Name: 자기편 셀룰러 문화에 대한 산소 삽입 제작 및 운영 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-06T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 학습하세요 저산소 삽입 장치 제작 및 검증 방법을 통해 세포 배양에서 산소 농도를 정밀하게 제어하는 기술을 익히세요. 이 장치는 상처 치유 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 공중 보건의 일리노이학과와 국립 과학 재단 (DBI - 0852416)에 의해 재정 지원되었다.

1. 장치 기능 <ol><li> hypoxic 삽입 장치는 6 기둥을 포함하는 표준 6 자 플레이트로 둥지. 가스 기둥의 바닥에 microfluidic 네트워크를 통해, 기둥으로 흐르고, 밖 장치의 뒤로 흐르고 있습니다. microchannel 하단의 장벽을 형성 기둥의 기지에서 microchannel 가스와 문화 미디어 사이의 산소 확산을 허용 100 μm의 두께 가스 투과 PDMS 막입니다. 따라서 장치가 원하는 가치를 향한 미디어 산소 농도를 드라이브 농도 기울기를 설립하여 운영하고 있습니다. </li><li> 장치가 hypoxic 챔버 및 기타 세포 산소 시스템 이상의 장점을 다수 제공합니다 : 1 건)) 빠른 시간적 제어, 2 허용 산소 확산 경로를 최소화 기둥 microchannel 디자인, 3과 같은 종속 산소 이상의 공간적 제어) 향상을 가지고 작은 연구실 풋프린트 및 실험 효율성을 높이기 위해 높은 처리량, 그리고 4) 전문 지식과 장비에 대한 요구하지 않고 일반 세포 배양 도구 (예 : multiwell 판)에 적응. </li></ol> 2. 장치 제조 <ol><li> 먼저 기둥 배열은 이전에 가공 Delran 금형의 PDMS와 몰드 복제됩니다. </li><li> 가스 다음 각 기둥의 하단에 microchannel 표준 SU - 8 석판술 및 PDMS 복제 성형을 사용하여 조작합니다. </li><li> 가스 투과 막은 원하는 두께를 달성하기 위해 실리콘 웨이퍼에 대한 PDMS의 정의 회전에 의해 조작됩니다. 이 예제에서는 10 초 500 RPM 후 30 초 동안 900 rpm을 회전하여 가짜란 100 μm의 두꺼운 막이를 사용합니다. </li><li> 모든 구성 요소는 휴대용 플라즈마 장치 (모델 BD - 20, 전자 기술 제품)와 산소 플라즈마 처리 후 함께 보세 있습니다. </li></ol> 3. 장치 설정 <ol><li> 부드럽게 장치는 거품을 방지해야하고, 접시에 넣습니다. 삽입하는 동안 장치 앵글링하면 한쪽 거품을 추방하는 데 도움이됩니다. 실제 세포 기반 실험의 경우,이 단계는 살균 층류 후드 안에 완료해야합니다. 장치가 삽입되면 오염에 대한 가능성이 크게 감소, 조립이되지 않은 멸균 환경에서 보육에 이월 수 있도록. </li><li> 소스 가스 탱크에서 장치의 입구와 출구 포트에 튜브를 연결합니다. 세포 기반 실험, 문화 인큐베이터는 튜브 항목과 튜브는 장치를 휴대하고 인큐베이터에 넣어 후에 연결되어 있어야합니다을 허용하는 구멍이 있어야합니다. 기본 세포를 부술 정도로 PDMS를 변형 할 수있는 장치에 과도한 압박을 가하고 않도록주의하십시오. </li><li> 정밀 유량 조절이 장치를 넘쳐 방지하기 위해 탱크 톱 조절기를 열기 전에 닫혀 있는지 확인하십시오. 가스의 흐름을 시작합니다. 원하는 유속 (50-100 ML / 분)로 부드럽게 열고 정밀 유량 조절기. 시스템이 유속을 변경, equilibrates 동안 압력 강하의 변화하므로, 다음 시간 동안 밀접하게 가치를보고하고 필요에 따라 조정합니다. 미디어의 거품 형성을 방지하기 위하여, 높은 유량과 초기 십오분 평균 기간 이후 10-20 사이 ML / 분에 유량을 줄일 수 있습니다. </li><li> 원하는 실험 기간 후, 가스 흐름을 중단 접시를 제거하고, 프로세스 세포 그에 따라 (예 : 등, 개수, 얼룩, lyse). </li></ol> 4. 장치 확인 <ol><li> 보정 <ol><li> 형광 산소의 위치의 번호와 위치를 선택하십시오 산소 측정에 사용됩니다 (폭시) 센서 슬라이드 (정품 확인 요구 사항에 따라). 