Name: Nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 Microfluidic 혈액 용해 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 자동 마이크로플루이딕 장치를 활용한 혈액 용해 프로토콜로 순환 핵세포를 효율적으로 분리하는 방법입니다. 이 기술은 세포 손실을 최소화하면서 고품질 샘플을 확보하여 다양한 생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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연구는 Translational 연구의 월러스 H. 쿨터 재단 조기 경력 수상에 의해 지원되었습니다. 혈액 샘플 수집과 관련하여 도움이 팀 앤드루스, 소아 혈액 / 종양학에 감사합니다. 또한 박사 샘 Wellhausen, 유동세포계측법 코어, 유동세포계측법 샘플을 실행에 대한 도움이 제임스 그레이엄 브라운 암 센터에 감사드립니다.

1 부. Microfluidic 장치 제조 microfluidic 용해 장치의 실리콘 마스터 금형은 루이빌 청정실 대학에서 장비 표준 photolithographic 기술을 사용하여 만들어진 [1]. 의 AutoCAD는 (오토 데스크, 주식 회사, 산 라파엘, CA) 채널의 부정적인 복제본을 만듭니다 (Fineline 이미징, 콜로라도 스프링스, CO) 투명 마스크를 생성하기 위해 사용되었습니다. microfluidic 용해 장치는 탄성 폴리 (dimethylsiloxane) (; 다우 코닝, 미들랜드, MI PDMS)과 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 실리콘 마스터 금형에서 가공되었습니다. 복제된 채널과 탄성이 출시되었고, 채널 액세스 구멍은 20 게이지 바늘 (소형 부품, 미라, FL.)와 펀치되었습니다. PDMS 웨이퍼는 irreversibly 산소 플라즈마를 통해 유리 슬라이드에 보세 및 실험을위한 테스트되었습니다. 2 부. 용해 장치를 실행하기위한 프로토콜 microfluidic 장치가 조작된하고 테스트한 후, 적혈구 용해와 실험을 시작할 준비가되었습니다. microfluidic 장치에 대해 다음 섹션 자세한 내용은 프로토콜. 2.1 샘플 컬렉션 <ol><li> 이 두 ML 그린 ​​톱 vaccutainers에서 항응고제로 헤파린과 함께 환자의 앞쪽에 팔뚝의 정맥에서 중간 cubital 정맥에서 혈액 샘플 4 밀리리터를 수집합니다. </li><li> 그것이 dislodged 성숙 내피 세포 (잘못된 반응)가 들어 있으므로 처음 2 ML 튜브를 폐기하십시오. </li><li> 위아래로 돌려 의한 피로 헤파린를 섞어 두 번째 튜브를 Resuspend, 얼음에 즉시 저장합니다. </li><li> 1.5 ML Eppendorf 튜브에 혈액 1 ML을 전송합니다. (수집 한 시간 이내) 즉시 혈액 샘플을 처리합니다. </li></ol> PBS와 2.2 프라임 microfluidic 장치 <ol><li> 유리 보세 microfluidic 장치를 구합니다. 인레츠 및 콘센트 (그림 1)에 약간 큰 직경의 보도 자료 - 적합한 액세스 튜브 (소형 부품, 미라, FL). </li><li> 마이크로 인터페이스에 매크로를 제공 인레츠의 각 튜브에 30 게이지 주사 바늘을 (소형 부품, 미라, FL) 연결합니다. </li><li> 1X PBS로 1 ML의 주사기를 기입하고 주사 바늘을 flicking하여 거품을 없애 있는지 확인하십시오. microfluidic 장치에 유입 1 PBS - 로드된 1 ML의 주사기를 연결합니다. 솔루션 입구 2 아웃 흐름까지 손으로 부드럽게 1X PBS가 들어있는 주사기를 밀어 후 즉시 표준 사무실 바인더 클립과 함께 입구 2 클램프 </li><li> 유체가 microfluidics 장치의 배출구 포트를 이룰 때까지 1X PBS를 밀어 계속합니다. 솔루션 콘센트 밖으로 흐르는되면, 다른 바인더 클립과 아울렛 튜빙을 클램프. </li><li> 1X PBS가 입구 3 밖으로 흐르는 때까지 한 ML의 주사기를 믿고 계속하고, 다른 사무실 바인더 클립과 함께 입구 3 포트를 클램프. microfluidics 장치는 이제 완벽하게 준비하는 것입니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 각 솔루션 및 콘센트에 대한 인레츠을 보여주는 장치의 도식. 