Name: 머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 배우세요 Xenopus 난모세포에서 형광 표지 RNA를 이용한 RNA 현지화 시각화 방법을. 공초점 현미경으로 실시간 RNA 운동을 관찰하여 세포 내 유전자 발현 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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RNA의 지방화에 대한 우리의 작업은 KLM하는 NIH (R01GM071049)에서 부여로 지원됩니다.

1 부 : 찬란 라벨 mRNA의 전사. <ol><li> RNA의 현지화 요소 또는 기타 관련 시퀀스를 포함하는 플라스미드 DNA를 Linearize 및 DEPC - H 2 O. 처리 1 μg / μl에 resuspend DNA 템플릿은 T7, SP6 또는 T3 RNA 효소에 의해 해독을위한 업스트림 발기인 사이트가 있어야합니다. </li><li> 멸균 1.5mL 튜브에 다음 시약을 추가합니다 : <table><tbody><tr><td> A. 10X TX 버퍼 (M &amp; M 참조) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> B. 20X 모자 / NTP 믹스 (M &amp; M 참조) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> C. 1 ㎜ 알렉사 플루어 546-14 - UTP (Invitrogen) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> D. UTP, [α - 32 P] (1 μCi / μl) (퍼어킨 엘머) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> E. DEPC - H 2 O </td><td> 11 μl </td></tr><tr><td> F. 0.2 M DTT </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> G. RNasin (Promega) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> H. 선형 템플릿 DNA </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> I. RNA 효소 (Promega) </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table></li><li> 부드럽게 시약을 혼합하고 (10 초. microcentrifuge에서) 잠깐 원심 분리기. </li><li> 형광단의 photobleaching 방지하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 37 ° C에서 2~4시간을위한 부화. </li><li> 템플릿 DNA이 저하될 1 μl 1 MG / ML RNase 무료 DNase (Promega)를 추가합니다. </li><li> 37 15 분 품어 ° C. </li><li> 반응을 중지 79 μl 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0)를 추가합니다. </li><li> "입력"과 저장라는 별도의 튜브, 1 μl를 제거합니다. </li><li> 전체 길이 mRNA를 제외한 동안 비법인 세포핵을 포함하는 1 ML G50 칼럼을 통해 스핀 반응 (재료 및 방법 참조). </li><li> 에탄올 침전으로 RNA를 집중 : <ol class="lalpha"><li> 250 μl 100 % 에탄올, 10 μl은 7m CH 3 COONH 4, 1 μl 캐리어 RNA (tRNA 효모, 10 μg / μl) 또는 1 μl 글리코겐 (20 MG / ML) 추가합니다. </li><li> 잘 믹스하여 -80에서 고체까지 동결 ° C&gt; 30 분 또는 15 분 동안 드라이 아이스에. </li><li> 15 분 가만히 따르다 뜨는 위해 microcentrifuge의 최대 속도로 회전. </li><li> 75 % 에탄올 150 μl로 씻으십시오. </li><li> microcentrifuge, 가만히 따르다 뜨는의 최대 속도로 3 분 스핀. </li><li> 모든 에탄올이 증발했다는 보장, 3 분 동안 37 ° C 펠릿 건조. </li></ol></li><li> 11 μl DEPC - H 2 O의 Resuspend 및 "포함"으로 표시 별도의 튜브, 1 μl를 제거합니다. </li><li> %의 설립을 결정하고 (재료 및 계산 방법을 참조하십시오) 50 nm의로 RNA를 희석. </li><li> RNA는 동결 / 해동 사이클을 피하기 위해 단일 ​​사용 5 μl aliquots에 냉동이어야하며 -80 ° C.