슬라이드 산소에 의해 침묵하는 형광 루테늄 염료의 코팅이 포함되어 있습니다. </li><li> 0, 10 슬라이드 직접 노출하고, 가스 탱크에서 21 %의 산소와 적절한 평균 5 분 후에 이미지를 캡처합니다. </li><li> 형광 강도에 따라 각 위치와 플롯 산소 농도에 대한 의미 이미지 강도를 내보냅니다. </li><li> 00~10% 라인 피팅 선형 곡선과 10~21% 라인에 의해 보정 곡선을 생성합니다. </li></ol></li><li> 이질 <ol><li> 정의된 간격 (예 : 모든 1mm)에서 채널의 넓이를 걸치는 여러 지점을 설정합니다. 간격에 따라 이미지의 중복이있을 수 있습니다. </li><li> 장치를 통해 잘 표면에서 산소 농도를 측정 </li></ol></li><li> 평균 <ol><li> 산소 농도를 측정할 수있는 매력적 슬라이드에 세 개의 지점을 선택합니다. </li><li> 즉시 주위 산소 수준에서 첫 이미지를 캡처 후 장치에 가스 흐름을 시작 정밀 유량 조절기를 엽니다. 산소 concentr의 기간과 정도를 평가하기 위해 적절한 간격으로 이미지를 캡처에이션의 평균 (30 분마다 10 초 예). </li></ol></li></ol> 5. 애플 리케이션 <ol><li> 상처 치유 <ol><li> 실험 하루 전에, 우물에 가스 거품 형성을 억제 줄이기 위해 혈청이없는 배지에서 소독을 PDMS 삽입을 만끽해보세요. </li><li> 6 잘 판에 confluency 100 % 문화 세포. </li><li> 상처를 시뮬레이트하기 위해 p200 피펫 팁과 monolayers에 바로 스크래치를 만듭니다. </li><li> 셀 미디어를 대기음, 5 ML 매체와 린스, 다시 대기음. 세포의 monolayer 방해하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 리필 세포 증식을 감소 4 ML 혈청 무료 매체로 우물. </li><li> 장소는 우물에 삽입하고 해당 산소 농도 각 잘 연결합니다. </li><li> 37 온수 무대에서 삽입과 장소 6 - 잘 플레이트 ° C. </li><li> 원하는 간격과 전체 기간에 세포의 시간 경과 이미지를 캡처합니다. MATLAB의 T_Scratch, 상처 측정 알고리즘은, unhealed 면적을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 6. 대표 결과 <ol><li> 장치 확인 hypoxic 삽입 장치는 0.5 % 산소로 안정화 2 분 미만을 필요로하는 산소의 평균 시간과 범위의 측면에서 hypoxic 챔버를 통해 큰 향상을 전시하고 있습니다. 장치 막 - 잘 하단 갑 크기가 큰 간격 크기가 정상 상태 산소 농도 값에 도달하는 더 많은 시간을 필요로, 평균 효율을 결정하는 중요한 요인이되었다. 이 디바이스는 또한 여러 조건의 형성을있게 한 우물에 공간 산소 제어할의 큰 거래를 허용하고, 심지어 잘의 표면에 걸쳐 순환 산소 프로필을 생성. </li><li> 상처 치유 세포 monolayers을 10 % 또는 21% 산소와 상처의 표면 영역에 노출된 것은 시간이 지남에 따라 분석했다. 21 % 산소에 노출 긁힌 자국이 가장 느린와 10 %의 가장 빠른를 마감했다. 그림 1은 17 시간의 과정을 통해 처음의 이미지를 보여줍니다. 그림 5의 그래프는 실험 기간 동안 두 산소 농도에 대한 개방 상처 영역의 비율을 보여줍니다. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"></a> 그림 1. 도식 및 장치 기능을 설명하는 다이어그램. 산소 삽입 장치는 종래의 석판술 (microfluidic 네트워크), 복제 성형 (microfluidic 네트워크 및 삽입 비계)에 의해 조작되며, (가스 투과 막) PDMS의 회전 정의. A) 산소 장치는 6 자 판으로 중첩. B) 24 96 - 웰 기둥 배열의 예. 기둥 C) 횡단면 설계도. 산소 입구를 통해 장치에 흐름과 기둥의 하단에 microfluidic 네트워크를 통해 여행. 산소 자유롭게 기둥 하단의 가스 투과 PDMS 막에 걸쳐 확산과 문화 미디어로 녹아 있습니다. D) 평균 연구에 대한 보세 유리 게시물, 위에서 단일 채널 기둥의 다양한 기능을 보여주는 현미경 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"></a> 그림 2. 