라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

여기서 배아를 수집하는 절차를 살펴보겠습니다. 바이알에서 파리를 꺼내 5구 수집 챔버의 튜브로 옮깁니다. 그다음 챔버 위에 포도 농업용 플레이트를 올리고 파리가 몇 시간 동안 알을 낳도록 둡니다.

배아가 적절한 단계에 도달하면, 붓을 사용하여 그레이프 플레이트에서 양면 테이프로 옮깁니다. 이제 배아를 콘 밖으로 굴려 배측(ventral side)이 아래로 향하게 하여 한천 블록 위에 일렬로 세웁니다. 중앙을 보면 왁스 직사각형과 양면 테이프 조각이 부착된 슬라이드가 있습니다. 양면 테이프의 한쪽 끝을 배아가 늘어선 블록 위로 뒤집어 배아에 접촉시켜 슬라이드로 옮깁니다.

이제 배아들이 즉시 등 쪽이 위로 향하게 됩니다. 왁스 사각형으로 둘러싸인 슬라이드 영역에 PBS를 추가하여 배아를 덮습니다. 위쪽은 슬라이드의 측면도이며 아래쪽은 평면도입니다.

유리 해부침을 사용하여 난막(viel membrane)을 따라 절개합니다. 배아의 뇌 영역을 찔러 들어 올린 후, 유리판 위에 일렬로 배치합니다. 그 다음 각 배아를 해부하여 필레(filet) 형태로 만듭니다.

절차가 끝나면 필렛 처리된 배아가 여러 줄로 배열된 슬라이드가 준비됩니다. 이제 고정 단계로 넘어갈 준비가 되었습니다. 안녕하세요, 저는 Caltech 생물학부 Kaizens 연구실의 포닥 피터 리(Peter Lee)입니다.

안녕하세요, 저는 Caltech Kaizen 연구실의 대학원생 Ashley Wright입니다. 저는 Caltech의 교수인 Kaizen이며, 저희 연구팀은 초파리의 신경계 발달 연구를 수행하고 있습니다. 오늘은 살아있는 opal 배아를 해부하는 절차를 보여드리겠습니다.

저희는 이러한 방법들을 사용하여 고아 수용체(orphan receptor) 리간드를 탐색해 왔습니다. 수용체 융합 단백질을 이용해 배아를 생체 염색함으로써, 세포 표면 단백질이 과발현된 세포주 컬렉션을 스크리닝하는 방식으로 이를 수행합니다. 또한 저희 연구실에서는 배아의 표현형을 연구하고 유전적 스크리닝을 실시하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.

저는 안내 표현형에 대한 운동 행동 결핍 스크리닝을 수행했습니다. 이제 시작하겠습니다. Peter가 구체적인 방법을 보여드릴 것입니다.

먼저, 스패튤라를 사용하여 배아 수집 챔버의 각 배럴에 해당하는 포도 농업용 알 수집 플레이트에 효모 페이스트를 소량 도포합니다. 다음으로, 초파리 바이알에 이산화탄소 가스를 주입하여 초파리를 마취시킵니다. 수백 마리의 초파리를 수집 챔버로 직접 옮깁니다.

그 다음 챔버를 알 수집 플레이트로 덮고 아래로 누릅니다. 20인치 길이의 라벨링 테이프를 사용하여 한천 플레이트의 중앙부터 시작해 챔버와 플레이트를 함께 고정합니다. 테이프는 알 수집 플레이트 위로 겹쳐지게 됩니다. 파리가 깨어나면, 수평 상태로 어두운 실온에서 2~3시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 파리를 아래로 쳐서 내린 후 수집 플레이트를 교체합니다.

제거한 플레이트의 각 섹터에 배아가 100개 미만인 경우, 충분한 수의 배아가 수집될 때까지 2시간 간격의 수집을 계속 수행하십시오. 수집된 배아는 동봉된 서면 프로토콜의 사양에 따라 풀링(pooling)할 수 있습니다.

배아를 노화시키려면, 90 mm 원형 여과지를 물에 적셔 페트리 접시 뚜껑에 놓고, 그 위에 배아가 담긴 수집 플레이트를 뒤집어 놓습니다. 원하는 온도에서 원하는 기간 동안 플레이트를 배양하십시오. 슬라이드에 양면테이프를 붙여 배아의 단계 설정 및 분류를 위한 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 S 슬라이드 위에 직사각형 모양의 그레이프 아가(grape agar) 조각을 올립니다.

