라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

여기에서 배아를 수집하는 절차를 볼 수 있습니다. 바이알에서 5개의 배럴이 있는 수집 챔버의 튜브로 파리를 옮깁니다. 그런 다음 챔버 위에 포도 농업 접시를 놓고 파리가 몇 시간 동안 알을 낳을 수 있도록합니다.

배아가 올바른 단계에 이르면 포도 열매에서 붓으로 이중 스틱 테이프로 옮깁니다. 이제 배아를 콘에서 굴려 배쪽과 함께 한천 블록에 정렬합니다. 가운데 위에는 직사각형의 왁스와 이중 스틱 테이프 조각이 있는 슬라이드가 보입니다.한쪽 끝에는 배아가 정렬된 블록 위에 이중 스틱 테이프를 뒤집고 배아에 터치하여 슬라이드로 옮깁니다.

이제 등쪽이 즉시 위로 향하게 됩니다. 배아를 덮을 수 있도록 왁스 사각형으로 둘러싸인 슬라이드 영역에 PBS를 추가합니다. 위쪽은 슬라이드의 측면 뷰를 보여주고 아래쪽은 위쪽 뷰를 보여줍니다.

유리 절개 바늘로 viel membrane을 따라 슬릿을 자릅니다. 배아를 뇌 부위에 찔러넣고, 들어올려 유리잔 위에 줄지어 놓는다. 그런 다음 각 배아를 해부하여 필렛을 만듭니다.

절차가 끝나면 필레 배아 줄이 있는 슬라이드가 나타납니다. 이제 수정할 준비가 되었습니다. 안녕하세요, 저는 Caltech 생물학과의 Kaizens 실험실의 포스터인 Peter Lee입니다.

안녕하세요, 저는 Kaizens Lab의 Caltech 대학원생인 Ashley Wright입니다. 저는 캘리포니아 공과대학(Caltech)의 카이젠(Kaizen) 교수이며, 제 연구 그룹은 초파리의 신경계 발달에 대해 연구하고 있습니다. 오늘은 살아있는 오팔 배아를 해부하는 절차를 소개해 드리겠습니다.

우리는 이러한 방법을 사용하여 고아 수용체 리간드를 검색했습니다. 우리는 수용체 융합 단백질이 있는 배아의 라이브 염색을 통해 세포 표면 단백질을 발현하는 세포 표면 단백질을 통해 세포 표면 단백질을 발현하는 세포 집단을 스크리닝하여 이를 수행합니다. 또한 실험실에서 이 절차를 사용하여 배아 표현형을 연구하고 유전자 스크리닝을 수행합니다.

저는 안내 표현형에 대한 운동 작용에 대한 결핍 검사를 수행했습니다. 시작하겠습니다. 피터가 어떻게 하는지 보여줄게요.

시작하려면 주걱을 사용하여 배아 채취 챔버의 각 배럴에 해당하는 포도 농업 계란 수집 플레이트에 효모 페이스트 한 점을 놓습니다. 다음으로, 파리 바이알에 이산화탄소 가스를 주입하여 파리를 재웁니다. 수백 마리의 파리를 수집 챔버로 직접 옮깁니다.

그런 다음 난자 수집 플레이트로 챔버를 덮고 20인치 길이의 라벨링 테이프 스트립을 사용하여 한천 플레이트의 중앙에서 시작하여 챔버와 플레이트를 함께 누릅니다. 테이프는 난자 수집 플레이트에서 겹칩니다. 파리가 깨어난 후, 배양 후 수평 위치에서 2-3시간 동안 어두운 곳에서 실온에서 부화한 다음 파리를 아래로 두드리고 수집 플레이트를 교체합니다.

제거된 플레이트의 각 섹터에 100개 미만의 배아가 존재하는 경우. 충분한 배아가 수집될 때까지 2시간 동안 계속 채취합니다. 수집된 배아는 동봉된 서면 프로토콜의 사양에 따라 풀링될 수 있습니다.

배아를 노화시키려면, 90mm 원형 여과지의 젖은 조각을 페트리 접시의 뚜껑에 놓고 배아가 거꾸로 된 채취 플레이트를 놓습니다. 원하는 기간 동안 원하는 온도에서 플레이트를 배양하고 슬라이드에 양면 접착 테이프를 붙여 배아 준비 및 분류를 위한 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 S 슬라이드에 직사각형의 포도 한천 조각을 놓습니다.

