머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

이 절차에서는 형광 표지된 RNA. 전사체는 XUS Cytes에 주입되고 그 국소화가 모니터링됩니다. 첫째, RNA는 형광 뉴클레오티드로 표지됩니다.

시험관 내 전사 반응에서 RNA는 미세 주입 장치에 로드됩니다. 난모세포를 주사 접시에 놓고 조심스럽게 마이크로 주사합니다. 마지막으로, 난모세포를 배양하여 컨포칼 현미경에서 이미징하기 전에 RNA 국소화가 발생할 수 있도록 합니다.

안녕하세요, 저는 브라운 대학의 분자 생물학, 세포 생물학 및 생화학과의 킴벌리 말로리 박사 실험실의 제임스 개그넌입니다. 오늘은 Xap 난모세포에서 세포 내 RNA 국소화를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 초기 척추동물 발달 동안 RNA 국소화에 필요한 RNA 구조와 단백질 인자를 연구합니다.

시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 함께 제공되는 서면 프로토콜에 설명된 대로 방사성 및 형광 표지된 mRNA를 전사합니다. DS를 추가하여 템플릿 DNA를 저하시킨 다음 EDTA를 추가하여 반응을 중지합니다.

통합되지 않은 뉴클레오티드 및 기타 작은 분자는 G 50 컬럼을 통해 회전하여 제거합니다. 그런 다음 RNA는 에탄올 침전에 의해 농축되고 세척 및 재현탁됩니다. 섬광 계수로 농도를 측정한 후 RNA를 50나노 몰로 희석하고 섭씨 영하 80도에서 5마이크로리터 분취액에 보관합니다.

미세주입을 수행할 준비가 되면 표지된 RNA의 Eloqua를 섭씨 70도에서 5분 동안 해동합니다. 그런 다음 실온의 마이크로 원심분리기에서 최대 속도로 10분 동안 회전하여 미립자를 제거하고 얼음 위에 보관합니다. 다음으로, xap 포스트 lavu 난소의 cytes trim 조각을 25ml의 3mg/ml를 포함하는 50ml 원뿔형 2개로 분리합니다.

pH 7.4에서 0.1 몰 인산칼륨 완충액의 콜라겐 분해 효소. 섭씨 18도에서 배치 간 변동으로 인해 부드럽게 흔듭니다. 콜라겐분해효소 처리 시간은 다를 수 있으며 육안 검사를 통해 주의 깊게 모니터링해야 합니다.

낙엽이 형성되도록 하려면 15분 동안 또는 난모세포가 난소에서 눈에 띄게 분리될 때까지 계속 흔들어 난모세포가 원뿔형 튜브의 바닥에 가라앉도록 합니다. 솔루션을 제거하고 MBSH 버퍼로 교체합니다. 이것을 반복하고 두 번 더 씻어 총 세 번 씻습니다.

다음으로, 표준 광학 현미경에서 3-4단계 CYTES 및 MBSH 버퍼를 수동으로 분류합니다. 3기 세포는 완전히 불투명하지만 흰색입니다. 4단계에서는 세포가 약간 더 크고 색소로 얼룩덜룩합니다.

약간 투명한 cyte는 너무 젊고 완전히 착색되거나 편광 색소 분포를 보이는 cyte는 너무 오래되었습니다. 마지막으로, 3.5인치 모세관을 당기고 베벨링하여 외경이 약 0.05mm인 바늘을 만들어 미세 주입을 위한 바늘을 준비합니다. 이제 mRNA 난모세포와 바늘이 준비되었으므로 미세주입을 진행합니다.

먼저 주입 주입 당 2나노미터를 전달하기 위해 desy water로 바늘을 보정합니다. 전선. 가스 제어 마이크로 인젝터를 사용하여 바늘을 로드하고 보정 전면 후 바늘에 주입할 RNA를 로드한 후 마이크로미터를 사용하여 입자 크기를 보정합니다. 다음으로 분류된 난모세포를 주사 접시에 놓습니다.MBSH 버퍼에서 접시에는 검은색 발포 고무 층이 포함되어 있습니다.

흰색 cyte는 검은색 배경에 잘 어울립니다. 그런 다음 각 난모세포에 50나노몰에서 2리터의 RNA를 조심스럽게 주입합니다. 각 난모세포를 한 번만 주입하고 주입이 완료되면 바늘이 막혔는지 정기적으로 확인하십시오.

남은 RNA를 배출하고 바늘을 데시 워터로 헹구고 주입을 위해 다음 RNA를 로드합니다. 주입 후 주입된 세포를 최대 1,000개까지 멸균된 24웰 플레이트의 웰로 이동합니다. CYTES는 웰당 배양할 수 있습니다.

완충액을 제거하고 웰당 400마이크로리터의 세포 배양 배지로 교체합니다. 그런 다음 배양 플레이트를 젖은 종이 타월과 함께 플라스틱 용기 안에 넣어 배양 중 습한 환경을 유지하고 원하는 배양 기간 후 8시간에서 48시간 사이의 시점 동안 섭씨 18도에서 난모세포를 배양합니다. 난모세포는 주입된 난모세포를 배양한 후 현미경 검사를 위해 준비할 수 있습니다.

죽은 난모세포를 분류하고 살아남은 난모세포를 유리병에 넣습니다. 난모세포의 90% 이상의 생존율이 일상적으로 관찰됩니다. 완충액을 M-E-M-F-A 고정제로 교체하고 20분 동안 cyte를 흔듭니다.

고정 기간이 완료된 후 고정 기간 동안 햇빛으로부터 난모세포를 보호하십시오. 고정액을 제거하고 동일한 부피의 MBSH 완충액으로 교체하여 난모세포를 세척합니다. 이 세탁을 한 번 더 반복하여 총 두 번 세탁합니다.

다음으로, 난모세포를 무수 메탄올로 세척합니다. 먼저 부피의 절반을 제거하고 메탄올로 교체합니다. 이 작업을 두 번 더 반복합니다.

이러한 세척 후 모든 용액을 제거하고 메탄올로 교체하십시오. 이 메탄올 세척을 한 번 더 반복합니다. 고정되고 탈수된 난모세포는 이미징할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다.

이미징하기 전에 Marie의 투명 매체를 유리 바닥 WPI 플루오로 접시에 추가하여 이미징 표면을 덮습니다. 메탄올에서 불소 접시로 난모세포를 조심스럽게 옮기고, 메탄올 전달의 부피를 최소화합니다.난모세포는 도립 컨포칼 현미경에서 Zeiss LSM five 10 및 aica TCSs P에서 모두 좋은 결과를 제공합니다. 이제 microinjection 형광 RNA가 형광 표지 대조군을 8시간 배양한 후 핵에서 볼 수 있는 microinjection 직후 subcellular RNA 국소화의 몇 가지 대표적인 이미지를 보여드리겠습니다.

RNA는 난모세포의 세포질에 균일하게 분포되어 있는 것을 볼 수 있습니다. 그러나 수송 기계를 모집하는 염기서열을 포함하는 형광 표지된 RNA는 난모세포의 식물성 기둥으로의 세포 내 국소화 과정에서 볼 수 있습니다. 방금 형광 표지된 RNA를 zap cyte에 마이크로 주입하고 컨포칼 현미경으로 RNA 국소화를 관찰하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 배양에 대한 RNA 오염을 방지하고, 항생제가 포함된 OCM의 세포를 방지하고, 광 표백을 방지하기 위해 가능한 한 햇빛으로부터 세포를 보호하기 위해 데시 처리된 용액을 사용하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.