에거(egger)는 10~15개의 배아가 5~10줄로 들어갈 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 배아가 원하는 단계에 도달하면 인큐베이터에서 배아를 꺼냅니다. 수집 플레이트에서 숙성된 배아를 양면테이프로 옮깁니다.

젖은 붓을 사용하여 배아를 테이프 위에 고르게 펼칩니다. GFP 해부 현미경을 통해 SOAR 배아의 적절한 GFP 발현 여부를 확인하여 유전자형을 판별합니다. 본 실험에서는 balancer curly arm, GFP의 발현이 없는 배아를 선택함으로써 유전자형 분석을 수행합니다.

배아 유전자형 분석은 사용되는 밸런서(balancer)에 따라 달라지므로, 수행 방법에 대한 자세한 내용은 첨부된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 다음 단계로, 끝이 뭉툭한 해부용 바늘을 사용하여 배아를 양면테이프 위에서 부드럽게 굴려 고정합니다. 16단계에서 장은 세 개의 띠 형태로 나뉩니다.

이후 장은 꼬리 근처에서 대각선 띠 형태의 발달을 시작하고, 이어 말리면서 배아가 더 뚜렷해집니다. 다음으로, 해부침을 사용하여 각 배아를 난막이나 다른 배아 위에서 굴립니다. 테이프에 닿지 않도록 주의하며 배아를 들어 올려 포도당 아가 플레이트로 옮깁니다.

코팅된 배아들을 한쪽 면이 한천 슬랩에 닿게 하고 후단이 아래를 향하도록 슬랩 위에 정렬합니다. 그다음 젖은 거름종이가 깔린 페트리 접시에 슬라이드를 넣고 배아가 원하는 연령에 도달할 때까지 실온에서 배양합니다. 해부를 위해, 양면테이프를 작은 직사각형 모양으로 잘라 생체 해부용 슬라이드를 준비합니다. 왁스 펜을 사용하여 슈퍼 프로스트 플러스(super frost plus) 슬라이드의 한쪽 끝 근처에 테이프를 부착합니다.

테이프 주변으로 슬라이드 너비만큼이며 길이는 30 to 40 millimeters인 직사각형을 그립니다. 왁스와 테이프 사이에는 약 3 millimeters의 공간이 있어야 합니다. 그런 다음 슬라이드를 뒤집어 정렬된 배아 위에 조심스럽게 내려놓아 테이프가 배아에 닿게 함으로써, 그레이트 플레이트 슬랩(great plate slab)에서 테이프로 배아를 옮깁니다.

배아의 후단이 아래쪽을 향하도록 배치해야 합니다. 이송 후 배아가 슬라이드 위에서 등쪽이 위를 향하게 놓이면, 인젝션 니들과 같이 니들 풀러로 제작한 유리 해부침을 사용하여 왁스 사각형을 채울 때까지 배아 위에 XPBS를 추가합니다. 배아의 후단부터 시작하여 등쪽 정중선을 따라 절개합니다.

이제 배아의 앞쪽 끝을 찔러 들어 올립니다. 아래쪽부터 시작하여 배아를 버퍼 용액에 담근 상태로 테이프 스트립의 오른편으로 옮깁니다. 이러한 해부 및 이동 과정을 반복하여, agri slab의 각 행과 일치하도록 슬라이드 위에 배아들을 질서 있게 한 줄로 배열합니다.

해부침을 사용하여 체벽의 플랩을 슬라이드 위로 부드럽게 누릅니다. 이때 표면의 조직이 늘어나거나 제거되지 않도록 주의하십시오. 바늘은 체벽 등쪽 가장자리의 전단과 후단 모서리에만 닿아야 합니다.

운동 신경 축삭은 이만큼 뻗어 있지 않기 때문입니다. 등쪽으로는 슬라이드의 바늘 부분에 닿지 않도록 주의하십시오. 모든 배아를 전이하여 슬라이드에 고정한 후에는 바늘이 부러질 수 있기 때문입니다. 뇌 영역에서 네 개의 장관을 절단하고 장 전체를 배아에서 끌어내어 각 배아의 장을 제거하십시오.

후장을 슬라이드 위로 밀어냅니다. 모든 해부가 완료되면, 파스퇴르 피펫 두 개를 사용하여 상온의 5% formaldehyde를 왁스 직사각형의 한쪽 모서리에 동시에 주입하고, 반대쪽 모서리에서 용액을 제거합니다. 총 약 6 mL의 부피를 사용하여 고정액을 세 번 교체합니다.

배아를 고정액에 넣고 45분 동안 배양합니다. 메니스커스(액체 표면의 곡면)가 배아에 닿으면 배아가 파괴되므로 주의하는 것이 매우 중요합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 고정액의 대부분을 제거합니다.