알은 10-15개의 배아로 구성된 5-10줄을 수용할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 배아가 원하는 단계에 도달하면 인큐베이터에서 배아를 제거합니다. 노화된 배아를 채취 플레이트에서 양면 접착 테이프로 옮깁니다.

젖은 붓을 사용하여 배아를 테이프 전체에 고르게 펴 바릅니다. GFP 해부 현미경에서 유전자형을 나타내는 적절한 GFP 발현을 위한 SOAR 배아. 이 실험에서는 밸런서 중절팔(aggly arm, GFP)의 발현이 부족한 배아를 선택하여 유전형 분석을 수행합니다.

배아 유전형 분석은 사용되는 밸런서에 따라 다르므로 이를 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오. 걸음. 다음으로, 무딘 해부 바늘을 사용하여 양면 접착 테이프를 가로질러 배아를 부드럽게 굴려 배아를 코팅합니다. 16단계에서 장은 세 개의 띠로 나뉩니다.

그 후, 장은 꼬리 근처에 대각선 띠를 형성하기 시작하고 그 다음에는 코일을 감고 배아가 더 깨끗해집니다. 다음으로, 절개 바늘을 사용하여 각 배아를 코리온 또는 다른 배아 위로 굴립니다. 테이프와의 접촉을 피하고 배아를 들어 올려 포도 한천 판으로 옮깁니다.

이 슬래브에 코팅된 배아를 한천 슬래브에 대고 뒤쪽 끝이 아래를 향하도록 등쪽에 맞춥니다. 그런 다음 젖은 여과지가 있는 페트리 접시에 슬라이드를 넣고 원하는 연령에 도달할 때까지 배아를 실온에서 배양합니다.해부를 위해 작은 직사각형 양면 접착 테이프 조각을 잘라 생체 해부용 슬라이드를 준비합니다. 왁스 펜을 사용하여 Super Frost plus 슬라이드의 한쪽 끝 근처에 테이프를 놓습니다.

슬라이드 너비와 테이프 주위에 30-40mm 길이의 직사각형을 그립니다. 왁스와 테이프 사이에는 약 3mm의 공간이 있어야 합니다. 그런 다음 슬라이드를 뒤집어 줄지어 있는 배아 위로 부드럽게 내려 테이프가 접촉하도록 하여 그레이트 플레이트 슬래브의 배아를 테이프로 옮깁니다.

배아는 뒤쪽 끝이 아래로 향하도록 방향을 잡아야 합니다. 이식 후, 배아는 슬라이드의 등쪽이 위로 향하게 배치되고 즉시 배아 위에 하나의 XPBS를 추가하여 주사 바늘과 같은 바늘 풀러에 만들어진 유리 해부 바늘을 사용하여 왁스 직사각형을 채웁니다. 배아의 뒤쪽 끝에서 시작하여 등쪽 정중선을 따라 자릅니다.

이제 배아의 앞쪽 끝을 찌르고 들어 올립니다. 맨 아래부터 시작하여 배아를 테이프 스트립의 오른쪽으로 옮겨 버퍼에 보관합니다. 배아를 계속 해부하고 이식하여 농업 슬래브의 각 행과 일치하는 슬라이드에 배아를 질서 정연하게 만듭니다.

해부 바늘을 사용하여 본체 벽의 덮개를 슬라이드에 부드럽게 밀어 넣습니다. 표면에서 재료를 늘리거나 제거하지 마십시오. 바늘은 체벽의 등쪽 가장자리에 있는 전방 및 후방 모서리에만 접촉해야 합니다.

운동 축삭은 이렇게까지 확장되지 않기 때문입니다. 등쪽에서는 모든 배아가 이식되어 슬라이드에 부착된 후 부러질 수 있으므로 슬라이드의 바늘을 만지지 마십시오. 뇌 영역에서 4개의 장을 절단하고 배아에서 장 전체를 당겨 각 배아에서 장을 제거합니다.

뒷내장을 미끄럼틀 위로 옮기십시오. 모든 해부가 완료되면 두 개의 이전 피펫을 사용하여 실온, 5% 포름알데히드를 왁스의 한쪽 모서리, 직사각형에 동시에 전달하고 반대쪽 모서리에서 용액을 제거합니다. 총 부피 약 6 밀리리터를 사용하여 정착액을 3 회 교환합니다.

고정액에서 배아를 45분 동안 배양합니다. 반월판이 배아와 접촉하지 않도록 하는 것이 매우 중요한데, 이는 배아를 파괴할 수 있기 때문이다. 파이펫을 사용하여 대부분의 정착 용액을 제거합니다.

