자기편 셀룰러 문화에 대한 산소 삽입 제작 및 운영

저산소 삽입 장치에는 6개의 기둥이 6개의 우물에 둥지를 틀고 있습니다. 웰 플레이트 가스는 기둥 바닥의 미세유체 네트워크를 가로질러 흐르고 가스 투과성 PDMS 멤브레인을 가로질러 확산되어 가스 네트워크와 배양 배지를 분리할 수 있습니다. 이 장치는 산소 공급원, 기둥 바닥의 미세유체 네트워크 및 보다 빠른 산소 농도를 허용하는 셀 사이의 확산 경로 길이를 최소화합니다. 평형.

이 장치는 또한 포토 마스크를 사용하여 표준 포토리소그래피로 만든 미세유체 가스 네트워크 설계에 의해 결정되는 세포에 노출된 산소의 공간 패턴을 훨씬 더 잘 제어할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 시카고 일리노이 대학교 생명공학과 데이비드 에딩턴 박사 연구실의 숀 아드입니다. 안녕하세요, 저는 Edington Lab의 Ellie입니다.

오늘은 맞춤형 장치를 제작, 검증 및 활용하여 6중 플레이트의 체외 세포 배양을 다양한 산소 농도에 노출시키는 방법을 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 산소가 상처 치유, 활성 산소 종 생성 및 이동에 미치는 영향을 연구했습니다. 시작하겠습니다.

산소화 인서트의 제작을 시작하려면 폴리메틸 슬론 또는 PDMS를 프리 폴리머와 경화제 사이의 10:1 비율로 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라 PDMS 혼합물은 표준 6웰 배양 플레이트의 모양을 모방하도록 패턴화되어 이전에 가공된 Dell 런 몰드에 추가됩니다. 하룻밤 사이에 섭씨 75도에서 경화되면 생성된 복제 성형 기둥 배열은 산소화 인서트의 두 번째 핵심 구성 요소를 제조하기 위해 산소 공급 인서트를 구성하는 세 가지 구성 요소 중 첫 번째 구성 요소를 형성합니다.

SU 8 마스터는 먼저 SU 8 21 50을 회전시켜 준비합니다. 실리콘 웨이퍼에서 포토 마스크가 웨이퍼에 적용되고 SU eight가 포토 마스크를 통해 UV에 노출되어 300마이크로미터 두께의 마이크로채널 마스터 몰드를 만듭니다. SU eight Master 위에 PDMS를 붓고 섭씨 75도에서 2시간 동안 경화하면 궁극적으로 각 기둥의 바닥에 마이크로 채널을 형성할 포지티브 몰드가 생성됩니다.

이 장치의 세 번째 구성 요소는 실리콘 웨이퍼에서 500RPM으로 10초 동안 PDMS를 회전한 다음 30초 동안 900RPM으로 회전시켜 100마이크로미터 두께의 멤브레인 뇌를 만들어 제작됩니다. PDM은 가스 투과성이므로 산소는 이 멤브레인을 통해 마이크로 채널로 직접 전달될 수 있습니다. 모든 구성 요소가 준비되면 각 접합 표면은 1분 동안 산소 플라즈마 처리를 받습니다.

휴대용 플라즈마 장치를 사용하여 먼저 6개의 마이크로 채널 구성 요소를 기둥 배열에 접착한 다음 각 기둥에 두 개의 구멍을 뚫어 가스 입구와 배출구 역할을 합니다. 마지막으로, 멤브레인을 마이크로 채널의 바닥에 접착하여 결합을 촉진하고 기포를 배출합니다. 플라즈마 처리된 표면은 블렌드를 사용하여 약 1분 동안 함께 압착되고, 한 쌍의 핀셋이 끝나고, 장치가 완전히 결합되고 보정될 수 있는지 확인하기 위해 각 접합 사이에 1시간을 기다립니다.