산소 센서와 장치의 확인. 각 웰 내에서 산소 장력은 평면 루테늄 산소 센서를 사용하여 묘사했다. 모든 산소 혼합 미디어 버퍼링에 대한 균형 질소와 5% CO 2가 포함되어 있습니다. A) 플롯의 평균 시간과 효과에 게시 높이의 효과를 설명하고, 멤브레인와 세포 사이를 따라서 산소 확산 거리. 높이가 장치의 하단에 바운드 컷 유리 게시물에 의해 설립되었다. 세 게시 크기의 항복 평균 시간이 많은 hypoxic 챔버를 통해 향상되었습니다. 시간은 로그 스케일입니다. B) 플롯은 0.2 mm 간격 장치의 급속한 산소 평균 응답 시간을 묘사. C) 다중 위치 linescans 또한 장치가 도입된 산소 농도의 균질성을 보장하기 위해 microchannel에서 잘 걸쳐 촬영했다. 그래프가 0 %, 10 %, 10 분 21 % 산소를 일으키는 후 측정 산소 농도를 묘사. D) 장치가 효과적으로 오일을 통해 10 %의 산소를 유지합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="그림 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"></a> 그림 3. 더 복잡한 산소 microchannel 디자인 실험. A) 듀얼 조건 microchannel 설정은 안정 0% 14 일 동안 21 % 산소 프로필을 산출. B) 500 μm의 폭 microchannels의 interdigitated과 구불 구 불한 패턴 일에 걸쳐 확장주기적 산소 프로필에 전자 기둥 결과. microchannel 정렬이 어려웠다로 데이터가 한 대표 재판을 묘사합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="그림 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"></a> 그림 4. 상처 폐쇄 0, 7, 초기 스크래치 후 17시간의 Timelapse 이미지. 세포 실험 기간 내내 21 % 산소를 전달했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="그림 5" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"></a> 그림 5. 스크래치 분석의 상처 치유 속도에 산소 농도의 영향.

장치는 표준 SU - 8 석판술, 복제 성형 및 방적 및 polydimethylsiloxane의 완전히 만들어진 정의에 의해 조작됩니다. 가스는 원하는 평형 산소 농도으로 시스템을 구동, microchannel 기둥과 문화 미디어 사이의 농도 구배를 구축하기 위해 장치에 도입입니다. 장치가 효과적으로 잘 내부의 시간적 및 공간적 산소를 조절뿐 아니라 적절한 세포 행동을 조절하기 위해 표시되었습니다. 산소의 공간적 patterning는 기둥의 기지에서 microchannel에 의해 정의되고, 디자인의 다양한 photomask를 만들어 구현 될 수 있도록. 또한, 잘의 가스​​ 단계로 원하는 가스의 주입은 평균 시간과 hypoxia의 정도 향상을 위해 예정입니다. microfluidic 혼합 네트워크는 단 몇 재고 가스 탱크에서 소설 가스 혼합물을 생산하는 수단을 제공하는 장치에 맞게 수 있습니다. 마지막으로, 매체 교환을위한 메커니즘은 세포가 반응 수있는의 multiwell 판에서 장치의 제거에 대한 필요성을 제거합니다. 이 장치는 체외 또는 산소 농도 제어를 필요로 전직의 생체내 실험에서 애플 리케이션을했다. 산소는 신호 경로의 대부분에 영향을 미치는 중요한 생리적 변수로서 이익이 될 연구 분야는 연구자의 창의에 의해 제한됩니다. 산소 농도의 향상된 시간적 컨트롤에서 이익을 얻을 수 일부 필드는 많은 사람 중에서 암 전이, 수면 가사, 그리고 심장의 국소 빈혈 reperfusion 상해를 포함합니다. 예를 들어, 간헐 hypoxia은 지속 hypoxia과 normoxia에 비해 metastastis - 관련된 유전자의 숫자를 upregulating 더 침략 암과 상관되었습니다. 