Name: 마우스 콘 Photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: 학습하세요 마우스 원추세포에서 흡입 전극을 이용한 단일 세포 기록 기법을 통해 망막 분리 및 광반응 측정 방법을. 이 기술은 시각 신경과학 및 망막 질환 연구에 활용됩니다.

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실명과 어이 02687을 (워싱턴 대학에서 안과 &amp; 비주얼 과학 계열) 방지하기 위해 연구에서 실명, NIH 그랜트 어이 019,312, 그리고 무제한 부여를 방지하기 위해 연구에서 경력 개발 상을 지원.

전극 만들기 <ol><li> micropipette의 풀러를 사용하여 기록 전극을 만들어 현미경으로 가열 필라멘트와 전극을 폴란드어. 마우스 콘 단일 셀 흡입 녹음, 전극 팁의 내부 직경 6-7 μm의 약입니다. </li><li> 참조 전극을 준비합니다. 증류수 1 %의 한천을 나가는거야. 온수 욕조에있는 한천 솔루션을 용융. 주사기를 사용하여 1 %의 한천과 유리 pipettes을 (L = 100mm, OD / ID = 1/0.75 ㎜) 입력합니다. 10 분 상온에서 한천을 응고. </li><li> 다이아몬드 나이프를 사용하여 반쪽에 pipettes 컷. </li><li> 4 최소 24 시간에 대한 참조 솔루션에서 참조 전극을 소크 ° C. </li></ol> 실험 설정 <ol start="5"><li> 다크 하룻밤 검은 새장에 마우스를 적응. </li><li> 100 ML 참조 솔루션 1 L 재관류 솔루션 (아래 참조) 준비와 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 0.1 % BSA 20 ML 참조 솔루션 10 MM의 혈당을 디졸브. </li><li> 광도계를 사용하여 광학 자극기의 빛을 강도를 보정합니다. </li><li> 거꾸로 현미경의 무대에서 기록 챔버를 탑재합니다. </li><li> 95% O 2 / 5% CO 2와 버블 재관류 솔루션은 CO 2의 용해도를 증가 40 ° C 물 목욕에 품어. 이 솔루션은 병 36-38로 온난 세라믹 저항을 통과 기록 챔버 ° C.에 흐르는 히터가 이상적으로 현미경의 무대에서 가능한 녹화 실로 가까운 위치해야합니다. </li><li> 1-1.5에 대해 ML / 분 유량에 대한 유량 조절기를 조정합니다. </li><li> 참조 솔루션으로 기록 전극을 입력합니다. 전극 홀더에 전극을 삽입합니다. 전극에 거품이 없습니다 있는지 확인합니다. 앰프의 headstage에 홀더를 탑재합니다. 부분적으로 전극 홀더의 사이드 포트에 미네랄 오일로 채워진 튜브를 연결하여 내장된 흡입 장치에 홀더를 연결합니다. 관의 다른 쪽 끝을는 입으로하는 압력을 적용할 수있는, 미네랄 오일의 작은 저수지에 연결되어 있습니다. </li><li> headstage의 다른 극에 대한 참조 전극을 연결합니다. 참조 전극을 열 부부 (TC)를 바인딩합니다. 전극과 TC 팁 가까이 함께 온도 읽기가 가능한 세포에 가까운 촬영되도록 있는지 확인합니다. </li><li> 전극을 시각화하기 위해 적외선 조명을 켭니다. 전극은 모니터에 연결된 적외선 카메라로 볼 수 있습니다. 시야와 마이크로 조작하는 사람을 사용하여 모니터의 중심 전극 이미지. </li><li> 기록 전극 팁을 참조 전극 팁 클로즈 (2~4밀리미터)의 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 솔루션의 온도가 36-38에 대한 ° C.되도록 히터에 대한 DC 전압을 조정 </li><li> 일반적으로 900 kΩ에 대한, 기록 전극의 저항을 확인하는 인감 테스트를 실행합니다. </li></ol> 마우스 망막을 분리 <ol start="18"><li> 희미한 붉은 불빛 아래, CO 2 경추 전위와 어두운 적응 마우스를 안락사. 약간 공막엔의 가장 지느러미 지점을 cauterizing하여 뜨거운 금속 토치의 팁을 사용하여 시선을 표시합니다. 가위를 사용하여 눈알을 명백히하다. 이후의 모든 절차는 적외선에 따라 수행됩니다. </li><li> 적외선 조명 및 이미지 컨버터와 함께 현미경으로 눈알을 Hemisect. </li><li> 각막과 렌즈를 제거합니다. 가능한 유리의 많은를 제거합니다. </li><li> M - 원뿔 응답을 기록하려면, 소작 마르크에서 심사 면도날로 세안 컵 4 복부 부분을 제거합니다. </li><li> 안료 상피 층에서 망막 껍질. </li><li> 망막을 평평하게하고 1-2 ML 참조 솔루션 가득 페트리 접시의 바닥에 놓으십시오. </li><li> 면도날을 사용하여 작은 얇은 조각으로 망막를 슬라이스하고 순수한 산소와 포화 빛을 꽉 상자에서 준비를 품어. </li></ol> 녹음 <ol start="25"><li> 일시적으로 히터의 전원을 끕니다. 건조에서 약실을 방지하기 위해 우회 튜브에 재관류 흐름을 전환합니다. </li><li> Kimwipe 조직의 조각을 사용하여 챔버의 솔루션 대부분의 드레인. 유리 피펫을 사용하여 녹음 챔버에 망막의 현탁액을 전송합니다. </li><li> 망막 슬라이스가 정착 때까지 약 2 분 동안 기다리십시오. 다시 재관류를 전환합니다. 히터를 켭니다. </li><li> 준비를 시각화하는 적외선 조명을 켜십시오. photoreceptor 외부 세그먼트 (예 : 그림 참조) 붙어서 챔버에 누워 망막의 일부를 검색합니다. 흡입에 의해 전극에 부드럽게 내부 세그먼트를 그립니다. 이 구성에서 여러 개의 핵 및 내부 세그먼트는 전극에 그려해야합니다. 콘 내부 세그먼트는 세포 치료 여부를 전극에 있으며 있는지 여부를 테스트하려면 밝은 플래시로 photoresponse를 기록네, 반응 속도론 및 진폭에 의해 판단. </li><li> 전극의 내부 세그먼트를 개최 도움이되는 전극의 끝부분에 약간의 부정적인 압력을 적용하기 위해 광물 저수지를 낮춥니다. </li><li> 기록 테스트 - 플래시 응답 밝은 강도에 희미에서 좋은 휴대폰이 발견되면. 테스트 섬광은 보정 광학 자극기 5 제공됩니다. 플래시 강도와 파장은 각각 중립 밀도 필터와 좁은 밴드 간섭 필터의 집합에 의해 제어됩니다. 시험 기간은 플래시 (20 MS) 컴퓨터 기반의 셔터에 의해 제어됩니다. </li></ol> 솔루션 <ol><li> 마우스 재관류 솔루션 : 112.5 MM NaCl, 3.6 MM KCl, 2.4 MM MgCl 2, 1.2 MM CaCl 2, 10 MM HEPES (산도 7.4), 20 MM NaHCO 3, MM succinate 나, 0.5 MM 나 조미료, 0.02 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 그리고 10 MM 포도당. </li><li> 마우스 기록 전극 솔루션 : 140 MM NaCl, 3.6 MM KCl, 2.4 MM MgCl 2, 1.2 MM CaCl 2, 3 MM HEPES (산도 7.4), 0.02 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