주사기 펌프 및 솔루션의 2.3 준비 <ol><li> 펌프를 보정하려면 다음 단계를 따르십시오 : <ol class="lalpha"><li> 대형 하버드 주사기 펌프 (하버드, PHD 2,000분의 22 부 # 702000)의 경우 : 22.5 mm, 유량 600 μl / 분에 직경 구성을 설정합니다. </li><li> 작은 하버드 주사기 펌프 (하버드, 피코 플러스 파트 # 702213)의 경우 : 4.61 mm, 유량에 직경 구성을 설정 20 μl / 분. </li></ol></li><li> 무균 탈이온수 한 30 ML의 주사기를 채우십시오. 이것은 50 ML 원뿔 관에서 직접 솔루션을 철수하여 수행할 수 있습니다. (주사기 라벨) </li><li> 9 단계에서 설명한 절차를 사용 2X 인산염 버퍼 - 호수 (PBS), 2 % paraformaldehyde (PFA)와 두 번째 30 ML의 주사기를 채우십시오. (주사기 라벨) </li><li> 9 단계에서 설명한 절차를 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 저장된 aliquots의 1X PBS로 1 ML의 주사기를 채우십시오. </li><li> 입구 2 30 ML 탈이온수 주사기와 입구 3 30 ML 2X PBS의 주사기 (튜브 또는 microfluidics 장치가 돈 t 트랩 거품 확인)에 연결합니다. 인레츠 2 3 아울렛 튜브의 클램프를 제거합니다. 입구 하나에 1X PBS 1 ML의 주사기를 연결합니다. , 액체와 주사기 바늘을 작성 주사기를 연결하고, 거품을 제거하기 위해 주사기 바늘을 flicking하여 거품을 도입하지 마십시오. </li></ol> 2.4 적혈구 용해 <ol><li> 아래 설명된 적절한 하버드 펌프에 주사기의 모든 설정 : <ol class="lalpha"><li> 대형 하버드 주사기 펌프에 함께 두 30 ML 주사기를 (하나는 불임, 드 - 이온화된 물, 2X PBS, 2% PFA와 다른 포함) 설정합니다. </li><li> 작은 하버드 주사기 펌프에 한 ML의 주사기 (1X PBS를 포함) 설정합니다. </li><li> 폐기물 수집에있는 아울렛 튜빙을 (W로 표시됩니다 50 ML 원뿔 관 플레이스aste). </li></ol></li><li> 대형 하버드 주사기 펌프 (30 ML 주사기)를 켜고하고 일분 실행하자. (아무 거품과 장치 또는 튜브에 없음 누수가 없는지 확인합니다.) </li><li> 작은 하버드 주사기 펌프를 켜고 그것이 추가로 잠시 동안 실행하자. (아무 거품과 장치 또는 튜브에 없음 누수가 없는지 확인합니다.) 펌프를 중지합니다. microfluidics 장치는 현재 사용할 수 준비가 된 것입니다. </li><li> 작은 하버드 주사기 펌프의 1X PBS를 포함하는 제 1 ML 주사기를 제거합니다. </li><li> 혈액 샘플을 얻기 후에, 모든 거품을 트래핑하지 않고 무균 1X PBS의 0.05 ML으로 한 ML의 주사기를 입력하십시오. 다음 Eppendorf 튜브에서 얻은 혈액의 0.5 ML로 주사기를 입력합니다. (1 ML의 주사기는 이제 혈액과 1X PBS 버퍼의 0.55 ML의 최종 볼륨을 포함합니다.) 참고 : 혈액과 0.05 ML PBS의 혼합 피하기 위해 작성하는 동안 주사기가 수직 유지. </li><li> 입구 1로 혈액이 들어있는 주사기를 연결하고 작은 하버드 주사기 펌프 (주사기가 펌프에 수직 탑재)에 (장치에 튜브를 통해 혈액을 밀어 않도록) 신중하게 주사기를 탑재합니다. </li><li> 폐기물 관에서 아울렛 튜브를 제거하고 그 자리에 깨끗한 50 ML의 원심 분리기 튜브를 넣고 얼음 양동이에 설정합니다. </li><li> 먼저 대형 하버드 주사기 펌프 스위치를 켜고 그것이 1 분 해보죠. 50 ML의 원심 관에 콘센트에서 샘플을 수집 시작합니다. </li><li> 작은 하버드 주사기 펌프를 전환합니다. </li><li> 제 1 ML의 주사기에서 혈액 샘플 완전히 장치를 통해 여행을하고 나면, 두 펌프를 중지합니다. 이것은 약 20 분 소요됩니다. </li><li> 브레이크 해제와 함께 실온에서 350 XG에서 5 분 동안 수집된 샘플을 원심 분리기. </li><li> 화이트 펠렛의 반대편에 피펫 팁을 배치 뜨는 제거합니다. 