의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

이 영상에서는 초파리 배아 심장을 대상으로 하는 투과 전자 현미경(TEM) 분석 방법을 설명합니다. 심장은 세포 이동, 세포 간 접착 및 세포 모양 변화를 연구하기 위한 가치 있는 모델 시스템으로 부상했습니다. 이 기술을 통해 심장 내강의 모양뿐만 아니라 세포막, 세포 간 접합 및 기저막과 같은 초미세 구조 성분을 시각화할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면, 초파리 배아의 투과 전자 현미경 관찰에 적합한 고정액을 준비합니다. 다음으로, 코팅된 0~20시간령의 수집 배아들을 고정액에 넣습니다. 과정이 완료되면, 배아를 고정액에서 꺼내어 양면테이프에 부착해 처리하기 쉬운 상태로 만듭니다.

탈이온 버퍼가 담긴 페트리 접시에서 배아를 버퍼 속에 띄운 후 피펫으로 회수합니다. 그 다음 배아를 후고정하고 탈수 기울기 과정을 거칩니다. 레진으로 침투시킨 후, 배아를 임베딩 몰드로 옮겨 정렬시킵니다.

결과물로 얻은 블록을 다이아몬드 나이프로 절단합니다. 절편을 구리 그리드 위에 올리고, 염색 후 검사합니다. 안녕하세요, 저는 뉴저지 의과대학 및 치과대학 로버트 우드 존슨 의과대학 병리학 및 실험의학과의 Sunita Kramer 교수 연구실 소속 Nadine Lop입니다.

저는 PON 병리학과의 전자현미경 전문가 Raj Patel입니다. 오늘은 투과전자현미경을 위한 oph 배아의 전처리 및 이미징 절차를 보여드리겠습니다.

저희 실험실에서는 초파리 심장 형태 형성 과정을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

초파리 배아를 다루기 전에 배아 고정을 위한 헵탄 투과법(Heptane permeation method)용 고정액을 새로 준비하십시오. 흄 후드 내에서 Cate 완충액에 12.5% glutaraldehyde가 포함된 갓 제조한 용액 2 mL를 유리 신틸레이션 바이알에 피펫으로 분주합니다. 여기에 ADA heptane 8 mL를 넣고 격렬하게 흔들어 섞습니다.

그 후 1분 동안 기다립니다. 두 층이 분리되면 상층에는 고정액인 글루타르알데하이드로 포화된 ADA 헵탄이 포함됩니다. 상층을 깨끗한 바이알에 옮겨 담고 따로 보관하십시오. 0~20시간 된 배아를 수집하려면 탈착 가능한 메쉬 삽입물이 있는 작은 바스켓 형태의 배아 수집 챔버를 사용하십시오.

먼저 배아가 들어 있는 포도 주스 플레이트를 꺼내고 죽은 초파리를 제거하십시오. 그런 다음 물과 붓을 사용하여 포도 주스 플레이트에서 배아를 떼어내고, 물이 담긴 스퀘어 병을 이용해 배아 수집 챔버로 배아를 옮기십시오.

포도 주스 플레이트에서 배아에 남아 있는 과잉 효모를 씻어냅니다. 배아를 50% 표백제 용액에 2~3분 동안 또는 배아가 표면으로 떠오를 때까지 담가 외배엽막을 제거합니다. 증류수로 충분히 헹군 후 페이퍼 타월 위에서 배아의 물기를 제거합니다.

포셉을 사용하여 코팅된 배아가 부착된 메쉬 인서트를 집어 올립니다. 인서트를 고정액에 넣어 배아가 메쉬에서 떨어지게 합니다. 4°C에서 오비탈 로커로 혼합하며 배아를 1시간 30분 동안 고정합니다.

배양이 완료되면, 고정액을 최대한 적게 포함하도록 배아를 양면테이프가 깔린 페트리 접시에 옮깁니다. 접시를 흔들어 배아가 단층으로 퍼지게 한 다음, 헵탄이 증발하도록 화학 흄후드에 넣습니다. 배아가 건조되면 0.1% tween hand de vize가 포함된 완충액으로 배아를 덮어줍니다.