photoreceptor 세포에서 단일 세포 흡입 기록은 3 년 전 개발되었습니다. 이것은 세포막을 관통하지 않고 빛의 자극에 의​​해 유도된 횡단 막 전류 변화를 기록하는 데 있습니다. 때문에 높은 세포 - 세포 부착, 이건 수륙 양용 망막과 같은 마우스 망막에서 건강한 하나의 막대와 원뿔을 분리하기 어려운이며 그것은 낮은 비율 (3 %)과 작은 크기로 인해 각각의 원뿔을 찾을 수 어렵습니다. 내부 세그먼트 기능 (IS -)를 기록 방법은 원추형이 포함될 수 있습니다 그중 몇 가지 photoreceptors의 내부 세그먼트의 현재 기록하여이 어려움을 극복. 야생 타입 마우스에 반응은 막대와 원뿔의 조합해야합니다. 꾸준한 배경 조명은 막대의 반응을 억제하는 데 사용할 수 있습니다. 망막들이 G - 단백질 transducin 6 α - subunit 부족으로 막대가 가벼운 자극에 응답하지 수있는 -이 비디오에서는, 우리는 Tα - /를 사용합니다. 따라서 photoresponse는 원뿔에서입니다.

마우스 콘 photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

망막에있는 막대와 원뿔 photoreceptors 빛을 감지 책임이 있습니다. 어둠에서 바깥쪽 구간에 주기적 염기 - 게이 티드 (CNG) 채널 오픈하고 양이온이 세포 depolarizing, 멤브레인 안쪽에 걸쳐 꾸준히 흐름을 수 있습니다. 라이트 노출은 CNG 채널, 블록 안쪽 양이온 전류 흐름, 따라서 세포 hyperpolarization 결과의 폐쇄를 실행시킵니다. photoreceptors의 극성에 따라 흡입 녹음 방법은 고전적인 패치 - 클램프 기법과는 달리, 플라즈마 막을 관통 필요하지 않습니다, 1970 년대에 개발되었습니다<sup&gt; 1</sup&gt;. 세포외 솔루션으로 가득한 단단히 맞는 유리 피펫에 외부 세그먼트를 그리기 테스트 - 플래시 노출에 따라 각각의 세포에서 현재 변경 내용을 녹음하실 수 있습니다. 그러나,이 잘 구축 &quot;객관적인 세그먼트 인 (OS 인)&quot;흡입 녹음 때문에 마우스 망막의 원뿔의 낮은 비율 (3 %)과 원추형을 식별의 어려움, 마우스 콘 레코딩에 적합하지 않습니다 외부 세그먼트. 최근 내부 세그먼트 기능 (IS -)를 녹화 설정은 녹화 피펫으로 내부 세그먼트 / photoreceptor의 핵 영역을 그리기 위해 개발된<sup&gt; 2,3</sup&gt;. 이 비디오에서는, 우리는 단일 셀 흡입 전극을 사용하여 개별 마우스 콘 photoresponses에서 기록하는 방법을 보여줍니다.

우리는 흡입 전극을 사용하여 단일 마우스 콘에서 플래시 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다.

마우스 콘 Photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩

망막의 간상 및 원추 광수용체는 빛 검출을 담당합니다. 암흑 상태에서 외절의 고리형 뉴클레오타이드 개폐(CNG) 채널은...