흰색 펠렛 방해하지 않고, 가능, 특히 붉은 세포 파편만큼 뜨는으로 제거합니다. </li><li> 그리고 아래로 pipetting하여 흐름 버퍼 1 ML (1X PBS, 1 % BSA [소 혈청 알부민], 2퍼센트 PFA)에 샘플을 Resuspend. 1.5 ML Eppendorf 튜브에 샘플을 전송합니다. </li><li> 상온 4 XG에서 5 분 Microcentrifuge 수집된 샘플을. 뜨는을 제거하기 전에 동일한 정밀도를 사용합니다. </li><li> vortexing하여 흐름 버퍼 1 ML의 샘플을 Resuspend. </li></ol> 흐름 cytometric 분석을위한 준비 2.5 <ol><li> 유동세포계측법를 사용하여 샘​​플의 분석을 위해, 유동세포계측법 튜브 샘플 100 μl를 추가합니다. </li><li> 시료의 100 μl하기 (정확한 농도를 위해) 특정 항체를 추가합니다. </li><li> 예제 C. 40 30 분 부화 허용 </li><li> 이전 유동세포계측법에 흐름 버퍼와 함께 두 번 씻으십시오. 세척 단계는 흐름 버퍼 250 μl를 추가 vortexing, 350 XG에서 5 분 centrifuging 및 유동세포계측법 관 중 하나 유체 턴과 함께 뜨는 제거가 포함됩니다. </li><li> 흐름 버퍼 250 μl의 펠렛을 Resuspend. 샘플 유동세포계측법에 의해 분석이 가능합니다. </li></ol> 대표 결과 전체 혈액은 적혈구의 리딩과 풍부한 nucleated 세포 (CNCs)를 순환, microfluidic 용해 장치 및 후처리 프로토콜을 통해 실행되었습니다. 이상적인 결과는 별도의 CNC의 인구와 깨끗한 유동세포계측법의 스캐터 플롯을 얻을 것입니다. 그림 2와 3의 아래에 표시하는 것은 적혈구 용해하지 않고 앞으로 분산형 (FSC) 대 사이드 분산형 (SSC) 조명으로 축과 microfluidic 프로토콜에 의해 적혈구 용해와 전체 혈액 샘플의 스캐터 플롯 비교입니다. 이것은 microfluidic 농축 프로토콜 깨끗한 유동세포계측법의 산란 계획을 얻기 위해 필요하다고 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. FSC와 SSC의 축과 적혈구 용해하지 않고 전체 혈액 샘플의 유동세포계측법의 스캐터 플롯. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. FSC와 SSC의 축과 집단에 의해 표시 microfluidic 적혈구 용해와 nucleated 세포 순환의 유동세포계측법의 스캐터 플롯. 지역 1 (빨간색)은 granulocytes을 나타내는 지역 3 (파란색), 지역 2 (녹색)가 monocytes을 나타내는, lymphocytes을 대표하고, 지역 4 (보라색)이 특징으로 아직있다. 때 필요한 프로토콜에 피펫으로 붉은 세포 파편의 제거도 중요합니다. 아래 그림 4는 빨간색 세포 파편의 흑자를 보여주는 스캐터 플롯이다. 그림 2에서와 스캐터 플롯을 흐려 놨하지 않지만, 하나는 데이터 분석 중에 적혈구 파편으로 인한 추가 이벤트에 대한 계정이 있어야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 유동세포계측법의 스캐터 줄거리는 클러스터로 본 붉은 세포 파편을 묘사한지역 5 (시안)에 이벤트. 특정 항체 표현형 마커에 대한 얼룩 세포는 특성 결과를 생성합니다. lymphocytes, monocytes, 그리고 granulocytes 다음 그림 3 뚜렷한 백혈구의 집단에 대한 항체 표현형의 얼룩이 있습니다. 그림 5는 도끼 인 경우에는 3 번 CD와 CD4 림프구와 제휴해서 역모 인구 모습. Monocytes와 granulocytes는 각각, FSC 대 CD14와 CD66b 같은 축과 6-7 그림에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 유동세포계측법의 스캐터 플롯이 인 경우에는 3 번 CD와 CD4 도끼와 lymphocytes를 묘사. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 유동세포계측법의 스캐터 플롯은 FSC와 CD14 축과 monocytes를 묘사. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. 유동세포계측법의 스캐터 플롯은 FSC와 CD66b 도끼와 granulocytes를 묘사.

