이드를 살짝 기울인 후 작은 종이 타월 조각을 사용하여 과량의 PBS를 닦아내십시오.

이제 vector shield 마운팅 용액 한 방울을 추가하고 그 위에 커버슬립을 조심스럽게 덮습니다. 이제 디스크를 에피 형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다. 이미징을 나중에 수행할 경우, 슬라이드를 4 °C에서 보관하십시오.

RFP는 최소 1년 동안 가시 상태로 유지됩니다. Z-시리즈 영상을 촬영할 때는 공초점 현미경 또는 Zeiss Axiom 현미경에서 20배 또는 40배 렌즈를 사용하여 1 µm 간격으로 획득해야 하며, 이후 현미경 소프트웨어를 사용하여 투영 영상을 생성할 수 있습니다. IRFP를 발현하는 초파리의 성상반을 적출하고 Phalloidin으로 염색하였습니다. 이후 Zeiss Axiom 현미경을 사용하여 20배 렌즈로 1 µm 간격으로 영상을 촬영하였습니다. RFP를 발현하는 눈 성상반의 세포들이 붉은색으로 표시되어 있습니다.

형태발생구(morphogenetic furrow)는 foid 염색을 통해 시각화되었으며 녹색으로 표시됩니다. 안구 디스크(eye disc)의 배측 및 복측 극은 굽어 있으며 접히는 경향이 있습니다. 이러한 섹션들은 최종 투영 이미지에서 제거될 수 있습니다.

디스크는 단층 상피 조직이지만, 핵의 위치가 다양하므로 디스크의 전체적인 모습을 확인하기 위해서는 Z-시리즈 투영(Z Series projection)이 필요합니다. IRFP 리포터는 핵에 국소화되어 있으므로, 여기서 보이는 패턴은 RFP의 핵 발현을 나타냅니다. 지금까지 초파리에서 성체 안구 디스크를 적출하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때는 정밀 핀셋을 사용하는 것이 좋으며, 가급적 커피 섭취를 자제하는 것이 좋습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 모든 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.