써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

본 비디오 논문에서는 Solaris QPCR 분석법을 이용한 실시간 PCR(real time PCR)을 시연합니다. Solaris QPCR 분석법은 특정 유전자의 모든 알려진 스플라이스 변이체(splice variants)를 검출하도록 설계된 유전자 특이적 프로브 및 프라이머 쌍입니다. 보편적인 열 순환 조건 하에서, Solaris 프로브는 5' 말단에 마이너 그루브 바인더(minor groove binder) 작용기와 FA 리포터가 있으며, 3' 말단에는 이클립스 다크 퀀처(eclipsed dark quencher)가 결합되어 있습니다.

실시간 PCR의 변성 단계에서 프로브는 용액 상태로 유지되며 FAM 리포터 형광은 소광됩니다. 어닐링 및 신장 단계 동안 프라이머와 프로브가 표적 서열에 결합하면서 소광제가 FAM으로부터 분리됩니다. 이후 프로브가 해리될 때 FAM이 강한 형광 신호를 내며, 형광은 다시 소광됩니다.

이 효율적인 분석법의 민감도, 특이도 및 재현성을 입증하는 실시간 PCR 결과가 도출되었습니다. 안녕하세요, 저는 콜로라도주 라파예트에 위치한 Thermo Fisher Scientific 연구개발팀의 James Covino입니다. 오늘은 Lars QPCR 유전자 발현 시약을 사용하여 표준 QPCR 반응을 설정하는 절차를 보여드리겠습니다.

저희 실험실에서는 RNA 간섭 기술을 이용하여 표적 유전자의 넉다운을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. Solaris QPCR assay STEM은 MGB 및 super base 기술을 활용하는 고유한 알고리즘으로 정의되며, 이를 통해 인간 및 마우스 주석 유전자의 98%에 대해 단일하며 편리한 분석법을 제공합니다.

일반적으로 DNA 프로브와 프라이머 설계는 염기의 수와 종류에 의해 결정되는 프로브의 해리 온도(melting temperature)에 의해 제한됩니다. 서열이 길수록, 그리고 GC 함량이 높을수록 해리 온도가 더 높아집니다. Solaris 프로브에 사용되는 마이너 그루브 결합 부위(minor groove binding moiety)는 DNA 이중나선의 마이너 그루브에 결합하여 프로브와 표적 서열 간의 상호작용을 안정화합니다.

이는 멜팅 온도를 높여 더 짧은 프로브를 사용할 수 있게 합니다. 또한 Solaris 알고리즘은 AT 결합의 안정성을 높이고 guanine이 풍부한 서열에서 GG 자기 결합을 제거하기 위해 슈퍼 베이스(super bases)라고 불리는 변형 뉴클레오타이드를 선택적으로 통합합니다. 이를 통해 평소라면 피했을 표적 서열도 사용할 수 있게 됩니다.

이러한 기술의 사용으로 부여된 향상된 서열 유연성을 통해 단일 유전자의 모든 알려진 스플라이스 변이체(splice variants)를 인식하는 프라이머 프로브 세트를 설계할 수 있습니다. 오염된 게놈 DNA의 증폭을 방지하여 특이성을 높이기 위해 가능한 경우마다 표적 부위에 엑손 접합부 걸침 영역(exon junction spanning regions)을 포함시켰으며, 결과적으로 생성된 프라이머 프로브 세트는 특이성 확보를 위해 게놈, 전사체, 가성유전자(pseudogene)의 세 가지 서로 다른 데이터베이스를 사용하여 blast 분석을 수행하였습니다. 또한, Solaris 프라이머 프로브 세트는 모든 QPCR 분석의 사이클링 조건이 동일하도록 완전히 최적화되어, 단일 PCR 런에서 다양한 전사체의 발현을 평가할 수 있습니다.

qPCR R 실험 계획을 시작하려면 thermo.com/solaris에서 제공하는 genius 제품 검색을 사용하여 관심 유전자의 qPCR 수행에 필요한 시약을 확인하십시오. 검색 문의 상자를 클릭하고 적절한 표적 생물체를 선택하십시오. genius 제품 검색은 다양한 유전자 식별자를 처리할 수 있습니다.

관심 유전자에 대해 제안된 검색어 중 하나를 입력한 다음 검색을 클릭하고, 관심 유전자를 확인한 후 왼쪽에 있는 선택을 클릭하십시오. 그러면 해당 관심 유전자에 대해 사용 가능한 다양한 시약이 표시되는 창이 열립니다. Solaris 유전자 발현 분석 하단의 qPCR 검출 탭을 클릭하십시오.

최적으로 설계된 Solaris 프로브 프라이머 어세이 하나가 표시됩니다. 이 하나의 어세이로 관심 유전자의 모든 알려진 스플라이싱 변이체를 검출할 수 있습니다. 적절한 프라이머 제제가 확인되면, 메뉴에서 사용할 qPCR 사이클러를 찾아 호환되는 마스터 믹스를 식별하십시오. 이때 별도의 ROX 수동 참조 염료 바이알이 포함된 마스터 믹스, ROX 믹스 또는 Low ROX 믹스 중에서 선택하십시오.