완전한 장치가 제작되면 실제 실험에서 산소화 인서트를 사용할 때 세포가 받는 산소 수준을 보정해야 합니다. 보정을 위해 형광 산소 센서 또는 산소에 의해 담금질되는 형광 루테늄 염료 코팅이 포함된 폭시 슬라이드를 사용하십시오. 폭시 슬라이드는 6웰 플레이트의 바닥에 맞도록 미리 절단되어 있습니다.

폭시 슬라이드는 우물 표면을 가능한 한 많이 덮도록 절단해야 합니다. 폭시 슬라이드의 두께는 약 1mm이므로 적절한 멤브레인을 위해 원하는 거리를 유지하도록 장치를 수정하십시오. 슬라이드 확산.

이 거리는 실험에 따라 다르지만 대부분의 경우 휴대용 플라즈마 장치 본드 4 절단 1mm 두께의 유리 현미경을 사용하여 1mm 미만이어야 합니다. 길이가 약 6mm, 너비가 4mm인 기둥을 장치 아래쪽으로 밉니다. 장치는 슬라이드 컷 상단의 기둥에 놓입니다.

유리 커버 슬립은 산소 사용을 검증하기 위해 0.17mm의 확산 갭에도 사용할 수 있습니다. 실온에서 3밀리리터의 탈이온수를 6개의 우물 플레이트의 우물로 넣어 산소를 측정합니다. 장치를 플레이트에 놓고 변형 소프트웨어를 사용하여 폭시 센서에서 원하는 위치의 수와 위치를 선택합니다.

산소 농도를 분석하기 위해 슬라이드합니다. 산소 가스 탱크와 저산소 삽입 장치 사이에 타이 건 튜브를 연결합니다. 분당 50-100밀리리터의 유속으로 설정된 정밀 유량 조절기는 전달된 가스를 정밀하게 제어하는 데 사용됩니다.

정밀 유량 조절기가 닫혀 있는지 확인합니다. 탱크 상단 조절기를 먼저 연 다음 정밀 조절기를 엽니다. 15분 후에 분당 10에서 20 사이로 유속을 줄입니다.

물에 거품이 생기지 않도록 다음 시간 동안 유속 값을 면밀히 관찰하고 시스템이 평형을 이루는 동안 압력 강하가 변경되어 플레이트 및 폭시 센서의 이미지를 캡처하기 위해 유속을 변경하므로 필요에 따라 조정하십시오. 형광이 장착된 Olympus IX 71 현미경, Q Imaging의 전하 커플 장치 카메라, Tiga, SRV 및 Metamorpho 이미지 수집 소프트웨어가 사용됩니다. 현미경에는 여기 파장이 475나노미터이고 방출 파장이 600나노미터인 폭시 호환 형광 필터인 Olympus 3 1 0 2 0이 장착되어 있습니다.

장치의 평형 시간과 산소화 정도를 테스트하려면 산소 농도를 측정할 폭시 슬라이드의 세 지점을 선택합니다. 가스 흐름을 시작하기 직전에 슬라이드의 이미지를 캡처합니다. 가스가 장치를 통해 흐를 때 30분 동안 10초 간격으로 이미지를 캡처하여 이질성 및 산소 전달을 테스트합니다.

채널 너비에 걸쳐 1mm 간격으로 여러 지점을 설정하고 변형을 사용하여 우물 표면의 산소 농도를 측정합니다. 각 위치에 대한 평균 이미지 강도를 내보내고 형광 강도에 따라 산소화 농도를 플로팅합니다. 형광 강도를 산소 농도와 관련하여 선형 곡선을 0에서 10% 라인 및 10에서 21% 라인에 피팅하여 검량 곡선을 생성합니다. 각 위치에 대해 측정된 원시 강도 데이터를 변형에서 내보내고 Microsoft Excel 또는 기타 통계 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석할 수 있습니다.