해부 현미경 하에서 뭉툭한 텅스텐 바늘을 사용하여 16단계 후기의 배아를 처리합니다. 고정된 배아는 부유하며 파스퇴르 피펫으로 회수할 수 있습니다. 배아를 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 배아를 0.1 M CAC 완충액으로 세척한 후, 실온에서 1% Osmium tetroxide로 1시간 동안 후고정합니다.

배양 후, 배아를 Cate 완충액으로 헹굽니다. 다시 한번 에탄올과 아세톤의 단계별 농도 시리즈를 이용하여 배아를 탈수시킵니다. 50% ethanol에서 10분 동안 시작하여 70% Ethanol에서 10분 동안 처리한 다음, 90% acetone에서 10분 동안 탈수시키고, 마지막으로 100% acetone 단계에서 각각 10분씩 처리합니다.

아세톤을 제거합니다. ein 수지(spray resin)와 아세톤을 1:1 비율로 혼합하여 첨가함으로써 침투 과정을 시작합니다. 샘플이 진공 압력 하에 있는지 확인하고 3분 동안 마이크로파를 조사합니다.

진공 압력을 5분 더 유지하십시오. 레진-아세톤 혼합물을 100% 레진으로 교체하고 진공 압력 하에서 다시 마이크로웨이브 처리를 하십시오. 레진을 교체하고 압력 하에서 마이크로웨이브 처리를 하십시오.

총 세 번의 침투 단계를 위해 마지막으로 반복합니다. 배아를 마이크로 원심 분리 튜브에서 실리콘 임베딩 몰드로 옮깁니다. 배아의 후단이 몰드의 테이퍼진 가장자리와 일직선이 되도록 배아들을 한 줄로 정렬합니다.

베이컨을 70 °C 오븐에서 하룻밤 동안 처리합니다. 그 후, 절편 제작을 위해 생성된 블록을 꺼냅니다. 마이크로톰을 사용하여 배아를 1 µm 두께의 절편으로 자릅니다.

블록을 절단하여 배아에 도달하면, 루프를 사용하여 단일 절편을 유리 슬라이드로 옮겨 시각화 전에 심장을 관찰하기 위한 적절한 깊이에 도달했는지 확인합니다. 핫플레이트에서 절편을 짧게 가열하고, 슬라이드에 메틸렌 블루 한 방울을 떨어뜨린 후 다시 짧게 가열하여 절편을 염색합니다.

다시 탈이온수로 헹군 후, 원하는 절단 깊이에서 현미경으로 절편을 관찰하십시오. 공간 제약을 충족하기 위해 광학 현미경으로 심장 내강이 식별되어야 합니다. 배아 심장이 보이는 횡단면 배아가 최대 5개 포함되도록 블록을 다시 다듬으십시오.

마이크로톰을 사용하여 90 nanometer 두께로 절편을 제작합니다. 구리 그리드에 여러 개의 절편을 올립니다. 그리드를 3% al acetate로 10분 동안 염색한 후, 증류수로 3회 헹굽니다.

이제 수산화나트륨 펠렛이 들어 있는 챔버에서 이산화탄소가 없는 환경을 조성한 후, 그리드를 리드 시트레이트로 2분 30초 동안 염색합니다. 배양 후, 증류수로 3회 세척하십시오. 전자현미경을 사용하여 80 kilovolts에서 절편을 관찰하고 CCD 카메라로 촬영합니다.

절단 깊이와 스테이징이 적절하게 수행되었는지 확인하기 위해, 등쪽 중앙선의 두 심장 모세포(cardio blast) 사이에 성숙한 심장 내강이 형성되었음이 분명하게 나타나야 합니다. 세포막이 온전한지 확인하려면 심장 내강에 세포외 기질이 존재하는지 검사하고, 크리스테와 미토콘드리아의 존재 여부를 확인하십시오. 지금까지 초파리 배아 심장의 미세 구조를 결정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때

초파리 배아의 단계를 적절하게 구분하고, 레진 성분을 정확하게 측정하여 잘 혼합하는 것이 중요하다는 점을 기억하시기 바랍니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.