셀 Lensless 온 - 칩 영상은 높은 처리량 세포 생물학 및 의료 진단을위한 새로운 도구를 제공합니다

이 영상에서는 Lucas라고 명명된 렌즈 리스트 온칩 이미징의 개념 증명을 보여줍니다. Lucas는 섀도우 이미징 기반의 렌즈 리스트 초광시야 세포 모니터링 어레이 플랫폼을 의미합니다. 기존의 이미징 설정과 달리, Lucas 플랫폼은 현미경 대물렌즈나 다른 부피가 큰 광학 부품을 필요로 하지 않습니다.

Lucas의 경우, 분석 대상 시료를 현미경 슬라이드 위에 배치하고 동일한 커버 글라스로 부드럽게 덮습니다. 진공 펜을 사용하여 시료를 광전자 센서 어레이의 활성 영역에 로딩합니다. 그 후 이미징 플랫폼이 시야 내에 있는 각 관심 세포의 섀도우 또는 렌즈리스 디지털 홀로그램을 기록합니다.

이러한 세포 그림자의 자동 디지털 처리를 통해 용액 내 세포의 종류, 수 및 상대적 위치를 결정할 수 있습니다. 시야 범위는 최대 18 centimeter squared에 달하며, 피사체 심도는 약 5 millimeters입니다. 획득한 회절 이미지는 이후 자체 개발한 결정 알고리즘에 의해 디지털 처리되어 대상 세포 또는 입자의 특성 분석과 식별이 모두 가능해집니다.

Lucas는 이미징 기반 실험의 비용을 절감하고 처리량을 크게 높이는 소형화된 플랫폼을 제공하여, 미세 유체 및 생물학 연구의 최첨단 기술과 호환되도록 합니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 전기공학과의 ROM Bio 및 Nano 연구실 소속이며, 저는 Nano 및 생체광자학 연구실의 Anthony Erlinger입니다. 오늘은 전혈 샘플과 같은 불균질한 SA 용액의 이미징을 위한 고처리량 렌즈 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실의 이 절차는 섀도우 이미징(shadow imaging) 기반의 렌즈 리스트 초광시야 세포 어레이 모니터링 플랫폼(lens list ultra wide field cell array monitoring platform)이라는 새로운 이미징 기술을 활용하며, 이를 줄여서 Lucas라고 부릅니다. 이제 시작해 보겠습니다. 프로세스를 시작하려면, 전혈 3 mL와 5, 10, 20 µm와 같이 다양한 직경의 폴리스티렌 마이크로비즈를 준비하여 30분 동안 실온에 둡니다.

혈청 피펫을 사용하여 희석제로 사용할 RPMI 1640 classic 액체 배지 2 mL를 멸균된 5 mL 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다. 30분간의 침전 시간을 거친 후, 전혈 수집 튜브의 바닥에서 적혈구 시료 10 µL를 취해 RPMI 용액에 옮깁니다. 적혈구 RPMI 희석액에 폴리스티렌 마이크로비즈를 총 20 µL 첨가하고, 조심스럽게 피펫팅하여 세포 용액을 교반합니다. 핀셋을 사용하여 불균일 용액 5~15 µL를 커버스립 위에 옮깁니다.

용액 위에 동일한 두 번째 커버 슬립을 덮습니다. 시료가 두 커버 슬립 사이에 균일하게 샌드위치 형태로 놓여야 합니다. 그런 다음 진공 펜을 사용하여 이미징을 위해 센서 어레이의 활성 영역에 시료를 로드합니다.

그런 다음 0.1% buffered as SNY와 희석된 new methylene blue(NMB) 용액을 2:1의 부피 비율로 혼합하여 수성 염색 시약을 준비하십시오. as SNY 및 new methylene blue 용액의 구체적인 조제 방법은 첨부된 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 그다음 폴리프로필렌 비커에 ACOA 염색 시약과 전혈 시료를 1:1의 부피 비율로 혼합하고, 마그네틱 스터러를 사용하여 2분 동안 섞어줍니다. 이후 5 mL 폴리프로필렌 튜브에 1.99 mL의 RPMI 1640 classic 액체 용액을 넣고, 상온에서 10분 동안 추가로 배양하십시오.

다음으로, 염색된 혈액 용액 10 µL를 RPMI로 옮겨 1:200의 부피 비율이 되게 합니다. 그 후 용액을 30초 동안 vortexing하고, 염색된 세포 용액 10~100 µL를 커버슬립 사이 또는 미세유체 리저버 내로 피펫팅합니다. 그런 다음 진공 펜을 사용하여 시료를 센서 어레이의 활성 영역 위에 배치합니다.

