Nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 Microfluidic 혈액 용해 프로토콜

혈액에서 순환 유핵 세포를 농축하기 위한 과정입니다. 기포를 제거하기 위해 먼저 1x PBS로 미세유체 장치를 프라이밍합니다. 혈액 샘플을 주입하기 전, 시린지 펌프를 통해 탈이온수와 2% 파라알데히드가 포함된 2x PBS를 장치에 흘려줍니다. 그런 다음 혈액을 미세유체 장치로 처리하여 수집하며, 샘플 처리 후 단계에는 원심분리와 상층액 제거 과정이 포함됩니다.

마지막으로, 유세포 분석기를 통해 샘플을 분석하여 fax 플롯을 생성합니다. 안녕하세요, 저는 Wool 대학교 바이오공학과의 마이크로스케일 생명공학 연구실의 William White입니다. 오늘은 미세유체 기술을 이용한 전혈 용해를 통해 순환 핵세포를 농축하는 절차를 보여드리겠습니다.

저희 실험실에서는 백혈구 및 기타 순환 유핵 세포의 손실이나 활성화 없이 농축을 보장함으로써, 다양한 질병 과정에서의 염증을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 입구 및 출구 구멍의 채널 액세스 홀보다 직경이 약간 더 큰 액세스 튜브를 끼우십시오.

다음으로 매크로-마이크로 인터페이스를 구축하기 위해, 각 입구의 튜빙에 30 gauge 주사바늘을 연결합니다. 그다음, 1 mL 주사기에 1 XPBS를 채우고 기포가 없는지 확인합니다. 주사기를 입구 1에 연결하고, 1 XPBS가 입구 2로 흘러나올 때까지 주사기를 손으로 부드럽게 밉니다.

그런 다음 즉시 사무용 바인더 클립으로 두 번째 입구를 고정합니다. 1× PBS 용액이 미세유체 장치의 배출구 포트에 도달할 때까지 시린지를 계속 밀어줍니다. 용액이 배출구 밖으로 흘러나오면 다른 바인더 클립으로 배출 튜브를 고정합니다.

1 mL 시린지를 계속 밀어 inlet 3으로 1X PBS가 흘러나오게 한 다음, 세 번째 오피스 바인더 클립으로 inlet 3 포트를 고정합니다. 이제 미세유체 장치의 프라이밍이 완료되었습니다. 대형 Harvard 시린지 펌프를 사용하여 시린지 펌프의 보정을 시작하며, 직경 설정을 22.5 mm로, 유속을 600 µL/min으로 설정합니다.

소형 Harvard 시린지 펌프를 사용합니다. 직경 설정을 4.61 millimeters로, 유량을 20 microliters per minute로 설정하십시오. 다음으로, 50 milliliter 원추형 튜브에서 용액을 직접 흡입하여 30 milliliter 시린지 하나를 탈이온수로 채웁니다.

주사기에 라벨을 붙이는 것을 잊지 마십시오. 다른 30 milliliter 주사기에 2%paraform aldehyde XPBS 용액을 채웁니다. 마찬가지로 코니컬 튜브에서 직접 용액을 취한 후 주사기에 라벨을 붙입니다. 이제 튜브나 미세유체 소자 내에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하면서, 물이 들어 있는 주사기를 입구 2에 연결하고 2%para formaldehyde XPBS 주사기를 입구 3에 연결합니다.

그 다음, 세 개의 주사기가 모두 연결된 상태에서 입구 2, 입구 3 및 출구 튜브의 클램프를 제거합니다. 두 개의 대형 주사기를 대형 Harvard 시린지 펌프에 함께 장착하고, 1 mL 주사기를 소형 Harvard 시린지 펌프에 장착하십시오. 출구 튜브를 50 mL 원추형 폐액 수집 튜브에 넣습니다.

이제 30 milliliter 시린지를 장착한 대형 Harvard 시린지 펌프의 전원을 켜고 1분 동안 작동시킵니다. 장치나 튜브에 기포가 없고 누수가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 소형 Harvard 시린지 펌프의 전원을 켜고 여기서도 추가로 1분 동안 작동시킵니다.