두 개의 목초지 피펫 방법을 사용하여 PB S3로 세 번 세척합니다. 그런 다음 PBT로 세 번 세척하여 배아를 침투시킵니다. 이 단계는 또한 배아를 반월판에 덜 민감하게 만듭니다.

최종 세척 후 슬라이드를 기울여 PBT를 조심스럽게 제거하고 김 물티슈를 왁스로 둘러싸인 부분의 모서리에 잠시 터치하여 여분의 용액을 제거합니다. 사전 로드된 피펫 맨을 사용하여 즉시 200마이크로리터의 차단 용액 블록을 10-30분 동안 추가합니다. 실온에서 Kim 물티슈를 사용하여 차단 용액을 제거합니다.

그런 다음 차단 용액에 희석된 원하는 1차 항체 200마이크로리터를 즉시 첨가합니다. 슬라이드를 가습 접시에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 이 실험에서는 단클론 항체 1D four를 사용하여 운동 축삭을 표지합니다.

다음 날, 섭씨 4도에서 접시를 꺼내 PBT가 있는 흔들 플랫폼에서 배아를 씻을 때마다 최소 15분 동안 세 번 씻습니다. 모든 세척 단계에서 흔들리는 동안 슬라이드가 완전히 잠길 수 있는 충분한 PBT가 있는지 확인하십시오. 배아를 씻은 후 이전과 같이 슬라이드를 막습니다.

차단 후 즉시 200 마이크로 리터의 2 차 항체와 차단 용액을 추가하고 실온에서 2 시간 동안 배양하면 Alexa 4 88이 반미국으로 이동합니다. 2차는 Rodine Phin과 함께 사용하여 근육 섬유를 라벨링합니다. 다시 말하지만, 흔들 플랫폼에서 PBT로 세 번 씻을 때마다 최소 15분 동안 세탁하십시오.

슬라이드를 다른 트레이로 옮겨 잔여 세제를 제거합니다. 그런 다음 PBS로 5분 동안 두 번 씻습니다. 화학 물티슈로 웰에서 남아 있는 PBS의 대부분을 PBS 플롯에서 슬라이드를 제거하고 즉시 500마이크로리터의 70%글리세롤을 추가합니다.

글리세롤은 배아와 동일한 굴절률을 가지므로 이 단계를 수행하면 염색이 더 잘 보이기 때문에 실온에서 2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배아를 투명하게 만듭니다. 그런 다음 김 물티슈로 글리세롤을 제거합니다. 글리세롤을 거의 모두 제거하면 배아가 평평해지는 반면, 글리세롤을 덜 제거하면 더 입체적인 구조를 만들 수 있습니다.

글리세롤이 제거되면 1번 커버 슬립을 착용합니다. 배아는 이미징 준비가 완료되었으며, 절개 및 염색된 배아는 면역형광 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 여기에서 절개된 배아는 항체 1D 4를 표시하는 운동 축삭으로 염색되었습니다.

이 이미지는 면역형광을 사용한 시각화에 HRP 면역조직화학이 사용된 더 일반적으로 볼 수 있는 이미지와 모양이 유사합니다. 운동 축삭 가지의 세부 사항이 더 명확하게 보이는 고품질 이미지를 얻을 수 있습니다. 액틴과 결합하는 rho domine labeled phin으로 염색하면 근육을 동시에 시각화할 수 있습니다.

이것은 근육 층과 조직에 대한 더 명확한 그림을 제공하며 HRP 염색으로 얻을 수 있습니다.여기에서 1D 4 또는 운동 축삭은 녹색 Fein으로 표시되거나 근육은 빨간색으로 표시됩니다. 우리는 방금 돌연변이 계통 집합체에서 살아있는 초파리 배아를 해부하는 방법을 보여주었습니다. 이러한 절차를 수행할 때 lio, armadillo, GFP, 균형 잡힌 주식과 같은 쉬운 라인으로 시작하고 한 번에 몇 줄만 수행하는 것이 중요합니다.

해부에 대해 더 전문적이고 더 빨라짐에 따라 하루에 최대 10개의 라인을 수행할 수 있으며 이를 통해 약 20일 동안 200개 정도의 돌연변이 라인 컬렉션을 스크리닝할 수 있습니다. 따라서 이것은 모든 단계를 실행하는 데 전문가가 되면 정말 매우 효율적인 절차입니다. 여기까지입니다, 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.