Lucas 플랫폼은 광전자 센서 어레이를 활용하여 무렌즈 세포 홀로그램을 디지털로 기록합니다. 이를 위해 전하결합소자(CCD)가 사용되며, 가변 파장 조명을 가능하게 하기 위해 제논 램프가 장착된 단색화 장치와 표준 등급의 용융 석영 광섬유를 사용합니다. 이는 광섬유 번들과 센서 표면에서 약 5~10 cm 위에 위치한 직경 약 100 µm의 핀홀로 구성되어 가변 파장 조명을 구현합니다. 가변 파장 조명을 통해 세포의 홀로그램 시그니처를 미세 조정할 수 있는 유연한 플랫폼이 제공되며, 두 개 이상의 파장을 병합하여 하이브리드 디지털 시그니처를 합성함으로써 Lucas 이미지의 신호 대 잡음비와 대비를 향상시킬 수 있습니다.

더욱 정밀한 특성 분석을 위해, 두 개의 커버슬립 사이에 끼워진 분석 시료를 센서 어레이의 활성 영역에 로드하고 광원으로 균일하게 조사합니다. 불균일 용액 내의 각 세포 또는 미세 객체의 회절 홀로그램이 센서 어레이에 도달하여 루카스 이미지(Lucas image)를 형성합니다. 획득한 루카스 회절 이미지는 자체 개발한 판정 알고리즘을 통해 처리되며, 이 알고리즘은 통계적 회절 이미지 라이브러리를 사용하여 표적 세포 또는 미세 객체를 자동으로 특성화하고 식별합니다.

이 그림은 5, 10, 20 µm의 폴리스티렌 마이크로비즈와 적혈구가 혼합된 불균일 용액을 일반적인 40배 대물렌즈로 촬영한 이미지입니다. 이 입자들은 3D 형태, 굴절률 및 상호 복잡성이 모두 서로 다릅니다.

이러한 특징 중 일부는 일반 현미경으로 구별할 수 있지만, Lucas 플랫폼에서는 0.5 mm² 미만의 매우 제한된 시야 내에서만 가능합니다. 이러한 모든 미세 입자들은 지문과 같이 고유하게 서로 다른 홀로그램 패턴을 나타냅니다. 따라서 2D 텍스처를 기반으로 모호함 없이 특성을 규명할 수 있습니다.

Lucas는 최대 10~20 cm²에 달하는 초광시야를 모니터링할 수 있습니다. 이는 일반적인 렌즈 기반 현미경보다 수십 배 더 넓은 영역입니다. 이것은 Lucas 플랫폼을 사용하여 염색된 전혈 샘플을 40배 대물렌즈로 촬영한 이미지입니다.

염색된 백혈구의 내부 특징은 세포핵의 굴절률과 산란 특성을 변화시킴으로써 효과적으로 구분할 수 있습니다. 개별 세포의 독특한 회절 패턴이 센서 어레이에 의해 기록됩니다. 이는 현장 진단 세포 분석 및 진단 목적으로서 Lucas 플랫폼이 가진 강력한 도구라는 또 다른 장점을 보여줍니다.

관심 세포의 신속한 특성 분석을 위한 완전 자동화 플랫폼으로서, Lucas 회절 이미지는 자체 개발된 판독 소프트웨어를 통해 디지털로 처리됩니다. 이 그림에서는 적혈구와 마이크로비드의 불균질 혼합물이 인터페이스에 의해 처리되는 과정을 보여줍니다. 이 알고리즘은 고밀도 영역뿐만 아니라 3 µm 비드와 같이 신호 대 잡음비가 낮은 입자를 검출하는 데에도 강력한 성능을 발휘합니다.

Lucas 커스텀 인터페이스에서 처리된 이미지가 여기에 표시되어 있습니다. 이 소프트웨어를 통해 센서 픽셀 크기나 조명 파장과 같은 다양한 사양을 입력할 수 있습니다. 또한, 이미지의 특정 영역을 선택하고 세포 패턴을 정의할 수 있습니다.

이 데이터를 바탕으로 샘플 수를 측정하며, 표시된 이미지가 사용자에게 표시됩니다. 지금까지 Lucas의 고처리량 플랫폼을 사용하여 세포를 이미징하고 특성화하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 시연된 실험은 매우 다양한 세포와 미립자에 적용될 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

또한 이는 불균일한 용액 내 세포의 초광시야 및 고처리량 특성 분석을 가능하게 합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.