장치가 보정되면 상처 치유 분석과 같은 실험을 통해 실험 전 24시간 이내에 섭씨 121도에서 15분 동안 보정된 인서트를 고압멸균을 시작하고 층류 배양 후드에서 작업하여 후속 오염을 방지할 수 있습니다. 멸균된 PDMS 인서트를 무혈청 배지에 24시간 동안 담궈 플레이트 웰 배양액, MDCK 세포 또는 기타 부착 세포에 삽입할 때 가스 기포를 억제하고 6웰 플레이트에서 100% 유창성을 유지하고 P 200 피펫 팁으로 단층에서 직선 스크래치를 생성합니다. 긁힌 자국은 접착 단층의 상처를 시뮬레이션합니다.

단층을 방해하지 않고 세포 배지를 흡입하고 5ml의 배지로 헹굽니다. 다시 흡입하고 웰에 3ml의 무혈청을 다시 채웁니다. 중간은 장치를 플레이트에 부드럽게 삽입하고 거품이 생기지 않도록 합니다.

삽입하는 동안 장치를 비스듬히 기울이면 한쪽 면으로 기포를 배출하는 데 도움이 됩니다. PDMS를 변형시켜 기본 세포를 분쇄할 수 있을 만큼 장치에 과도한 압력을 가하지 않도록 주의하십시오. 플레이트와 장치를 섭씨 37도의 가열된 현미경 스테이지에 놓고 소스 가스 탱크의 튜브를 장치의 입구 및 출구 포트에 연결합니다.

배양 인큐베이터에는 튜빙이 들어갈 수 있는 구멍이 있어야 하며 튜빙이 연결되어야 합니다.장치를 인큐베이터에 넣은 후 앞에서 설명한 대로 가스 흐름을 시작하는 것과 동일한 절차를 따라 상처 치유를 평가하고 앞에서 설명한 장비 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 15-18시간 동안 20분마다 세포의 타임 랩스 이미지를 캡처합니다. T 스크래치 상처 측정 알고리즘을 사용하여 원하는 실험 기간 후에 치유되지 않은 표면적을 분석할 수 있습니다. 가스 흐름을 중지하고 플레이트를 제거한 다음 원하는 경우 추가 셀 처리를 진행합니다. 저산소 삽입 장치는 여기에서 보이는 것과 같이 0.5%산소로 안정화되는 데 2분 미만이 필요합니다.

장치 멤브레인 웰 바닥 갭 크기는 평형 효율을 결정하는 데 중요한 요소였으며 갭 크기가 클수록 정상 상태 산소 농도 값에 도달하는 데 더 많은 시간이 필요했습니다. 또한 이 장치는 단일 우물에서 공간적 산소화를 크게 제어할 수 있어 여러 조건을 형성할 수 있으며 유정 표면을 가로질러 순환 산소 프로파일을 생성할 수도 있습니다. MDCK 세포 단층은 10% 또는 21%의 산소에 노출되었으며 MATLAB Ts 스크래치 상처 테일링 알고리즘을 사용하여 시간이 지남에 따라 상처 표면적을 분석했습니다.

총 17시간 중 11시간 후, 10%의 산소에 노출되었을 때 원래 상처의 6.87%가 남아 있는 반면 상처의 64.4%가 21% 미만으로 유지되었습니다.여기에서 볼 수 있듯이 산소 농도는 두 산소 농도 모두에 대해 상처 개방 영역과 음의 상관관계가 있습니다. 실험 기간 동안 스크래치 상처 치유 분석을 위해 저산소 삽입 장치를 제작, 검증 및 활용하는 방법을 보여주었습니다. 이 장치는 다른 산소화 시스템에 비해 실험실 설치 공간이 작고 세포 표면의 공간적 및 시간적 산소화에 대한 제어력이 훨씬 더 큰 등 여러 가지 이점을 제공합니다.

이 장치는 체외 세포 배양에 대한 산소 또는 이산화탄소와 같은 기타 가스의 영향을 연구하는 거의 모든 실험실에서 사용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 멸균된 장치와 배양 배지를 밤새 담그고 실험 중 기포 형성을 최소화하는 것이 중요합니다. 또한 실험을 시작하기 전에 시스템이 동일하도록 합니다.

이는 시스템의 압력이 동일해짐에 따라 유량이 변하기 때문입니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.