Name: 의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-21T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 학습하세요 Drosophila 배아 심장의 전자현미경 준비 방법을. 고정, 포매, 절단, 염색 단계를 통해 심장 루멘과 기저막의 초미세 구조를 관찰할 수 있습니다.

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심장 튜브 형성에 우리 작품 SGK에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 그랜트 (수상 ID 0744165)에 의해 지원되었다

<ol><li> 갓 20 ML 유리 섬광 병에 50mM Cacodylate 버퍼에서 12.5 %의 글루 타 알데히드 (pH7.4)를 포함하는 정착액 솔루션 2ml 준비합니다. N - 헵탄의 8ml를 추가하고 적극적으로 발라줍니다. 두 단계로 분리 수 있습니다. 깨끗한 섬광의 약병에 N - 헵탄 글루 타 알데히드와 채도를 포함하는 상위 단계, 장소를 제거하고 따로 설정합니다. 이것은 고정력있는 솔루션이 될 것입니다. </li><li> 이동식 메쉬 삽입과 작은 바구니는 배아 수집 챔버를 사용 00~20시간의 배아를 수집합니다. 2-3분의 50 % 표백 용액에 배아를 담글하여 외부 chorion 막 제거 또는 태아는 표백제의 표면에 떠까지. 종이 타월에 ddH20와 얼룩 배아로 철저히 씻어. </li><li> 포셉를 사용하여 태아의 메쉬에서 가을 있도록 정착액 솔루션으로 dechorionated 배아과 장소로 덮여 있습니다 메쉬 삽입을 선택합니다. 배아 4 1.5 시간 고칠 ° C를 Nutator에 혼합하는 동안 허용합니다. </li><li> 양면 테이프로 늘어선 페트리 접시를 준비합니다. 파스퇴르 pipet을 사용하여 정착액에서 배아를 제거하고 테이프의 접착제를 해소에서 정착액의 헵탄을 방지하기 위해 페트리 dish.Transfer의 녹화 표면 정착액 솔루션의 최소한의 배아에 그들을 놓으십시오. 배아의 단일 레이어를 만들기 위해 페트리 접시를 흔들어. 헵탄 증발 때까지 후드의 페트리 접시를 놓습니다. 배아를 커버하기에 충분한 PBS + 0.1 % Tween20를 추가합니다. 뭉툭한 텅스텐 바늘로 해부 현미경으로 직접 devitellinize 후반 16 단계 배아. 1.5 ML의 microfuge 관에 파스퇴르 pipet와 배아를 복구할 수 있습니다. 5-7 단계는이 microfuge 관에서 실시하고 있습니다. </li><li> 0.1M Cacodylate 버퍼, pH를 7.4에서 배아를 씻어 후 0.1M Cacodylate 버퍼, 실온에서 1 시간 동안 산도를 7.4에서 1 % 오스뮴의 tetroxide을 포함하는 용액에 포스트 수정. 0.1M Cacodylate 버퍼, pH를 7.4로 배아를 씻어. </li><li> 에탄올과 아세톤의 등급 일련의 배아를 탈수. 10 분 70 % 에탄올 다음 10 분 동안 50 %의 에탄올과 배아를 탈수. 그런 다음 10 분 10 분 각각의 두 100 % 아세톤 단계 90 %의 아세톤으로 탈수. </li><li> 아세톤을 제거한 다음 1:1 Epon - 스퍼 수지 추가하여 침투 과정을 시작 : 배아에 아세톤 혼합합니다. 진공 압력 아래 샘플을 유지하면서 Pelco Biowave 프로 전자 레인지를 사용하여 3 분 전자렌지. 전자 레인지가 끝난 후 추가로 5 분 동안 샘플로 진공 압력을 적용합니다. 교환 1:1 수지 100 % Epon - 스퍼 수지와 전자렌지로 다시 진공 압력 하에서 아세톤 혼합물. 진공 압력 하에서 교환 100 % Epon - 스퍼 수지 최종 시간, 전자렌지. </li><li> 파스퇴르 pipet 사용 배아는 실리콘 포함 금형에 microfuge 튜브에서 전송됩니다. 배아의 사후 끝이 금형의 테이퍼 가장자리와 일치 그러한 행을으로 배아를 맞춥니다. 70 ° C 오븐에 구워 하룻밤. </li><li> 샘플을 제거하고 sectioning 준비. </li><li> 다이아몬드 조직을 나이프와 리처트 Ultracut E 마이크로톰를 사용하여 1μm 섹션을 절단 시작합니다. 최초의 배아 부분에 도달하면 기록해 둡니다. 이 시점에서 샘플로 100μm 했네요. 루프를 사용하여 섹션을 제거하고 유리 슬라이드에 놓습니다. 간단히 뜨거운 접시에 섹션을 가열. 메틸렌 블루의 드롭을 사용하여 섹션을 얼룩. 가벼운 현미경 심장 루멘를 확인합니다. </li><li> 다이아몬드 울트라 45 ° 나이프와 리처트 Ultracut E 마이크로톰를 사용하여 90nm 부분을 잘라. 구리 격자에 여러 섹션을 선택하십시오. </li><li> 격자 10 분 50 % 에탄올에 포화 3 % uranyl 아세테이트 물들일 후 두 번 증류수로 세 번 씻어서 있습니다. 그런 다음 그리드 2 - 무료 환경 CO를 만들 수 NaOH 알약이 들어있는 챔버에 2.5 분 리드 구연 산염 (10ml 더블 증류수와 100ml 10M NaOH에 용해 0.04gms) 물들일 수 있습니다. 격자는 두 번 증류수로 세 번 씻어서 있습니다. </li><li> 섹션은 80Kv에서 JEOL 1200EX 전자 현미경으로 검사하고, AMT 디지털 카메라로 촬영하고 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Tepass, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Cellular+Junctions+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , (2000).</li>
<li>Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+by+Slit+and+Roundabout+prevents+Shotgun%2FE-cadherin-mediated+cell+adhesion+during+Drosophila+heart+tube+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation.</a> J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).</li>
</ol>