공간 제어 산소 그라디언트가 개발, 간 띠 모양 구성, 약물 독성, 그리고 줄기 세포 틈새에 중요한로서 또한 중요합니다. 이 문서에서 제시 장치가 작은 실험실 발자국, 비교적 간단 운영 요구 사항과 세포에 산소 노출을 통해 훨씬 더 제어할 수있는 시스템을 제공함으로써 연구의 영역의 번호를 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>PDMS-Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Planar FOXY 센서</td><td>Ocean Optics</td><td>FOXY-SGS-M</td><td>코팅된 현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>가스 조절기</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>FL-1472-G</td><td></td></tr><tr><td>가스</td><td>Airgas</td><td>맞춤형 혼합물</td><td>모두 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 함유</td></tr><tr><td>SU-8 2150</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 함유 MDCK 성장 배지</td><td>SAFC Global</td><td>M3803</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr></tbody></table>

자기편 셀룰러 문화에 대한 산소 삽입 제작 및 운영

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

산소는 많은 세포 통로의 핵심 모듈 레이터이지만, 현재의 장치가 좋으면<em&gt; 체외에서</em&gt; 산소 변조는 생물 의학 연구의 요구를 충족하기 위해 실패합니다. hypoxic 챔버는 표준 문화 혈관에서 산소를 제어하는​​ 간단한 시스템을 제공하고 있지만, 생리 현상의 다양한 공부에 애플 리케이션을 방지, 세포 표면에서 산소 농도 이상의 정확한 시간적 및 공간적 통제 부족합니다. 다른 시스템은 hypoxic 챔버에 따라 개선, 그러나 그들의 작업에 대한 전문적인 지식과 장비를 요구 평균 연구자에 대한 그들을 위협하고있다. multiwell 플레이트에 대한 microfabricated 삽입이보다 효과적으로 찾을 수 더 나은 모델이 생리 현상에 대한 시간적 공간적 및 산소 농도를 제어하기 위해 개발되었습니다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 플랫폼은 표준 multiwell 판에 둥지 및 목표 가스 투과 막과 수동 microfluidic 가스 네트워크의 역할은 자기편 세포에 산소 공급을 조절하는 polydimethylsiloxane 인서트로 구성되어 있습니다. 이 장치는 사용하기 간단하며 플랫폼에 원하는 산소 농도를 소개하기 위해 압력을 제공하는 가스 실린더에 연결되어 있습니다. 제조는 실리콘 웨이퍼에 회전 표준 SU - 8 석판술, 복제 성형, 그리고 정의 PDMS의 조합을 포함한다. 장치의 구성 요소는 휴대용 플라즈마 시스템을 사용하여 표면 처리 후 접착합니다. 검증은 평면 형광 산소 센서와 함께 수행됩니다. 평균 시간은 분 순서에 산소 프로필 다양한 찾을 사람을 모방하는 등 본 연구에서 얻은 순환 프로필로 장치 디자인, 심지어 산소 그라디언트에 따라 획득 수<em&gt; 생체내에</em&gt;. 장치 기능의 손실없이 일반적인 방법을 사용하여 세포 배양을위한 소독 수 있습니다. 을 연구하는 장치의 적용<em&gt; 체외에서</em&gt; 상처 치료 반응이 증명됩니다.

6 잘 판의 공간 및 시간적 산소 이상의 향상된 제어를 제공하는 추가 기능에 대한 플랫폼의 제작 및 검증. 이 디바이스는 문화 시스템의 숫자로 적용할 수 있으며, 상처의 치유에 대한 산소의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

산소는 많은 세포 경로의 핵심 조절 인자이지만, 인비트로(in vitro) 산소 조절을 가능하게 하는 현재의 장치들은 생의학적 필요를 충족시키지 못하고 있습니다...