<ol><li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+%28SCD%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li>
<li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li>
</ol>

자동 microfluidic 혈액 용해 프로토콜이보고되었습니다. 프로토콜 내에서 협조할 중요한 단계입니다. 섹션 P.2.1에서는, 그것은 샘플 dislodged 성숙 내피 세포를 포함하고 잘못된 반응과 같은 역할을 모은 최초의 혈액 약병을 폐기하는 것이 중요합니다. 또한 수집 시간 이내에 혈액 샘플을 실행할 수 있는지 확인하십시오. 섹션 P.2.2에 마중물 microfluidic 장치를, 그것은 처음에 거품을 제거하는 것이 중요합니다. 또한, 하나는 프로토콜을 통해 바늘에 새로운 주사기를 장착하면 거품을 도입하지 않도록해야합니다. 섹션 P.2.4에 피로 한 ML의 주사기를 작성하면, 하나는 두 솔루션의 혼합을 피하기 위해 주사기가 수직 유지하면서 첫번째 1X PBS와 혈액, 모두를 추가하는 기억합니다. 혈액 샘플을 추진하고 주사기 펌프를 시작하기 전에, 시스템 전체 속도되도록 큰 주사기 펌프가 실행되어 있는지 확인합니다. 예제에서는 장치를 통해 실행이 완료하고 centrifuged되었습니다 후, 신중하게 흰색 펠렛 방해하지 않...

nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 microfluidic 혈액 용해 프로토콜

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

이 보고서에서는 자동 microfluidic 혈액 용해 장치에 대한 프로토콜 세부 있습니다. leukocytes과 내피 세포를 포함한 세포 nucleated (CNCs), 순환, 개인의 면역 상태에 업데이트 상태를 이상적인 플랫폼을 제공합니다. microfluidic 프로토콜은 선택적 세포 손실 및 사용자 중재 단계에 따라 샘플 준비 변화없이 CNCs의 농축을 허용합니다. 간단히, 프로토콜은 장치 제조, 샘플 수집, 장치 설치 및 microfluidic 챔버를 통해 혈액을 실행을 포함합니다. 장치 내의 모든 혈액이 빠르게 50 미크론 X 150 마이크론 microfluidic 채널에서 약 10 초 동안 탈이온수와 혼합됩니다. 이 시간에 걸쳐의 적혈구는 hypotonic 사정에 따라 lysed 있습니다. 채널의 하단에 헤링본 구조는 철저하게 혼합하고 지속적인 환경에 세포의 노출을 보장합니다. 남은 세포는 장치의 출구에서 isotonic 조건에 반환 2 % paraformaldehyde를 사용하여 고정 CNCs에서 적혈구 파편을 분리 centrifuged 및 유동세포계측법에 의해 얼룩 및 분석을위한 흐름 버퍼에 일시 중지됩니다. 결과 저장 CNC의 인구 깨끗한 유동세포계측법의 스캐터 플롯을 보여줍니다. 이 장치와 프로토콜의 의미는 CNC의 인구 분석하여 질병 pathogenesis의 연구 및 이해된다. 따라서 자동화, 효율성, 그리고 microfluidic 프로토콜의 단순는 증명하고 있습니다.

