Name: 에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 학습하세요 Drosophila 눈 이미지널 디스크의 RFP 리포터를 활용한 분리 및 시각화 기법을 통해 신경발생과 세포 유형 식별 방법을 익히세요. 이 기법은 발달생물학 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 킹스 칼리지 런던 왕립 학회에 의해 투자되었다.

<ol&gt;<li해부 현미경 Sylgard 요리에 PBS의&gt; 처음부터 놓습니다.</li&gt;<li&gt; 다음 주걱을 사용하여 유리병이나 용기에서 여러 방황 셋째 instar의 유충을 제거하고 PBS에서 그들을 놓으십시오.</li&gt;<li&gt; 절개가 유충에게 후부 향해 길을 3 분의 2를 파악 후 앞쪽에 끝에있는 어두운 색깔 입 후크를 잡아 다른 쌍을 사용하는 (당신이 바로 잡 경우) 왼손의 핀셋을 사용하여 시작합니다.</li&gt;<li&gt; 이제 부드럽게 서로 떨어져 핀셋 두 쌍의 이동하여 분리 유충을 가져옵니다. mouthparts의 눈 / 두뇌 복잡한 붙어있는 신체의 나머지로부터 떨어질 수 있습니다.</li&gt;<li&gt; 얼음 30-45분에 대한 4 % paraformaldehyde / PBS 용액에서 그들을 배치하여 immunofluorescence 수정이 시점에서 디스크 눈을 디스크를 얼룩합니다. 다음 PBST로 디스크에게 네 번 씻어하고 적절한 항체와 다음 얼룩.</li&gt;<li&gt; 직접 슬라이드에 눈을 디스크를 해부하다하는 가장 쉬운 그것을 것입니다. 슬라이드에 PBS의 드롭을 장소와 mouthparts를 개최하여 PBS의 드롭으로 디스크를 이동합니다.</li&gt;<li&gt; imaginal 조직은 반투명하고 눈 디스크 식별하기가 어렵습니다 그래서 처음엔 있습니다. 쉽게 그들 형광 기능과 해부 현미경을 사용하여 식별할 수 있도록. 사용 눈을 - RFP 기자 라인 아이 디스크는 명확하게 구면 광 엽 (叶) (그림 1) 오버레이 빨간색 형광 조직으로 볼 수 있습니다.</li&gt;<li&gt; 당신이이 디스크에게 큰 대조를 제공하므로, 슬라이드 경사 각도에서 빛을 직접 광섬유 차가운 광원을 사용하는 경우. 눈 / antennal 디스크 뒷부분에있는 광학 스토킹을 통해 광 엽 (叶)과 앞쪽에에서 antennal 디스크에서 오는 스토킹을 통해 mouthparts에 붙어 있습니다.</li&gt;<li&gt; 눈 디스크 핀셋 중 한 켤레를 사용하여 mouthparts을 보유 해부하다하고 애벌레 머리에서 눈을 디스크를 분리하는 다른 쌍을 사용하십시오. 다음 mouthparts에서 눈을 디스크를 구분합니다. 이들은 드러 누어에서 coverslip을 방지할 수로 마지막 슬라이드에서 mouthparts를 제거합니다.</li&gt;<li&gt;는 모든 눈 디스크 부드럽게 슬라이드를 기울하고 초과 PBS를 건조 해부했으면. 다음 Vectashield 한 방울을 추가하고 부드럽게 위에 coverslip을 넣으십시오.</li&gt;<li&gt; 디스크는 이제 중 epifluorescence 또는 공촛점 현미경 (그림 2)에 의해 몇 군데 준비하고 있습니다.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 대표 결과</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 제대로 해부하면 눈 / antennal 디스크는 두뇌와 같은 어떤 외부 조직의 명확한 슬라이드에 평평하게 누워 있습니다. 아이 디스크의 지느러미와 복부 기둥은 곡선 그래서 접어하는 경향이 있지만, 이것은 공촛점 현미경에서 Z - 시리즈를 감수하면서 프로젝션 이러한 섹션을 생략함으로써 피할 수 있습니다. 디스크 monolayer의 상피이지만 핵의 변수 위치는 디스크의 전체적인 사진을 얻을 수있는 Z - 시리즈 투영을 필요로합니다. 공촛점 현미경에서 찍은 일반 눈 - RFP의 눈 / antennal 디스크의 투영은 그림 2에 표시됩니다. 우리는 일반적으로 20x 또는 40x 렌즈를 사용하여 디스크를 통해 1 μm의 섹션을 가져가라. 눈 - RFP의 기자가 핵화된 따라서 그림 2에서 본 패턴이 RFP을 표현 세포의 핵을 나타내는 것입니다.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig1.jpg" alt="figure 1" /<br /<strong&gt; 그림 1. 눈 - RFP 셋째 instar Drosophila의 유충에서 눈 / 두뇌 단지의 초기 절개.</strong&gt; 눈 / antennal imaginal 디스크 (설명) mouthparts (MP)에 연결하고 두뇌의 광 엽을 (OL) 오버레이 볼 수 있습니다. 이미지가 눈에 디스크에있는 RFP의 표현을 보여주는 형광 현미경을 사용하여 해부 찍은 거죠. 앞쪽에는 왼쪽입니다. 스케일 바 : 300 μm의.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig2.jpg" alt="figure 2" /<br /<strong&gt; 그림 2. 눈에 imaginal 디스크에있는 눈 - RFP 기자의 표현.</strongRFP 표현 (빨간색)를 보여주는 눈을 RFP의 유충의 해부&gt; 셋째 instar 아이 (ED) / antennal 디스크 (AD). 디스크 morphogenetic 퍼로우 (화살촉)를 보여줍니다 얼룩 혀끝의 세포 표면과 phalloidin (녹색)와 스테인드했다. RFP는 photoreceptors 1,6,7와 원추 세포에서, MF 주변 전구체 세포에 표시됩니다. 앞쪽에는 왼쪽입니다. 스케일 바 : 25 μm의.</p