저산소 인서트 장치는 6-웰 플레이트의 웰에 끼워지는 6개의 필라로 구성되어 있습니다. 가스는 필라 하단의 미세 유체 네트워크를 통해 흐르며, 가스 네트워크와 배양 배지를 분리하는 가스 투과성 PDMS 막을 통해 확산될 수 있습니다. 이 장치는 산소원인 필라 하단의 미세 유체 네트워크와 세포 사이의 확산 경로 길이를 최소화하여 산소 농도의 더 빠른 평형화를 가능하게 합니다.또한 이 장치는 포토마스크를 이용한 표준 포토리소그래피로 제작된 미세유체 가스 네트워크 설계에 의해 결정되는, 세포에 노출되는 산소의 공간적 패턴을 훨씬 더 세밀하게 제어할 수 있게 해줍니다. 안녕하세요, 저는 일리노이 대학교 시카고 캠퍼스 바이오공학과 David Edington 교수님 연구실의 Sean Ard입니다. 안녕하세요, 저도 Edington 연구실 소속인 Ellie입니다.오늘은 6-well 플레이트 내의 인비트로(in vitro) 세포 배양물을 서로 다른 산소 농도에 노출시키기 위한 맞춤형 장치를 제작, 검증 및 활용하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 상처 치유, 활성 산소종 생성 및 이동에 산소가 미치는 영향을 연구하기 위해 이 절차를 사용해 왔습니다. 그럼 시작하겠습니다.산소 공급 인서트를 제작하기 위해, 전구체(prepolymer)와 경화제(curing agent)를 10:1 비율로 섞어 Polymethyl Sloane 또는 PDMS를 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라, PDMS 혼합물을 표준 6-웰 배양 플레이트의 모양을 모방하여 가공된 Delrin 몰드에 붓습니다. 75 °C에서 하룻밤 동안 경화시키면, 결과물로 얻어진 복제 몰드 필러 어레이(pillar array)가 산소 공급 인서트를 구성하는 세 가지 구성 요소 중 첫 번째 요소가 되며, 이를 통해 산소 공급 인서트를 제작하기 위한 두 번째 핵심 구성 요소를 제작할 수 있습니다.먼저 SU 8 21 50을 스핀 코팅하여 SU 8 마스터를 준비합니다. 실리콘 웨이퍼에 포토마스크를 적용하고, 포토마스크를 통해 SU 8을 UV에 노출시켜 마이크로채널 두께가 300 µm인 마스터 몰드를 제작합니다. SU 8 마스터 위에 PDMS를 붓고 75 °C에서 2시간 동안 경화시켜, 최종적으로 각 필러 하단에 마이크로채널을 형성하게 될 양각 몰드를 얻습니다.장치의 세 번째 구성 요소는 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS를 500 RPM으로 10초 동안 스핀 코팅한 후, 900 RPM으로 30초 동안 추가 코팅하여 100 µm 두께의 멤브레인을 제작함으로써 만들어집니다. PDMS는 가스 투과성이 있으므로, 이 멤브레인을 통해 마이크로 채널로 산소를 직접 공급할 수 있습니다. 모든 구성 요소가 준비되면, 각 접합 표면을 1분 동안 산소 플라스마 처리합니다.휴대용 플라스마 장치를 사용하여 먼저 6개의 마이크로채널 구성 요소를 필라 어레이에 접합한 다음, 각 필라에 두 개의 구멍을 뚫어 가스 유입구 및 유출구로 사용합니다. 마지막으로, 접합을 용이하게 하고 기포를 배출하기 위해 마이크로채널 바닥에 멤브레인을 접합합니다. 플라스마 처리된 표면은 핀셋 끝을 사용하여 약 1분 동안 함께 누릅니다. 각 접합 단계 사이에 1시간 동안 기다려 장치가 완전히 접합되고 교정될 수 있도록 합니다.장치 제작이 완료되면, 실제 실험에서 산소 공급 인서트를 사용할 때 세포가 받는 산소 수치를 보정해야 합니다. 보정을 위해 산소에 의해 소광되는 형광 루테늄 염료 코팅이 포함된 형광 산소 센서 또는 foxy slide를 사용하십시오. Foxy slide는 6-웰 플레이트 바닥에 맞게 미리 절단되어 있습니다.foxy 슬라이드는 웰 표면을 최대한 많이 덮을 수 있도록 절단해야 합니다. foxy 슬라이드의 두께가 약 1mm이므로, 적절한 막 확산을 위해 원하는 거리를 유지하도록 장치를 수정하십시오.