이 영상에서는 마우스 망막의 해부 과정과 이후 원추세포의 단일 세포 흡입 기록(single cell suction recordings) 획득 방법을 보여줍니다. 안락사시킨 암적응 마우스의 안구를 희미한 적색광 아래에서 등쪽 부분을 소작하고 핵을 제거합니다. 그런 다음 안구를 반구형으로 절단합니다.적도선을 따라 각막과 안구의 복측 부분을 제거합니다. 그다음 등측 망막을 색소 상피층에서 분리하고, 면도날을 사용하여 작고 얇은 조각으로 절단합니다. 절단된 망막 조각들을 현미경 스테이지에 맞는 기록 챔버에 넣습니다.여러 개의 광수용체 세포체가 기록 전극 안으로 흡입됩니다. 원추 광수용체가 전극 내로 들어왔을 때, 밝은 테스트 플래시를 가하면 4 pA 이상의 진폭을 가진 광응답이 유도됩니다. 안녕하세요. 저는 세인트루이스 워싱턴 대학교 안과 및 시각 과학과의 Dr. Mir Kops 연구실 소속 Jin입니다.오늘은 단일 모스콘(Moscon) 광수용체로부터 광응답을 기록하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 낮 시간의 시각을 매개하는 광수용체인 포유류 원추세포의 적응 특성을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다.기록 하루 전, 실험 환경을 암실로 조성합니다. 마우스를 빛이 완전히 차단된 케이지에 밤새 두어 암적응시킵니다. 복합 현미경 하에서 마이크로 피펫 풀러(micro pipette puller)를 사용하여 보로실리케이트 유리관(borosilicate glass tubing)으로 기록 전극을 제작합니다.가열 필라멘트를 사용하여 끝단을 가공합니다. 각 전극의 팁을 연마하여 표면을 매끄럽게 하고 개구부를 원하는 직경으로 줄입니다. 마우스 원추형 단일 세포 흡입의 경우, 전극 팁의 내부 직경은 약 6~7 µm가 되어야 합니다.증류수에 1% agar 용액을 준비합니다. 한천을 녹이기 위해 용액을 끓는 물에 넣습니다. 한천이 모두 녹으면, 이를 시린지로 옮겨 유리 피펫에 용액을 채웁니다.기준 전극을 준비하려면 실온에서 10분 동안 굳도록 둡니다. 한천이 굳은 후, 다이아몬드 칼을 사용하여 각 피펫을 절반으로 잘라 두 개의 기준 전극을 만듭니다. 기준 전극을 기준 용액이 채워진 신틸레이션 바이알에 넣고 4°C에서 최소 24시간 동안 담가 두어 용액이 한천 겔에 침투하도록 합니다.기준 전극은 제조일로부터 최대 3개월까지 사용할 수 있습니다. 사용된 전극은 실험 후 폐기합니다. 기록 시스템은 진동 노이즈를 최소화하기 위해 에어 서스펜션 테이블 위에 설치된 도립 현미경으로 구성되며, 전자기 노이즈를 최소화하기 위해 베리티 케이지(verity cage)로 차폐되어 있습니다.전극의 위치를 잡기 위해 전동 마이크로 매니퓰레이터를 사용합니다. 광 자극기는 텅스텐 필라멘트, 컴퓨터 제어 셔터 및 파장과 빛의 세기를 조절하기 위한 광학 필터로 구성됩니다. 개별 광수용체 세포의 막 전류를 검출하기 위해 패치 클램프 증폭기를 사용합니다.기록 전 과정 동안 조직에 관류를 실시합니다. 준비된 관류 완충액 1L를 기록 시스템 근처의 40°C 항온 수조에 둡니다. 그다음 튜브를 사용하여 관류 완충액을 95% 산소, 5% 이산화탄소 가스에 연결하여 지속적으로 기포가 발생하도록 합니다.광도계를 사용하여 광학 자극기에서 나오는 감쇠되지 않은 빛의 출력을 측정하며, 광도계의 검출기는 시료가 놓일 현미경 스테이지 평면에 배치합니다. 