<ol><li>Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).</li>
<li>Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).</li>
</ol>

Drosophila 아이 imaginal 디스크의 해부는 간단하지만, 마스터 시간이 걸릴 수 있습니다. 중요한 단계는 눈 디스크와 멀리 떨어진 애벌레 두뇌로부터 절개의 식별됩니다. 아이 디스크의 식별은 눈 - RFP 라인이 여기에 설명된 사용하고 쉽게 구성되어 있습니다. 가능한 수정 antennal 디스크 또는 peripodial 멤브레인를 제거하거나 두뇌를 입력 홍보 axons을 시각화에 연결된 광 엽을 떠날 수 있습니다. 눈 - RFP 라인은 복제하여 pRed H - 스팅거 향상제 - 기자 벡터 3로 지적 P2 유전자 2 ​​번째 인트론에서 소설 눈을 특정 향상제 요소를 생성하고 유전자 변형 파리를 만드는 이것을 사용했습니다. 눈 - RFP의 기자는 푸에르 토리코의 특정 하위 집합 및 원뿔 세포 (그림 2).로 표시됩니다. 그것은 따라서 관심의 유전자가 이러한 세포 유형에 표현인지 여부를 확인하는 데 ...

에있는 아이 imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 rfp 리포터 drosophila</em

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

<em&gt; Drosophila</em&gt; 눈으로는 neurogenesis, 신호 전달 및 neurodegeneration과 같은 분야를 공부를위한 강력한 모델 시스템입니다. 발견의 대부분은이 시스템을 사용하여 개발 눈을 imaginal 디스크의 photoreceptor 차별의 spatiotemporal 자연의 이점을 점령했다. 연구자는 식별 배우고 눈을 디스크를 해부하다하는 것은 처음 필요가이 시스템을 사용할 수 있습니다. 우리는 눈 디스크 및 개발 안구의 특정 세포 유형의 시각화의 식별에 도움을 소설 RFP 기자를 설명합니다. 우리는 세부 셋째 instar의 유충에서 눈을 imaginal 디스크의 해부를위한 방법론과 눈 - RFP 기자이 절개에 도움이 수 방법에 대해 설명합니다. 이 눈 - RFP의 기자는 눈을 표현하고 신호 증폭을위한 필요없이 살아있는 조직이나 고정 후 형광 현미경 중 하나를 사용하여 시각하실 수 있습니다. 우리는 또한이 기자는 눈을 디스크 내의 특정 세포 유형을 식별하는 데 사용될 수있는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜과 눈을 RFP 기자의 사용은을 사용하여 연구자를 지원합니다<em&gt; Drosophila</em근본적으로 중요한 생물 학적 질문을 해결하기&gt; 눈.

