Photobleaching 후 두 광자 형광 복구를 통해 확산 계수 측정

다광자 형광. 광표백 절차 후 회복은 형광 염료 분자의 자유롭게 확산되는 샘플로 쉽게 입증됩니다. 먼저, 저강도 레이저 빔을 샘플로 보내 레이저의 초점 부피 내에 있는 D 분자로부터 기준 수준의 형광을 생성합니다.

다음으로, 짧은 고강도 레이저 섬광이 초점 부피 내의 염료 분자 일부를 광표백으로 보냅니다. 마지막으로, 레이저 빔은 이전의 낮은 강도 수준으로 감쇠되고 광표백 분자가 바깥쪽으로 확산되고 초점 부피 외부의 정지된 형광 분자로 대체됨에 따라 형광이 모니터링됩니다. 결과 형광을 시간 곡선의 함수로 분석하여 확산 계수를 산출합니다.

안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 의생명공학과 에드워드 브라운 연구실의 켈리 설리번입니다. 오늘은 광표백 후 다광자 형광 회수를 수행하는 방법을 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 기술을 사용하여 시험관 내 및 생체 내 생물학적 시스템 모두에서 확산을 연구합니다.

시작하겠습니다. 시작하려면 원하는 레이저 파장을 설정하고 광 증배관 또는 PMT 앞에 적절한 필터를 삽입합니다. 다음으로 pcal 셀의 손상을 방지하려면 레이저 출력을 200밀리와트 이하로 조정하십시오.

pcal cell의 상류에 그림 4를 향한 두 개의 거울이 있습니다. 이러한 미러는 pcal cell을 통해 레이저 빔을 정렬하는 데 필요하고 충분합니다. pcal cell bias controller의 전압 오프셋을 0으로 설정하고, 레이저가 전면 및 후면 창의 중앙에 오도록 pcal cell을 통과하는 레이저 경로를 조정합니다.

그림 4의 미러 업스트림을 사용하여 전면 창의 중앙에 빔을 배치하고 그림 4의 미러 다운스트림을 사용하여 빔을 후면 창의 중앙에 배치합니다. 이제 pcal 셀 결정의 전압을 최대값으로 설정합니다. 적절한 값은 파장에 따라 다르며 pcal cell 사용 설명서에서 찾을 수 있습니다.

pcal 셀의 출력 전력이 최대화될 때까지 pcal 셀의 업스트림에 있는 그림 4의 미러를 조정합니다. 이제 크리스털 양단의 전압을 0으로 전환하고 바이어스 컨트롤러의 전압 오프셋을 조정하여 pcal 셀의 출력 전력을 최소화합니다. pcal 셀에 입사한 레이저 출력을 실험에 필요한 값으로 되돌립니다.

이제 현미경으로 이동하여 표준화된 형광 샘플에 대한 시각적 초점을 잘 맞춥니다. 여기서 우리는 고정된 형광 꽃가루 알갱이를 사용하고 있습니다. 초점이 맞춰지면 현미경을 밀봉하고 pcal cell crystal 양단의 전압을 변경하여 샘플 이미징에 적합한 수준으로 레이저 출력을 조정합니다.

마지막으로 조명을 끄고 PMT를 켭니다. 표준화된 샘플의 반복 이미지 스캔을 시작하고 샘플의 선명한 이미지를 얻을 때까지 pcal 셀의 다운스트림에서 미러를 조정합니다. 이제 샘플 내에서 안전 모니터가 민중의 초점을 강화하는 방법을 살펴보겠습니다.

이 비디오의 목적을 위해 유리 슬라이드의 움푹 들어간 곳에 보관되고 커버 슬립으로 덮인 수성 염료 샘플을 사용합니다. 샘플 내에서 형광을 생성하기 위해 레이저를 낮지만 합리적인 출력으로 감쇠합니다. 현미경을 밀봉하고 PMT의 출력을 광자 계수기로 전환합니다.

조명을 끄고 PMT를 켠 다음 현미경 소프트웨어에서 포인트 스캔을 시작합니다. 예상되는 형광 회수 시간보다 훨씬 긴 시간 척도에 걸쳐 적분하도록 광자 계수기를 설정하고 합리적인 수의 데이터 포인트를 기록합니다. 전력을 높이고 다른 일련의 광자 수 데이터를 가져옵니다.