이어서, 마이크로와트(µW)로 표시된 측정값을 초당 제곱 마이크로미터당 광자 수(photons/µm²/s)로 변환하여, 중성 밀도 필터에 의한 빛의 감쇠를 고려한 테스트 플래시당 광자 수를 추산합니다.감쇠되지 않은 광출력을 측정한 후, 포토미터를 스테이지에서 제거하고 실험에 사용할 기록 챔버를 도립 현미경 스테이지 위에 장착합니다. 튜브를 사용하여 조절 밸브를 통해 관류액 병을 기록 챔버에 연결합니다. 이때 튜브를 가열 저항기를 통과하도록 배치합니다.가열 저항기를 기록 챔버 바로 앞에 배치하십시오. 그런 다음 조절 밸브에서 기록 챔버까지 바이패스 튜브를 연결하십시오. 유량 조절 밸브를 열고 유량을 1~1.5 milliliters per minute로 조정하여 관류를 시작하십시오.관류액은 중력에 의해 기록 챔버에서 수집 플라스크로 배출됩니다. 뭉툭한 바늘이 달린 주사기를 사용하여 전극 홀더를 기준 용액으로 채웁니다. 마이크로필 주사기 바늘을 사용하여 기록 전극을 기준 용액으로 채우고 세척하며, 전극 내에 기포가 없는지 확인합니다.기준 전극을 전극 홀더에 삽입하고 앰플리파이어 헤드 스테이지의 기준 단자에 연결하십시오. 고무 링을 사용하여 열전대를 기준 전극에 고정하십시오. 이때 온도가 셀과 최대한 가까운 지점에서 측정될 수 있도록 전극과 열전대의 팁을 서로 가깝게 배치해야 합니다.그 다음 기록 전극을 전극 홀더에 삽입하고 홀더를 증폭기의 헤드 스테이지에 장착합니다. 튜브를 사용하여 미네랄 오일이 담긴 작은 저장조를 전극 홀더의 측면 포트에 연결합니다. 저장조와 연결된 튜브를 통해 입으로 가볍게 흡입하면 세포가 전극 안으로 끌려 들어옵니다.컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 광 자극기의 셔터 중 하나를 엽니다. 현미경 스테이지 위에서 테스트 플래시의 빔 영역을 시각화하려면, 현미경의 초점을 기록 챔버 바닥에 맞춥니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 테스트 플래시 빔 영역의 중심으로 이동시킵니다.기준 전극을 기록 전극의 팁 근처에 배치하십시오. 기록 챔버 내 용액의 온도가 약 36~38 °C가 되도록 히터 전압을 조절하십시오. 사전 설정된 전류 진폭에 대한 전압을 측정하여 저항을 계산하는 씰 테스트(seal test)를 통해 기록 전극의 저항을 확인하며, 정상 범위는 보통 약 900 kΩ입니다.씰 테스트(seal test)를 통해 기록 전극 또는 기준 전극 내의 기포 발생 여부나 기록 전극의 팁 크기가 적절한지 확인할 수 있습니다. 씰 테스트는 데이터 수집 프로그램인 clamp X에 의해 소프트웨어적으로 제어됩니다. 저항 값은 컴퓨터 화면에 표시됩니다. 저항 값이 500 kilo ohms 미만으로 너무 낮으면, 전극의 팁이 너무 클 가능성이 높으므로 새로운 전극을 설치해야 합니다.저항이 1 mΩ보다 높으면 전극 내에 기포가 존재하거나 팁이 너무 좁은 것일 수 있으며, 이 경우 전극을 세척하거나 교체해야 합니다. 기록 장치가 준비되면, 어두운 적색광 아래에서 실험을 위한 망막 절편을 준비하십시오. 안구 적응이 된 안락사된 마우스의 각 안구 최상단 지점에서 가열된 해부용 바늘 팁을 사용하여 공막을 소작합니다. 그런 다음 가위로 안구를 적출하십시오.뭉툭한 핀셋을 사용하여 안구를 적외선 조명과 적외선 이미지 변환기가 장착된 해부 현미경으로 옮깁니다. 