기포 및 누출 여부를 확인합니다. 2분 후에 펌프를 정지시킵니다. 이제 미세유체 장치를 혈액 샘플에 사용할 준비가 되었으므로, 분석할 혈액 샘플을 동봉된 서면 프로토콜에 기술된 대로 수집하여 수집 후 1시간 이내에 사용합니다.

위양성 결과를 제거하기 위해 채취한 첫 번째 혈액 튜브는 버립니다. 소형 Harvard 시린지 펌프에서 1 mL 시린지를 분리한 다음, 1 mL 시린지를 사용하여 XPBS 1 mL를 주입하여 시린지 바늘을 채웁니다. 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해, 기포가 생기지 않도록 주의하며 1 mL 시린지에 XPBS 50 µL를 채웁니다.

그런 다음 주사기에 혈액 0.5 milliliters를 채웁니다. PBS와 혈액이 섞이지 않도록 채우는 동안 주사기를 수직으로 유지하십시오. 다음으로 혈액이 들어 있는 주사기를 다시 입구 1에 연결합니다.

남은 액체를 닦아내고 소형 Harvard 시린지 펌프에 시린지를 수직으로 장착합니다. 혈액이 튜빙을 통해 장치 내부로 밀려 들어가지 않도록 주의하십시오. 폐액 튜브에서 배출 튜빙을 분리하여 얼음 버킷에 담긴 깨끗한 50 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다.

이제 대형 Harvard 시린지 펌프의 스위치를 먼저 켜서 1분 동안 작동시킵니다. 그 다음 소형 Harvard 시린지 펌프의 스위치를 켭니다. 그러면 샘플이 유출 튜브를 통해 50 milliliter 원심분리 튜브로 수집되기 시작합니다.

1 mL 시린지에 담긴 혈액 샘플이 장치를 완전히 통과하도록 하며, 여기에는 약 20분이 소요됩니다. 그 후 두 펌프를 모두 정지시킵니다. 분석이 완료되면, 수집된 샘플을 상온에서 350 ×g로 5분 동안 브레이크를 끄고 원심분리합니다.

피펫 팁을 흰색 펠렛의 반대편에 위치시켜 상층액을 제거합니다. 흰색 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며, 특히 적혈구 잔해물을 포함하여 가능한 한 많은 상층액을 제거하십시오. 1% BSA와 2% 파라포름알데히드가 포함된 1 XPBS 기반의 유세포 분석 버퍼 1 mL에 샘플을 넣고 피펫팅하여 재현탁합니다.

상하로 섞어준 뒤, 수집된 샘플을 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮겨 4 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 이전 원심분리 단계와 마찬가지로 상층액을 조심스럽게 제거하고 실온에서 보관합니다. 마지막으로, 1 mL의 flow buffer를 추가한 후 볼텍싱하여 샘플을 재현탁하고, 유세포 분석법으로 샘플 분석을 진행합니다.

이제 미세유체 장치로 농축한 혈액 샘플을 유세포 분석기로 분석하여 얻은 대표적인 결과인 fax plot을 보여드리겠습니다. 용해를 통한 농축의 중요성은 적혈구가 구름 형태로 나타나는 fax plot을 통해 확인할 수 있습니다. 미세유체 농축 프로토콜로 생성된 산점도는 혈중에서 발견되는 핵 세포 집단이 명확하게 구분된 깨끗한 산점도입니다.

빨간색 영역은 림프구를, 녹색은 단핵구를, 파란색은 과립구를 나타내며, 보라색 영역은 아직 특성이 규명되지 않았습니다. 프로토콜에서 적혈구 파편을 제거하지 못하면 시안색 영역에서 보이는 것과 같이 fax 플롯에 이벤트 클러스터가 생성됩니다. 세포 집단은 별도의 fax 플롯에서 시각화할 수 있습니다.

림프구는 CD3 및 CD4로, 단핵구는 CD14로, 과립구는 CD66 P로 유지되었습니다. 지금까지 미세유체 혈액 용해 장치를 사용하여 혈액 샘플을 설정하고 실행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, PBS가 장치에 들어가기 전에 혈액과 섞이는 것을 방지하고 장치의 채널 내에 기포가 유입되는 것을 막기 위해 혈액 샘플을 즉시 실행하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.