이 거리는 실험에 따라 달라지지만, 대부분의 경우 핸드헬드 플라즈마 장치를 사용하여 1mm 미만으로 유지해야 합니다. 두께 1mm의 유리 현미경 슬라이드를 길이 약 6mm, 너비 4mm의 포스트 형태로 절단하여 장치 바닥에 부착하십시오. 장치는 슬라이드 절단면 위의 포스트에 거치됩니다.산소 소모량을 검증하기 위해 0.17 millimeters의 확산 간격을 형성하는 유리 커버 슬립을 사용할 수도 있습니다. 산소를 측정할 6-웰 플레이트의 웰에 실온의 탈이온수를 3 milliliters씩 넣습니다. 장치를 플레이트에 배치하고 metamorph 소프트웨어를 사용하여 foxy 센서에서 원하는 위치의 번호와 지점을 선택합니다.산소 농도를 측정하기 위해 슬라이드를 준비합니다. 산소 가스 탱크와 저산소 삽입 장치 사이에 타이 건 튜브를 연결합니다. 전달되는 가스를 정밀하게 제어하기 위해 분당 50에서 100 milliliters의 유량으로 설정된 정밀 유량 조절기를 사용합니다.정밀 유량 조절기가 닫혀 있는지 확인합니다. 탱크 상단 조절기를 먼저 열고, 이어서 정밀 조절기를 엽니다. 15분 후에 유량을 분당 10에서 20 사이로 줄입니다.물속에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해, 향후 1시간 동안 유량 값을 면밀히 관찰하고 필요에 따라 조정하십시오. 시스템이 평형 상태에 도달하는 동안 압력 강하가 변하여 플레이트와 foxy 센서의 이미지를 캡처하기 위한 유량이 변경될 수 있기 때문입니다. 형광 장치가 장착된 Olympus IX 71 현미경, Q Imaging Tiga의 전하결합소자(CCD) 카메라, SRV 및 Metamorpho 이미지 획득 소프트웨어가 사용됩니다. 현미경에는 들뜸 파장 475 nanometers 및 방출 파장 600 nanometers의 foxy 호환 형광 필터인 Olympus 3 1 0 2 0가 장착되어 있습니다.장치의 평형 도달 시간과 산소화 정도를 테스트하려면, foxy 슬라이드에서 산소 농도를 측정할 세 지점을 선택하십시오. 가스 흐름을 시작하기 직전에 슬라이드의 이미지를 캡처하십시오. 가스가 장치를 통해 흐르는 동안 30분 동안 10초 간격으로 이미지를 캡처하여 불균질성과 산소 전달력을 테스트하십시오.채널 너비에 걸쳐 1 mm 간격으로 여러 지점을 설정하고, metamorph를 사용하여 웰 표면의 산소 농도를 측정합니다. 각 위치의 평균 이미지 강도를 내보내고, 형광 강도에 따른 산소 농도를 그래프로 나타냅니다. 형광 강도와 산소 농도의 관계를 나타내는 0~10% 구간과 10~21% 구간에 선형 곡선을 피팅하여 검정 곡선을 생성합니다. 측정된 각 위치의 원시 강도 데이터는 metamorph에서 내보낸 후 Microsoft Excel 또는 기타 통계 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석할 수 있습니다.장치 보정이 완료되면 상처 치유 분석과 같은 실험을 시작할 수 있습니다. 실험 전 24시간 이내에 보정된 인서트를 121 °C에서 15분 동안 오토클레이브로 멸균하고, 이후 오염을 방지하기 위해 라미나 플로우 배양 후드 내에서 작업하십시오. 플레이트 웰에 삽입할 때 기포가 발생하는 것을 억제하기 위해 멸균된 PDMS 인서트를 무혈청 배지에 24시간 동안 담가 둡니다. 6웰 플레이트에서 MDCK 세포 또는 기타 부착성 세포를 100% 합류도(confluency)까지 배양한 후, P 200 피펫 팁을 사용하여 단일층에 직선형 스크래치를 만듭니다. 