이후의 모든 해부 조작은 적외선 조명 하에서 수행합니다. 그런 다음 미세 가위를 사용하여 소작 지점을 제외하고 안구의 적도 방향을 따라 절개하여 엽니다.날카로운 핀셋을 사용하여 수정체를 제거하십시오. 그 다음 소작점(cautery point)을 기준으로 유리체의 최대한 많은 부분을 제거하십시오. 면도날을 사용하여 안구 컵(eye cup)의 복측 부분을 제거하십시오.그런 다음 각막을 제거합니다. 이어서 핀셋을 사용하여 색소 상피층에서 배측 망막을 박리합니다. 그 후, 0.1% BSA가 포함된 10 millimolar 포도당 표준 용액 1~2 mL가 채워진 새로운 페트리 접시 바닥에 망막의 수용체 측이 위로 향하게 놓은 다음, 면도날을 사용하여 망막을 부드럽게 눌러 평평하게 폅니다.망막을 작고 얇은 조각으로 자릅니다. 그 다음, 망막 조각을 기록 챔버에 넣기 전, 순수 산소로 지속적으로 포화된 라이트 타입 박스(light type box)에서 준비물을 배양합니다. 히터는 일시적으로 끕니다.관류 흐름을 바이패스 튜빙으로 전환하십시오. 그런 다음 킴와이프를 사용하여 챔버에서 용액의 대부분을 배출하십시오. 적외선 조명을 켭니다.인큐베이터에서 망막 부유액을 꺼내 기록 챔버로 슬라이스를 옮깁니다. 입구가 넓은 전송 피펫을 사용하여 슬라이스가 2분 동안 가라앉도록 둡니다. 망막 슬라이스가 가라앉은 후, 직접 관류와 히터를 다시 켭니다.광수용체 외절이 돌출된 망막 조각을 확인하십시오. 마우스 석션(mouth suction)을 사용하여 기록 전극의 팁을 망막의 외핵층 위에 위치시키십시오. 광수용체 세포체가 전극 내부로 유입될 때까지 몇 개의 세포체를 조심스럽게 전극 안으로 끌어당기십시오.20 millisecond의 500 nanometer 테스트 플래시를 가합니다. 광수용체를 통해 흐르는 전류의 빛 유도 변화가 테스트 플래시 반응을 나타냅니다. 건강한 원추세포는 4에서 7 pico, MPIs 또는 pa의 최대 반응 진폭을 생성합니다.감쇄되지 않은 테스트 플래시로 자극합니다. 적절한 세포가 발견되면, 전극 팁에 약간의 음압을 가하여 세포 내절이 전극에 잘 고정되도록 미네랄 오일 저장조를 손으로 천천히 내립니다. 세포가 반응하는 경우, 임계값부터 포화 상태까지 강도가 다른 테스트 플래시에 대한 일련의 반응을 기록합니다.이 기술을 사용하여 흡입 전극(suction electrode)의 도움으로 마우스 망막 절편에서 원추세포의 광응답을 얻을 수 있습니다. 여기에는 동일한 세포에서 얻은 여러 기록들의 오버레이가 표시되어 있습니다. 단일 원추세포의 광응답은 약 1 pico am의 임계 응답을 생성하는 낮은 강도부터 약 5.5 pico amper의 포화 응답을 생성하는 높은 강도까지, 점진적으로 강도가 증가하는 테스트 플래시를 통해 유도되었습니다.플래시 강도가 증가함에 따라, 광응답의 진폭은 포화 상태에 도달할 때까지 증가합니다. 플래시는 시간 0에서 가해집니다. 이제 흡입 전극을 사용하여 단일 moscon 광수용체로부터 광응답을 기록하는 방법을 보여드리겠습니다.이 절차를 수행할 때, 망막의 적절한 부위를 확보하고, 망막을 얇은 조각으로 절단하며, 전극을 기포 없이 깨끗하게 유지하고, 기계적 및 전자기적 노이즈를 모두 최소화하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마쳤습니다. 시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