두 개의 파스퇴르 피펫법을 사용하여 PBS로 3회 세척합니다. 그 후 PBT로 3회 세척하여 배아를 투과성 있게 만듭니다. 이 단계는 배아가 메니스커스에 덜 민감하게 만드는 역할도 합니다.

마지막 세척 후, 슬라이드를 기울여 PBT를 조심스럽게 제거하고 왁스로 둘러싸인 영역의 모서리에 Kimwipe를 짧게 접촉시켜 과잉 용액을 제거합니다. 미리 분주된 피펫맨을 사용하여 블로킹 용액 200 µL를 즉시 첨가하고 상온에서 10~30분 동안 블로킹합니다. 이후 Kimwipe를 사용하여 블로킹 용액을 닦아냅니다.

그 다음, 블로킹 용액에 희석한 원하는 1차 항체 200 microliters를 즉시 첨가합니다. 슬라이드를 습윤 플레이트에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 본 실험에서는 운동 뉴런 축삭을 표지하기 위해 단클론 항체 1D4를 사용합니다.

다음 날, 4 °C에서 디쉬를 꺼내고 로킹 플랫폼 위에서 PBT를 사용하여 배아를 3회 세척하며, 세척당 최소 15분 동안 진행합니다. 모든 세척 단계에서 로킹 중에 슬라이드가 완전히 잠길 수 있도록 충분한 양의 PBT가 있는지 확인하십시오. 배아 세척이 끝나면 이전과 동일하게 슬라이드를 블로킹합니다.

블로킹 후 즉시 2차 항체와 블로킹 용액 200 µL를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 여기서는 Alexa 488 goat anti-US 2차 항체가 사용되었으며, 이는 로다민(rhodamine)과 함께 근섬유를 표지하는 데 사용됩니다. 다시 한번 로킹 플랫폼 위에서 PBT로 회당 최소 15분씩 3회 세척합니다.

슬라이드를 다른 트레이로 옮겨 잔류 세제를 제거합니다. 그 다음 PBS로 5분 동안 두 번 세척합니다. PBS에서 슬라이드를 꺼내고, 킴와이프(chem wipe)로 웰에 남아 있는 PBS의 대부분을 닦아낸 후, 즉시 70% glycerol 500 microliters를 첨가합니다.

글리세롤은 배아와 굴절률이 동일하므로, 이 단계를 수행하면 염색 결과가 더 잘 보이게 됩니다. 배아를 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 투명화하십시오. 그 후 킴와이프로 글리세롤을 제거합니다. 글리세롤을 거의 모두 제거하면 배아가 평평해지며, 적게 제거하면 더 3차원적인 구조를 유지하게 됩니다.

글리세롤을 제거한 후, 1번 커버슬립을 덮습니다. 이제 배아를 이미징할 준비가 되었으며, 해부 및 염색된 배아는 면역형광현미경으로 관찰할 수 있습니다. 여기서는 운동 신경 축삭 표지 항체인 1D4로 염색된 해부된 배아를 보여줍니다.

이 이미지는 면역형광법을 이용한 시각화에 HRP 면역조직화학법이 사용된 일반적인 이미지들과 외관상 유사합니다. 운동 신경 축삭 분지의 세부 사항을 더 명확하게 확인할 수 있는 더 고품질의 이미지를 얻는 것이 가능합니다. 액틴에 결합하는 rho domine 표지 phin으로 공동 염색하면 근육을 동시에 시각화할 수 있습니다.

이는 HRP 염색으로 얻을 수 있는 것보다 근육의 층 구조와 조직을 더 명확하게 보여줍니다. 여기에서 1D-4 운동 뉴런 축삭은 녹색으로, 근육은 빨간색으로 표시되어 있습니다. 지금까지 돌연변이 계통 모음에서 살아있는 초파리 배아를 박리하는 방법을 시연하였습니다. 이러한 절차를 수행할 때는 lio, armadillo, GFP balanced stock과 같이 다루기 쉬운 계통부터 시작하여 한 번에 몇 가지 계통씩만 진행하는 것이 중요합니다.

해부 숙련도가 높아지고 속도가 빨라지면 하루에 최대 10개 라인까지 처리할 수 있으며, 이를 통해 약 20일의 기간 동안 200여 개의 돌연변이 라인 컬렉션을 스크리닝할 수 있습니다. 따라서 모든 단계를 능숙하게 수행하게 되면 매우 효율적인 절차가 됩니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.