자동 microfluidic 장치는 세포 손실없이 고품질의 샘플의 절연을 보장 적혈구 용해를 통해 말초 혈액에서 nucleated 세포 농축을 순환하기 위해 개발되었습니다.

Nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 Microfluidic 혈액 용해 프로토콜

본 보고서에서는 자동화된 미세유체 혈액 용혈 장치의 프로토콜을 상세히 다룹니다. 백혈구를 포함한 순환 유핵 세포(CNCs)와...

혈액에서 순환 유핵 세포를 농축하기 위한 과정입니다. 기포를 제거하기 위해 먼저 1x PBS로 미세유체 장치를 프라이밍합니다. 혈액 샘플을 주입하기 전, 시린지 펌프를 통해 탈이온수와 2% 파라알데히드가 포함된 2x PBS를 장치에 흘려줍니다. 그런 다음 혈액을 미세유체 장치로 처리하여 수집하며, 샘플 처리 후 단계에는 원심분리와 상층액 제거 과정이 포함됩니다.마지막으로, 유세포 분석기를 통해 샘플을 분석하여 fax 플롯을 생성합니다. 안녕하세요, 저는 Wool 대학교 바이오공학과의 마이크로스케일 생명공학 연구실의 William White입니다. 오늘은 미세유체 기술을 이용한 전혈 용해를 통해 순환 핵세포를 농축하는 절차를 보여드리겠습니다.저희 실험실에서는 백혈구 및 기타 순환 유핵 세포의 손실이나 활성화 없이 농축을 보장함으로써, 다양한 질병 과정에서의 염증을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 입구 및 출구 구멍의 채널 액세스 홀보다 직경이 약간 더 큰 액세스 튜브를 끼우십시오.다음으로 매크로-마이크로 인터페이스를 구축하기 위해, 각 입구의 튜빙에 30 gauge 주사바늘을 연결합니다. 그다음, 1 mL 주사기에 1 XPBS를 채우고 기포가 없는지 확인합니다. 주사기를 입구 1에 연결하고, 1 XPBS가 입구 2로 흘러나올 때까지 주사기를 손으로 부드럽게 밉니다.그런 다음 즉시 사무용 바인더 클립으로 두 번째 입구를 고정합니다. 1× PBS 용액이 미세유체 장치의 배출구 포트에 도달할 때까지 시린지를 계속 밀어줍니다. 용액이 배출구 밖으로 흘러나오면 다른 바인더 클립으로 배출 튜브를 고정합니다.1 mL 시린지를 계속 밀어 inlet 3으로 1X PBS가 흘러나오게 한 다음, 세 번째 오피스 바인더 클립으로 inlet 3 포트를 고정합니다. 이제 미세유체 장치의 프라이밍이 완료되었습니다. 대형 Harvard 시린지 펌프를 사용하여 시린지 펌프의 보정을 시작하며, 직경 설정을 22.5 mm로, 유속을 600 µL/min으로 설정합니다.소형 Harvard 시린지 펌프를 사용합니다. 직경 설정을 4.61 millimeters로, 유량을 20 microliters per minute로 설정하십시오. 다음으로, 50 milliliter 원추형 튜브에서 용액을 직접 흡입하여 30 milliliter 시린지 하나를 탈이온수로 채웁니다.주사기에 라벨을 붙이는 것을 잊지 마십시오. 다른 30 milliliter 주사기에 2%paraform aldehyde XPBS 용액을 채웁니다. 마찬가지로 코니컬 튜브에서 직접 용액을 취한 후 주사기에 라벨을 붙입니다. 이제 튜브나 미세유체 소자 내에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하면서, 물이 들어 있는 주사기를 입구 2에 연결하고 2%para formaldehyde XPBS 주사기를 입구 3에 연결합니다.그 다음, 세 개의 주사기가 모두 연결된 상태에서 입구 2, 입구 3 및 출구 튜브의 클램프를 제거합니다. 두 개의 대형 주사기를 대형 Harvard 시린지 펌프에 함께 장착하고, 1 mL 주사기를 소형 Harvard 시린지 펌프에 장착하십시오. 출구 튜브를 50 mL 원추형 폐액 수집 튜브에 넣습니다.이제 30 milliliter 시린지를 장착한 대형 Harvard 시린지 펌프의 전원을 켜고 1분 동안 작동시킵니다. 장치나 튜브에 기포가 없고 누수가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 소형 Harvard 시린지 펌프의 전원을 켜고 여기서도 추가로 1분 동안 작동시킵니다.