출처: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 형질전환 마우스 망막의 원뿔 광수용체에서 칼슘 역학을 모니터링하기 위해 이광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 망막 절편을 준비하고, FRET 기반 칼슘 바이오센서를 이미징하고, 형광 변화를 분석하여 배경 조명 및 빛 자극 하에서 칼슘 수치를 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 망막 원뿔 광수용체의 칼슘 역학을 모니터링하기 위한 이광자 현미경 검사

우리는 수생 호랑이 도롱뇽 (에서 얇은 망막 조각의 준비를...

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

팔일 세 마우스의 신경 망막은 4 % 젤라틴 블록의 상단에있다. 에 vibratome에 의한 광 수용체 층 (200 μm의)의 분리 후, 광 수용체는 문화 기계 및 효소 분해 후 씨앗을 품고있다. 감광체 층은 분자량, 생화학 적 분석 또는 이식에 사용될 수있다.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

우리는 쥐의 눈에서 망막 절편을 준비하고 망막 뉴런의 빛 반응을 기록하는 방법을 보여줄 것입니다. 전체 절차는 어두운 환경에서 수행됩니다.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

우리는 마우스 망막의 생체 외 슬라이스 준비를 사용하여 콘 광 수용체의 축삭 터미널에서 칼슘 역학을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 중요한 포유 동물 모델 시스템에서 콘 칼슘 신호의 포괄적 인 연구, 마우스를 할 수 있습니다.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

우리는 닭 배아의 망막에서 콘 광수용체의 1 차적인 배양을 얻고 높은 함량 검열을 위한 그것의 사용을 얻는 방법을 기술합니다.

닭 배아망막에서 콘 세포 상호 작용에 로드를 연구하는 원뿔 농축 배양

학습하세요 마우스 원추세포에서 흡입 전극을 이용한 단일 세포 기록 기법을 통해 망막 분리 및 광반응 측정 방법을. 이 기술은 시각 신경과학 및 망막 질환 연구에 활용됩니다.

마우스 콘 Photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩

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