본 실험에서는 Roche light cycler 480을 사용하므로, master mix plus rock vial이 사용됩니다. 또한, 연구에 적절한 참조 유전자가 포함되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 모든 Solaris QP CR 시약이 준비되면 B2M이 사용될 예정입니다.

사용 전까지 -20 °C에서 보관해야 합니다. 시약은 최소 12개월 동안 안정적입니다. 반복적인 냉동-해동은 피해야 합니다.

샘플 RNA에 대해 역전사 반응을 수행하여 qPCR용 cDNA를 준비합니다. cDNA가 준비되면 Solaris 분석 시약과 마스터 믹스를 얼음 위에서 해동합니다. 마스터 믹스에는 유전자 특이적 분석 시약과 템플릿 성분을 제외한 정량적 PCR에 필요한 모든 구성 요소인 thermostat, DNA polymerase dn, TPS rocks가 포함되어 있습니다.

QPCR 장비에 락(rocks)과 내부 청색 염료가 포함된 전용 반응 버퍼가 필요한 경우, PCR 등급의 물과 QPCR 플레이트도 준비하십시오. 용액이 해동되면 가볍게 튕겨 섞어준 다음, 시약 손실을 방지하기 위해 용액을 짧게 원심 분리합니다. 다음으로, 15 mL 튜브에 1x Solaris QPCR assay 및 마스터 믹스를 준비합니다.

384-웰 플레이트에서 실행할 원하는 샘플 수에 맞춰 2x 마스터 믹스 5 µL, 20X Solaris assay 0.5 µL, 그리고 PCR 등급의 물을 조합하여 각 웰의 최종 부피가 10 µL가 되도록 합니다. cDNA를 추가한 후, 시약 오염이나 게놈 DNA 오염 여부를 각각 확인하기 위한 무템플릿 대조군(NTC) 및 무역전사효소 대조군(no RT)을 포함하여 각 샘플당 3회 반복 실험을 위한 충분한 양을 준비하십시오. 그 다음, 혼합물을 멸균 리저버로 옮깁니다.

그 다음, 멀티채널 피펫을 사용하여 1x 마스터 믹스의 적절한 부피를 PCR 플레이트의 해당 웰에 분주합니다. 흰색 플레이트를 사용하는 경우, 마스터 믹스에 포함된 내부 청색 염료가 피펫팅 진행 상황을 확인하는 데 도움이 됩니다. 모든 사이클 조건이 동일하므로 동일한 플레이트에서 여러 cDNA 라이브러리와 참조 유전자를 분석할 수 있습니다.

1x 마스터 믹스를 해당 웰에 넣은 후, 희석된 CD NA 템플릿을 각 웰에 추가하여 최종 부피가 10 microliters가 되도록 하고 피펫으로 상하 혼합합니다. 여기에서 보는 것과 같이 점착성 씰 또는 열 밀봉 씰로 플레이트를 밀봉합니다.

플레이트를 원심분리기에 넣고 회전시켜 시약을 웰 바닥으로 가라앉히고 형광 판독 프로그램에 방해가 될 수 있는 기포를 제거합니다. 서모사이클러에서 Solaris QPCR 마스터 믹스에 포함된 핫 스타트 폴리머레이스는 95 °C에서 15분 동안 1회 활성화한 후, 95 °C에서 15초 동안 변성시키고 60 °C에서 60초 동안 어닐링 및 신장 단계를 거치는 과정을 40회 반복합니다. 이 프로토콜은 증폭되는 유전자와 관계없이 모든 Soliris QPCR 분석에 동일하게 적용됩니다.

마지막으로, 플레이트를 QPCR 기기에 넣고 프로그램을 시작합니다. 이 그림은 Solaris 분석법의 높은 성능을 보여주며, 여기서는 CDC 20 및 F two RL one에 대한 Solaris QPCR 유전자 발현 분석법을 사용하여 합성 DNA 또는 cDNA의 10배 단계 희석액 10개를 증폭하였습니다. log 스케일의 증폭 곡선과 10. Log 10 희석액에 대한 표준 곡선은 낮은 입력 농도에서도 분석법의 높은 성능을 입증합니다.

각 분석의 성능은 10점 만점의 효율성 제곱값, 동적 범위, log 10 희석 배수 및 검출 한계로 측정됩니다. 여기에 제시된 데이터는 Solaris 분석의 재현성을 입증합니다. 본 실험에서는 Solaris QPCR 유전자 발현 분석 및 마스터 믹스를 사용하여 지리적으로 분리된 두 곳의 실험실에서 CD NA 분주액을 증폭하였습니다.

두 실험실 모두에서 두 가지 표적 유전자에 대해 동일한 발현 수준을 계산하였습니다. 지금까지 Solaris QPCR 유전자 발현 시약을 사용하여 표준 QPCR 반응을 설정하는 방법을 살펴보았습니다. 이 실험을 수행할 때는 시약의 최종 농도가 정확하도록 마스터 믹스를 설정하고, 적절한 생물학적 및/또는 기술적 반복 실험을 포함하는 것이 중요합니다.

또한, Solaris에 적합한 열 순환 조건으로 QPCR 기기를 설정하는 것이 매우 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.