우리의 특별 표현하는 소설 빨간색 형광 단백질 (RFP) 기자를 설명<em&gt; Drosophila</em&gt; 눈. 우리는 세부 눈 imaginal 디스크의 해부를위한 방법론과 방법이 기자는 절개 및 개발 안구의 특정 세포 유형의 식별에 도움을 사용할 수 있습니다.

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

초파리 눈은 신경발생, 신호 전달 및 신경퇴행과 같은 분야를 연구하기 위한 강력한 모델 시스템입니다. 많은 발견들이...

새로운 형질전환 IRFP 리포터 초파리 라인은 I 성충판(imaginal disc)의 특정 세포에서 적색 형광 단백질(RFP)을 발현합니다. 이 형질전환 라인은 발달 중인 눈에서 특정 세포 유형을 식별, 해부 및 표지하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 눈 성충판을 해부하기 위해, 방랑기 3령 유충을 스패튤러를 사용하여 바이알 측면에서 제거합니다.그 후 유충을 실 가드 디쉬(sill guard dish) 위의 PBS 한 방울에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 안구 디스크가 부착된 구강 부위를 유충의 나머지 부분에서 분리한 다음, 안구 디스크를 슬라이드로 옮겨 구강 부위 및 뇌로부터 박리합니다. 안녕하세요, 저는 킹스 칼리지 런던의 울프슨 노화 관련 질환 센터(Wolfson Center for age related diseases)에 있는 Joseph Bateman 연구실의 Amna Cole입니다.오늘은 Drosophila의 성충 원기 눈 디스크(imaginal eye discs)를 해부하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 신경발생에 관여하는 유전자를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.눈 성상체(eye imaginal discs) 해부를 시작하려면, Sylgard가 코팅된 페트리 접시에 PBS 한 방울을 떨어뜨립니다. 해부 현미경 하에서 Sylgard 코팅은 해부 과정 중 핀셋이 손상되는 것을 방지하는 역할을 합니다. 다음으로, 스파툴라를 사용하여 3령 유충(third instar larva) 한 마리를 집어 PBS 방울 위에 놓습니다. 양손에 핀셋을 쥐고, 한쪽 핀셋으로 유충의 후단 방향으로 약 2/3 지점을 잡습니다. 이제 다른 쪽 핀셋을 사용하여 유충 전단에 있는 어두운 색의 구강 부위를 잡습니다.핀셋을 서로 반대 방향으로 움직여 유충을 부드럽게 벌립니다. 이때 구강 부위가 안구-뇌 복합체가 부착된 상태로 나머지 몸체에서 분리되어야 합니다. 다음으로 슬라이드 글라스 위에 PBS 한 방울을 떨어뜨리고, 구강 부위를 잡고 원반들을 PBS 방울 위로 옮깁니다.이제 실체 현미경을 형광 모드로 전환하십시오. 눈 성충판(eye imaginal discs)만 RFP를 발현하므로, 구형의 시엽(optic lobes) 위에 겹쳐진 적색 형광 조직으로 쉽게 식별하여 성충판의 대비를 높일 수 있습니다. 광섬유 냉광원을 슬라이드에 비스듬한 각도로 비추십시오. 눈 성충판은 후방으로는 시신경절(optic stalk)을 통해 시엽에, 전방으로는 촉각 성충판(antenna disc)에서 뻗어 나온 줄기를 통해 구강 부위에 부착되어 있습니다.안구 상상판을 분리하기 위해, 한 쌍의 핀셋으로 조직을 고정하고 다른 한 쌍의 핀셋을 사용하여 유충 뇌에서 안구 상상판을 분리하십시오. 다음으로, 안구 상상판에서 구강 부위를 분리하십시오. 구강 부위가 안구 상상판에서 분리되면, 이를 슬라이드에서 제거하십시오.이제 안구 성판(eye imaginal discs)이 슬라이드 위에 평평하게 놓여 있어야 하며, 뇌 조직을 포함한 기타 불필요한 조직이 제거된 상태여야 합니다. 나머지 안구 성판들에 대해서도 해부를 계속 진행하십시오. 모든 안구 성판의 해부가 완료되면, 슬라이드를 살짝 기울인 후 작은 종이 타월 조각을 사용하여 과량의 PBS를 닦아내십시오.이제 vector shield 마운팅 용액 한 방울을 추가하고 그 위에 커버슬립을 조심스럽게 덮습니다. 이제 디스크를 에피 형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다. 이미징을 나중에 수행할 경우, 슬라이드를 4 °C에서 보관하십시오.RFP는 최소 1년 동안 가시 상태로 유지됩니다. Z-시리즈 영상을 촬영할 때는 공초점 현미경 또는 Zeiss Axiom 현미경에서 20배 또는 40배 렌즈를 사용하여 1 µm 간격으로 획득해야 하며, 이후 현미경 소프트웨어를 사용하여 투영 영상을 생성할 수 있습니다. IRFP를 발현하는 초파리의 성상반을 적출하고 Phalloidin으로 염색하였습니다. 이후 Zeiss Axiom 현미경을 사용하여 20배 렌즈로 1 µm 간격으로 영상을 촬영하였습니다. RFP를 발현하는 눈 성상반의 세포들이 붉은색으로 표시되어 있습니다.형태발생구(morphogenetic furrow)는 foid 염색을 통해 시각화되었으며 녹색으로 표시됩니다. 안구 디스크(eye disc)의 배측 및 복측 극은 굽어 있으며 접히는 경향이 있습니다. 이러한 섹션들은 최종 투영 이미지에서 제거될 수 있습니다.디스크는 단층 상피 조직이지만, 핵의 위치가 다양하므로 디스크의 전체적인 모습을 확인하기 위해서는 Z-시리즈 투영(Z Series projection)이 필요합니다. IRFP 리포터는 핵에 국소화되어 있으므로, 여기서 보이는 패턴은 RFP의 핵 발현을 나타냅니다. 지금까지 초파리에서 성체 안구 디스크를 적출하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때는 정밀 핀셋을 사용하는 것이 좋으며, 가급적 커피 섭취를 자제하는 것이 좋습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 모든 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