Drosophila 태아의 심장 관의 morphogenesis는 배아 발달 동안 세포 접착과 세포 모양의 변화를 공부에 유용한 모델 시스템으로 등장하고 있습니다. 이 구조를 공부에 직면한 도전 과제 중 하나는 심장 튜브의 루멘 전체가 탑재 배아의 시각화하기 어려운 것입니다. 이전에 설명한 절차 1-2에서 적응되었다이 비디오에서 보여준 기술은, 효율적이고 안정적으로 심장 튜브 및 루멘 형성 3 genotypes의 상당한 수를 분석에서 성공 입증했다.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 drosophila 태아의 심장 관

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

의 morphogenesis<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아의 심장 관은 배아 발달 동안 셀 마이 그 레이션, 세포 - 세포 부착 및 세포 모양의 변화를 공부에 유용한 모델 시스템으로 등장하고 있습니다. 이 구조를 공부에 직면한 도전 과제 중 하나는 심장 튜브의 루멘뿐만 아니라, 심장 튜브 형성에 중요한 막 기능은 전체 탑재 배아의 시각화하기 어려운되는 심장 튜브의 작은 크기로 인해 배아에 상대적으로하고 내부 lumenal 공간. 전송 전자 현미경의 사용은 이러한 구조의 높은 배율을 허용 쉽게 루멘의 크기와 모양을 밝히지 단면에서 배아를 검사의 장점을 제공합니다. 이 비디오에서는, 우리는 세부 안정적인 고정을위한 과정은 포함하고, 늦은 단계의 sectioning<em&gt; Drosophila</em셀 - 셀 분기점 및 지하 막 포함한 심장 튜브 루멘뿐만 아니라 중요한 세포 구조를 시각화하기 위해&gt; 태아.

우리는 sectioning, 고정, 삽입을위한 과정을 설명하고, 늦은 단계의 이미지<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아의 심장 튜브 Trasmission의 전자 현미경을위한 배아. 이 기술은 심장 튜브 루멘의 시각화뿐만 아니라 라인 가슴의 루멘을 지하 막에 대한 수 있습니다.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

초파리(Drosophila) 배아 심장 관의 형태 형성은 세포 이동, 세포 간 접착 및 세포 ...을 연구하는 데 있어 가치 있는 모델 시스템으로 부상했습니다.