기포 및 누출 여부를 확인합니다. 2분 후에 펌프를 정지시킵니다. 이제 미세유체 장치를 혈액 샘플에 사용할 준비가 되었으므로, 분석할 혈액 샘플을 동봉된 서면 프로토콜에 기술된 대로 수집하여 수집 후 1시간 이내에 사용합니다.위양성 결과를 제거하기 위해 채취한 첫 번째 혈액 튜브는 버립니다. 소형 Harvard 시린지 펌프에서 1 mL 시린지를 분리한 다음, 1 mL 시린지를 사용하여 XPBS 1 mL를 주입하여 시린지 바늘을 채웁니다. 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해, 기포가 생기지 않도록 주의하며 1 mL 시린지에 XPBS 50 µL를 채웁니다.그런 다음 주사기에 혈액 0.5 milliliters를 채웁니다. PBS와 혈액이 섞이지 않도록 채우는 동안 주사기를 수직으로 유지하십시오. 다음으로 혈액이 들어 있는 주사기를 다시 입구 1에 연결합니다.남은 액체를 닦아내고 소형 Harvard 시린지 펌프에 시린지를 수직으로 장착합니다. 혈액이 튜빙을 통해 장치 내부로 밀려 들어가지 않도록 주의하십시오. 폐액 튜브에서 배출 튜빙을 분리하여 얼음 버킷에 담긴 깨끗한 50 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다.이제 대형 Harvard 시린지 펌프의 스위치를 먼저 켜서 1분 동안 작동시킵니다. 그 다음 소형 Harvard 시린지 펌프의 스위치를 켭니다. 그러면 샘플이 유출 튜브를 통해 50 milliliter 원심분리 튜브로 수집되기 시작합니다.1 mL 시린지에 담긴 혈액 샘플이 장치를 완전히 통과하도록 하며, 여기에는 약 20분이 소요됩니다. 그 후 두 펌프를 모두 정지시킵니다. 분석이 완료되면, 수집된 샘플을 상온에서 350 ×g로 5분 동안 브레이크를 끄고 원심분리합니다.피펫 팁을 흰색 펠렛의 반대편에 위치시켜 상층액을 제거합니다. 흰색 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며, 특히 적혈구 잔해물을 포함하여 가능한 한 많은 상층액을 제거하십시오. 1% BSA와 2% 파라포름알데히드가 포함된 1 XPBS 기반의 유세포 분석 버퍼 1 mL에 샘플을 넣고 피펫팅하여 재현탁합니다.상하로 섞어준 뒤, 수집된 샘플을 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮겨 4 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 이전 원심분리 단계와 마찬가지로 상층액을 조심스럽게 제거하고 실온에서 보관합니다. 마지막으로, 1 mL의 flow buffer를 추가한 후 볼텍싱하여 샘플을 재현탁하고, 유세포 분석법으로 샘플 분석을 진행합니다.이제 미세유체 장치로 농축한 혈액 샘플을 유세포 분석기로 분석하여 얻은 대표적인 결과인 fax plot을 보여드리겠습니다. 용해를 통한 농축의 중요성은 적혈구가 구름 형태로 나타나는 fax plot을 통해 확인할 수 있습니다. 미세유체 농축 프로토콜로 생성된 산점도는 혈중에서 발견되는 핵 세포 집단이 명확하게 구분된 깨끗한 산점도입니다.빨간색 영역은 림프구를, 녹색은 단핵구를, 파란색은 과립구를 나타내며, 보라색 영역은 아직 특성이 규명되지 않았습니다. 프로토콜에서 적혈구 파편을 제거하지 못하면 시안색 영역에서 보이는 것과 같이 fax 플롯에 이벤트 클러스터가 생성됩니다. 세포 집단은 별도의 fax 플롯에서 시각화할 수 있습니다.림프구는 CD3 및 CD4로, 단핵구는 CD14로, 과립구는 CD66 P로 유지되었습니다. 지금까지 미세유체 혈액 용해 장치를 사용하여 혈액 샘플을 설정하고 실행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, PBS가 장치에 들어가기 전에 혈액과 섞이는 것을 방지하고 장치의 채널 내에 기포가 유입되는 것을 막기 위해 혈액 샘플을 즉시 실행하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