광자 수의 증가가 크게 감소하는 것처럼 보일 때까지 전력을 계속 증가시킵니다. 전력 증가 플롯과 관련하여, 광자의 로그는 전력 로그의 함수로 계산됩니다. 2의 경사에서 벗어나면 백화를 나타냅니다.

모니터 중에 이 컷오프 아래에 있는 적절한 모니터 전원을 선택하십시오. 이제 멀티채널 스케일러와 펄스 발생기에 대한 입력 파라미터를 결정해 보겠습니다. 펄스 발생기에서.

사전 티치 시간을 예상 절반 회복 시간보다 1-2배 더 크게 설정하고 표백제 시간을 스케일러에서 예상 절반 회복 시간의 10분의 1로 설정합니다. 빈 너비를 표백제 기간의 약 절반으로 설정하고 레코드당 빈 수를 설정하여 선택한 빈 너비와 레코드당 빈 수가 예상 전체 복구 시간보다 크도록 합니다. 또한 프리블 및 표백제 시간은 펄스 생성기로 돌아가 프리블 및 표백제 시퀀스의 주파수를 빈 너비의 곱에 레코드당 빈 수를 곱한 값보다 약간 작은 값으로 설정합니다.

마지막으로, 선택한 모니터 전력에서의 신호 강도에 따라 스케일러에서 스캔당 레코드 수를 설정합니다. 이제 모니터 전원을 안전한 수준으로 설정하고 표백 테스트를 수행하는 동안 결정된 표백 컷오프보다 약 200밀리와트 높은 표백 전력을 설정합니다. 이러한 힘은 둘 다 알루미늄 셀 크리스탈 씰을 가로질러 서로 다른 전압으로 설정되며 현미경은 조명을 차단합니다.

PMT를 켭니다. 이미징 소프트웨어에서 포인트 스캔을 시작합니다. 그런 다음 펄스 발생기와 스케일러를 시작합니다.

결과 회복 곡선을 분석하려면 세 가지 중요한 점을 표시하십시오. preble 형광, 표백제 직후 형광 및 데이터 세트 끝에 있는 형광. 표백제 전후의 형광 값을 사용하여 절반의 회복 시간을 더 잘 추정할 수 있습니다.

이제 이전 단계에서 설명한 규칙을 사용하여 preble bleach 및 begin width durations의 값을 업데이트합니다. 새로운 곡선을 선택하고 결과 곡선이 강한 표백제와 부드러운 회복을 나타낼 때까지 매개변수를 계속 조정합니다. bleach depth 매개변수의 log를 log of power의 함수로 플로팅하여 excitation saturation을 확인합니다.

기울기가 2인 경우 편차가 있으면 여기 포화 상태를 나타냅니다. 강한 표백제를 생성하지만 포화를 일으키지 않는 표백제를 선택하십시오. 마지막으로, 적절한 파라미터를 결정한 후 관심 샘플의 광표백 또는 MP FP 곡선 후 다중 광자 형광 회수를 계속합니다.

이제 피팅된 정규화된 MP F wrapp 곡선에서 원시 MP frap 데이터, 확산 계수, 원시 MP F frap 데이터가 나타내는 강력한 표백제 및 부드러운 회복 모두의 대표적인 결과를 보여드리겠습니다. 전체 복구는 데이터에 맞게 데이터의 후반부에 대해 보고됩니다. 먼저 회수율을 평균 preble 형광으로 정규화한 다음 비선형 임대 제곱 피팅을 수행합니다.

적절한 모델과 관련하여. 두 데이터 세트 모두 수성 플루오레세인(aqueous fluorescein) 및 수율 확산 계수(yield diffusion coefficients)에서 수집되었습니다. 문헌과 일관되게 광표백 실험 후 다광자 형광 회수를 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 실험 매개변수, 특히 표백 기간과 표백 및 모니터링 권한을 프로토콜에 정의된 안전 한계까지 주의하고 설정하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.