이 영상에서는 초파리 배아 심장을 대상으로 하는 투과 전자 현미경(TEM) 분석 방법을 설명합니다. 심장은 세포 이동, 세포 간 접착 및 세포 모양 변화를 연구하기 위한 가치 있는 모델 시스템으로 부상했습니다. 이 기술을 통해 심장 내강의 모양뿐만 아니라 세포막, 세포 간 접합 및 기저막과 같은 초미세 구조 성분을 시각화할 수 있습니다.이 절차를 시작하려면, 초파리 배아의 투과 전자 현미경 관찰에 적합한 고정액을 준비합니다. 다음으로, 코팅된 0~20시간령의 수집 배아들을 고정액에 넣습니다. 과정이 완료되면, 배아를 고정액에서 꺼내어 양면테이프에 부착해 처리하기 쉬운 상태로 만듭니다.탈이온 버퍼가 담긴 페트리 접시에서 배아를 버퍼 속에 띄운 후 피펫으로 회수합니다. 그 다음 배아를 후고정하고 탈수 기울기 과정을 거칩니다. 레진으로 침투시킨 후, 배아를 임베딩 몰드로 옮겨 정렬시킵니다.결과물로 얻은 블록을 다이아몬드 나이프로 절단합니다. 절편을 구리 그리드 위에 올리고, 염색 후 검사합니다. 안녕하세요, 저는 뉴저지 의과대학 및 치과대학 로버트 우드 존슨 의과대학 병리학 및 실험의학과의 Sunita Kramer 교수 연구실 소속 Nadine Lop입니다.저는 PON 병리학과의 전자현미경 전문가 Raj Patel입니다. 오늘은 투과전자현미경을 위한 oph 배아의 전처리 및 이미징 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 초파리 심장 형태 형성 과정을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.초파리 배아를 다루기 전에 배아 고정을 위한 헵탄 투과법(Heptane permeation method)용 고정액을 새로 준비하십시오. 흄 후드 내에서 Cate 완충액에 12.5% glutaraldehyde가 포함된 갓 제조한 용액 2 mL를 유리 신틸레이션 바이알에 피펫으로 분주합니다. 여기에 ADA heptane 8 mL를 넣고 격렬하게 흔들어 섞습니다.그 후 1분 동안 기다립니다. 두 층이 분리되면 상층에는 고정액인 글루타르알데하이드로 포화된 ADA 헵탄이 포함됩니다. 상층을 깨끗한 바이알에 옮겨 담고 따로 보관하십시오. 0~20시간 된 배아를 수집하려면 탈착 가능한 메쉬 삽입물이 있는 작은 바스켓 형태의 배아 수집 챔버를 사용하십시오.먼저 배아가 들어 있는 포도 주스 플레이트를 꺼내고 죽은 초파리를 제거하십시오. 그런 다음 물과 붓을 사용하여 포도 주스 플레이트에서 배아를 떼어내고, 물이 담긴 스퀘어 병을 이용해 배아 수집 챔버로 배아를 옮기십시오.포도 주스 플레이트에서 배아에 남아 있는 과잉 효모를 씻어냅니다. 배아를 50% 표백제 용액에 2~3분 동안 또는 배아가 표면으로 떠오를 때까지 담가 외배엽막을 제거합니다. 증류수로 충분히 헹군 후 페이퍼 타월 위에서 배아의 물기를 제거합니다.포셉을 사용하여 코팅된 배아가 부착된 메쉬 인서트를 집어 올립니다. 인서트를 고정액에 넣어 배아가 메쉬에서 떨어지게 합니다. 4°C에서 오비탈 로커로 혼합하며 배아를 1시간 30분 동안 고정합니다.배양이 완료되면, 고정액을 최대한 적게 포함하도록 배아를 양면테이프가 깔린 페트리 접시에 옮깁니다. 접시를 흔들어 배아가 단층으로 퍼지게 한 다음, 헵탄이 증발하도록 화학 흄후드에 넣습니다. 배아가 건조되면 0.1% tween hand de vize가 포함된 완충액으로 배아를 덮어줍니다.해부 현미경 하에서 뭉툭한 텅스텐 바늘을 사용하여 16단계 후기의 배아를 처리합니다. 고정된 배아는 부유하며 파스퇴르 피펫으로 회수할 수 있습니다. 배아를 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 배아를 0.1 M CAC 완충액으로 세척한 후, 실온에서 1% Osmium tetroxide로 1시간 동안 후고정합니다.배양 후, 배아를 Cate 완충액으로 헹굽니다. 다시 한번 에탄올과 아세톤의 단계별 농도 시리즈를 이용하여 배아를 탈수시킵니다. 50% ethanol에서 10분 동안 시작하여 70% Ethanol에서 10분 동안 처리한 다음, 90% acetone에서 10분 동안 탈수시키고, 마지막으로 100% acetone 단계에서 각각 10분씩 처리합니다.아세톤을 제거합니다. ein 수지(spray resin)와 아세톤을 1:1 비율로 혼합하여 첨가함으로써 침투 과정을 시작합니다. 샘플이 진공 압력 하에 있는지 확인하고 3분 동안 마이크로파를 조사합니다.진공 압력을 5분 더 유지하십시오. 레진-아세톤 혼합물을 100% 레진으로 교체하고 진공 압력 하에서 다시 마이크로웨이브 처리를 하십시오. 레진을 교체하고 압력 하에서 마이크로웨이브 처리를 하십시오.총 세 번의 침투 단계를 위해 마지막으로 반복합니다. 배아를 마이크로 원심 분리 튜브에서 실리콘 임베딩 몰드로 옮깁니다. 배아의 후단이 몰드의 테이퍼진 가장자리와 일직선이 되도록 배아들을 한 줄로 정렬합니다.베이컨을 70 °C 오븐에서 하룻밤 동안 처리합니다. 그 후, 절편 제작을 위해 생성된 블록을 꺼냅니다. 마이크로톰을 사용하여 배아를 1 µm 두께의 절편으로 자릅니다.블록을 절단하여 배아에 도달하면, 루프를 사용하여 단일 절편을 유리 슬라이드로 옮겨 시각화 전에 심장을 관찰하기 위한 적절한 깊이에 도달했는지 확인합니다. 핫플레이트에서 절편을 짧게 가열하고, 슬라이드에 메틸렌 블루 한 방울을 떨어뜨린 후 다시 짧게 가열하여 절편을 염색합니다.다시 탈이온수로 헹군 후, 원하는 절단 깊이에서 현미경으로 절편을 관찰하십시오. 공간 제약을 충족하기 위해 광학 현미경으로 심장 내강이 식별되어야 합니다. 배아 심장이 보이는 횡단면 배아가 최대 5개 포함되도록 블록을 다시 다듬으십시오.마이크로톰을 사용하여 90 nanometer 두께로 절편을 제작합니다. 구리 그리드에 여러 개의 절편을 올립니다. 그리드를 3% al acetate로 10분 동안 염색한 후, 증류수로 3회 헹굽니다.이제 수산화나트륨 펠렛이 들어 있는 챔버에서 이산화탄소가 없는 환경을 조성한 후, 그리드를 리드 시트레이트로 2분 30초 동안 염색합니다. 배양 후, 증류수로 3회 세척하십시오. 전자현미경을 사용하여 80 kilovolts에서 절편을 관찰하고 CCD 카메라로 촬영합니다.절단 깊이와 스테이징이 적절하게 수행되었는지 확인하기 위해, 등쪽 중앙선의 두 심장 모세포(cardio blast) 사이에 성숙한 심장 내강이 형성되었음이 분명하게 나타나야 합니다. 세포막이 온전한지 확인하려면 심장 내강에 세포외 기질이 존재하는지 검사하고, 크리스테와 미토콘드리아의 존재 여부를 확인하십시오. 지금까지 초파리 배아 심장의 미세 구조를 결정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때초파리 배아의 단계를 적절하게 구분하고, 레진 성분을 정확하게 측정하여 잘 혼합하는 것이 중요하다는 점을 기억하시기 바랍니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