혈액 백혈구 및 혈소판은 개인의 생체 에너지 전반적인 건강의 마커로 사용하고 있으므로 병적 과정 및 치료의 효과를 모니터링하기위한 잠재력을 가질 수있다. 여기에서 우리는 미토콘드리아의 기능이 세포의 산화 버스트를 분리하고 측정하는 방법을 설명합니다.

인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

이 프로토콜은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45+ 세포(림프구/백혈구)의 정성적 및 정량적 평가를 위해 신선한 인체 조직 조각의 신속한 비효소적 해리를 설명합니다. 또한, 일차 조직 균질액으로부터 얻어진 상등액은 추가 분석 또는 실험을 위해 수집 및 저장될 수 있습니다.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

이 프로토콜의 목표는 폐쇄형 사이토카인 포획 시스템을 통합하고 전담 직원이나 GMP 시설의 사용이 필요하지 않은 벤치탑의 자동화된 2세대 세포 농축 장치를 사용하여 병원체 특이적 임상 등급 T 세포를 제조하는 것입니다. 생성된 거대세포바이러스 pp65 특이적 T 세포는 환자에게 직접 투여할 수 있습니다.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

호중구는 침입하는 미생물에 대한 숙주 방어뿐만 아니라 종양 세포의 면역 감시에도 중요한 역할을 합니다. 여기에서는 항종양 특성을 가진 호중구의 분리와 관련된 기술과 in vitro 및 in vivo에서 항종양 호중구 기능을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

이 연구에서 임상 기도 분 비 물이 나선형 관성 마이크로의 폐쇄 루프 작업에서 레이블 없는 호 중구 분리 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법 분석 실험 임상 생체 외에서 다양 한 호흡기 질환에 대 한 확장 이라고 합니다.

폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축

순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

이 프로토콜은 바이오뱅킹 및 기타 목적을 위해 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 고처리량 자동화 호환 방법에 대해 자세히 설명합니다.

High Throughput Immunomagnetic Bead Separation을 통해 Buffy Coats에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 분리

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

저밀도 호중구(LDN)는 여러 질병에서 크게 증가합니다. LDN은 일반적으로 세포 분류를 통해 분리됩니다. 순수하고 실행 가능한 LDN을 얻는 실용적인 방법을 제시합니다. 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 세포를 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 자기 컬럼을 통해 분리합니다.

저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

배우세요 자동 마이크로플루이딕 장치를 활용한 혈액 용해 프로토콜로 순환 핵세포를 효율적으로 분리하는 방법입니다. 이 기술은 세포 손실을 최소화하면서 고품질 샘플을 확보하여 다양한 생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

Nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 Microfluidic 혈액 용해 프로토콜

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