a-novel-rfp-reporter-to-aid-visualization-eye-imaginal-disc

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

출처: Hellerman, M. B.,  et al.  Pupal Eye의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015){{TAG_ 28}}이 비디오는 Drosophila melanogaster 번데기의 눈 패턴을 연구하기 위한 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 마커를 사용하면 발달 중인 눈 구조가 형성되는 동안 세포 조직 및 분화를 시각화할 수 있습니다.

형광 현미경을 사용한 Drosophila Pupal Eye의 라이브 이미징

토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 초파리 생활에 모자이크 광 수용체 세포를 시각화하는 것을 포함한다. 그것은 일 또는 몇 주 동안 망막에있는 각각의 광 수용체 세포의 운명을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 망막 변성 및 신경 퇴행성 질환 또는 광 수용체 세포 개발 연구에 이상적입니다.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 기술의 목표는 연구자들이 모든 연령의 Drosophila melanogaster에서 번데기 안구 디스크의 해부, 면역 염색 및 장착을 수행할 수 있도록 하는 것입니다.

해부와의 설치<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 아이 디스크

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

리간드에 노출되는 타이밍은 발달 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서 우리는 날개 디스크의 세포에서 Dpp에게 불린 Drosophila 뼈 형태 유전학 단백질 (BMP)의 심상 방출을 보여주는 방법을 보여줍니다.

초파리 날개 디스크에서 이미징 Dpp 릴리스

이 글에서는 시약을 경제적으로 사용하고 소수의 상상 디스크를 쉽게 다룰 수 있는 효율적인 상상 디스크 해부 및 항체 염색 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila melanogaster의 눈-더듬이 및 날개 상상 디스크의 소규모 해부 및 항체 염색

학습하세요 Drosophila 눈 이미지널 디스크의 RFP 리포터를 활용한 분리 및 시각화 기법을 통해 신경발생과 세포 유형 식별 방법을 익히세요. 이 기법은 발달생물학 연구에 필수적입니다.

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila

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