preparation-embryos-for-electron-microscopy-drosophila-embryonic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 기술은 immunohistochemistry 또는 electrophysiological 레코딩을위한 Drosophila 배아의 neuromusculature를 제공​​합니다. 그것은 신경근육학 개발 초기에 이벤트를 공부하거나 부화 수없는 돌연변이의 전기 생리학을 수행하는 데 유용합니다.

수확 및 준비 Drosophila</emElectrophysiological 녹화 및 기타 수속을위한> 태아

기술은 애벌레와 어른의 뛰는 심장을 시각화에...

에 잔 심장을 떠올리 Drosophila</em

우리는 개최 준비하는 절차를...

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

이 비디오는 파리의 성인 심장 또는 초파리 등쪽 혈관이라고 불리는 것을 설명합니다. 주요 프로토콜은 살아있는 심장 준비를 위한 해부 절차를 보여줍니다.

Preparation of Drosophila Heart: A Technique to Study Heart Physiology in the Adult Fly(초파리 심장의 준비: 성충 파리의 심장 생리학을 연구하는 기술)

출처: Jeong, S. Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 초파리 배아에서 축삭돌기의 시각화를 보여줍니다. 운동 뉴런의 면역 라벨링, 뉴런 구조를 드러내기 위한 정확한 해부, 미분 간섭 대비 현미경을 통해 축삭 돌기 패턴을 강조하는 상세한 뉴런 구조를 총체적으로 보여줍니다.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila (초파리에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴의 시각화)

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

고전적으로, 마우스 배아 판막 원초의 심내막은 횡단, 관상 또는 시상 절편을 사용하여 분석되었습니다. 판막 형성 영역에서 심내막의 2차원 이미징에 대한 우리의 새로운 접근 방식은 판막 발달 중 심내막의 평면 극성 및 세포 재배열 분석을 가능하게 합니다.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

학습하세요 Drosophila 배아 심장의 전자현미경 준비 방법을. 고정, 포매, 절단, 염색 단계를 통해 심장 루멘과 기저막의 초미세 구조를 관찰할 수 있습니다.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

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