이 스크래치는 부착성 단일층의 상처를 모사합니다.단일층이 손상되지 않도록 세포 배지를 흡입하여 제거하고 5 mL의 배지로 헹굽니다. 다시 흡입하여 제거한 후, 웰에 3 mL의 무혈청 배지를 채웁니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 장치를 플레이트에 천천히 삽입합니다.장치를 삽입할 때 각도를 조절하면 기포를 한쪽으로 배출하는 데 도움이 됩니다. 장치에 과도한 압력이 가해지지 않도록 주의하십시오. 압력이 너무 세면 PDMS가 변형되어 하단의 세포가 손상될 수 있습니다. 플레이트와 장치를 37 °C로 가열된 현미경 스테이지 위에 올리고, 소스 가스 탱크에서 나오는 튜브를 장치의 입구 및 출구 포트에 연결하십시오.배양 인큐베이터에는 튜브가 들어갈 수 있는 구멍이 있어야 하며 튜브가 연결되어 있어야 합니다. 장치를 인큐베이터에 넣은 후, 이전에 설명한 것과 동일한 가스 흐름 시작 절차를 수행하여 상처 치유를 평가합니다. 이전에 설명한 장비와 이미징 소프트웨어를 사용하여 15~18시간 동안 20분마다 세포의 타임랩스 이미지를 캡처합니다. T scratch 상처 측정 알고리즘을 사용하여 원하는 실험 기간 후의 미치유 표면적을 분석할 수 있습니다. 가스 흐름을 중단하고 플레이트를 제거한 뒤, 필요한 경우 추가적인 세포 처리 과정을 진행합니다. 저산소 인서트 장치는 여기에서 보는 바와 같이 0.5% oxygen으로 안정화되는 데 2분 미만이 소요됩니다.장치 멤브레인 웰 바닥의 간격 크기는 평형 효율을 결정하는 중요한 요인이었으며, 간격이 클수록 정상 상태의 산소 농도 값에 도달하는 데 더 많은 시간이 필요했습니다. 또한 이 장치는 단일 웰 내의 공간적 산소 공급을 정밀하게 제어할 수 있어, 다양한 조건의 형성이 가능하며 웰 표면에 걸쳐 주기적인 산소 프로파일을 생성할 수도 있습니다. MDCK 세포 단층을 10% 또는 21% 산소에 노출시켰으며, MATLAB Ts scratch wound tailing 알고리즘을 사용하여 상처 부위의 표면적을 시간에 따라 분석하였습니다.총 17시간 중 11시간이 경과했을 때, 10% oxygen에 노출된 경우 원래 상처의 6.87%가 남아 있었던 반면, 21% oxygen 조건에서는 상처의 64.4%가 남아 있었습니다. 여기서 보시는 바와 같이, 두 oxygen 농도 모두에서 oxygen 농도는 상처 개방 면적과 음의 상관관계를 보입니다. 본 실험 기간 동안, 저희는 scratch wound healing assay를 위한 저산소 insert 장치를 제작, 검증 및 활용하는 방법을 보여드렸습니다. 이 장치는 실험실 내 점유 면적이 작고 세포 표면의 공간적 및 시간적 oxygen 조절 능력이 훨씬 뛰어나다는 점에서 다른 oxygenation 시스템보다 여러 가지 장점을 제공합니다.이 장치는 in vitro 세포 배양에 미치는 산소 또는 이산화탄소와 같은 다른 가스의 영향을 연구하는 거의 모든 실험실에서 활용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 멸균된 장치와 배양액을 하룻밤 동안 담가두어 실험 중 기포 형성을 최소화하는 것이 중요합니다. 또한, 실험을 시작하기 전 시스템이 평형 상태에 도달하도록 하십시오.이는 시스템 내의 압력이 평형을 이룸에 따라 유속이 변하기 때문입니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

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Microfluidic Double-layer Device를 사용한 미생물 단일 세포 성장 분석에서 빠른 산소 진동 생성

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