에 몇 주 동안 저장할 수 있습니다 </li></ol> 2 부 : Microinjection 준비. <ol><li> RNA 준비 : RNA (50 NM)의 나누어지는를 해동하고, 70 RNA를 변성 ° C를 3~5분하십시오. 모든 입자를 제거하고, 얼음을 유지하는 최대 속도에서 실내 온도 microcentrifuge에서 10 분 스핀. </li><li> Oocyte 준비 : <ol class="lalpha"><li> 수술 Xenopus laevis 여성 (Nasco)에서 난소를 제거합니다. </li><li> Collagenase 솔루션 25 ML을 포함한 50 ML 원뿔 관에 Xenopus laevis의 난소의 트림 조각 (재료 및 방법 참조). </li><li> 15 분 동안 18 ° C에서 부드럽게 흔들거나 oocytes까지 가시 난소에서 구분됩니다. 배치 변화로 배치로 인해, collagenase 처리 시간은 다를 수 있으며 defoliculation을 보장하기 위해 육안 검사를 통해 신중하게 모니터링해야합니다. </li><li> oocytes가 튜브에 정착하도록 허용, 솔루션을 제거하고 (재료 및 방법 참조) MBSH 버퍼로 oocytes 씻으십시오. </li><li> 세 세척 총 두 번 더 씻어 반복합니다. 이 oocyte 격리 프로토콜 코헨 외., 2009에 대한 자세한 비슷합니다. </li><li> 표준 해부 현미경 MBSH 버퍼에 수동 정렬 스테이지 III / IV oocytes (뒤몽, 1972). 단계 IV의 oocytes는 안료와 약간 크고 스페클드하는 동안 스테이지 III의 oocytes 완전히 불투명하지만 흰색입니다. 약간 투명 Oocytes 완전히 색소 또는 전시 편광 안료 배포가 너무 오래, 너무 젊은 oocytes 있습니다. </li></ol></li><li> 니들 준비 : ~ 0.05 mm의 외경에 바늘을 당겨와 베벨. (우리는 드루먼드 과학 3.5 인치 모세관을 사용하여 (주문 # 3 - 000-203 - G / X), 셔터 악기 (주) micropipette 풀러와 WPI 주식 beveller.) </li></ol> 파트 3 : Microinjection <ol><li> 사출 당 2 NL를 제공하기 위해 DEPC - H 2 O와 바늘을 보정합니다. 우리는 앞에서 가스 구동 microinjector을 (재료 및 방법 참조)를 사용하여 우리의 바늘을로드하고 마이크로 미터를 사용하여 드롭 크기를 보정. </li><li> 바늘로 RNA를로드합니다. </li><li> 장소 MBSH 버퍼를 포함하는 주입 그릇에 oocytes를 정렬. 우리는 검은 거품 고무의 레이어와 함께 접시에 microinject. 창백한 oocytes는 흰색 backgrou에 잘 눈에 띄는ND. </li><li> 조심스럽게 50 NM에서 RNA 2 NL 각 oocyte를 삽입. </li><li> , RNA DEPC - H 2 O와 바늘을 씻어하고, 주사에 대한 다음 RNA를 부하를 추방. </li></ol> 4 부 : Oocyte 문화 <ol><li> 멸균 24 잘 플레이트 (시그마 알드리치)의 우물에 플레이스 oocytes. 물론 당 천 oocytes에 우리 문화를 백업하십시오. </li><li> 버퍼를 제거하고 400 μl O ocyte C ulture M edium로 교체 (OCM, 재료 및 방법 참조) 잘마다. 문화 중에 촉촉한 환경을 유지하기 위해 서부 유럽 표준시 종이 타월로 빵빵한 플라스틱 컨테이너 안의 문화 플레이트 플레이스. </li><li> 18 ° C 8 및 48 시간 사이에 이르기까지 시간이 지점에 대한 oocytes를 품어. </li></ol> 제 5 부 : Oocytes의 고정, 탈수 및 저장 <ol><li> 어떤 죽은 oocytes를 정렬 및 유리 튜브에서 살아남기 oocytes를 배치합니다. 우리는 일상적으로&gt; 90 % 생존을 관찰. </li><li> MEMFA 정착액 (재료 및 방법 참조) 20 분 바위 플레이스 oocytes. 알루미늄 호일로 덮고하여 빛으로부터 oocytes를 보호합니다. </li><li> 정착액을 제거하고 MBSH 버퍼의 동일한 볼륨 대체하여 oocytes 씻으십시오. 이 세척의 총 한 번 더이 세차를 반복합니다. </li><li> 무수 메탄올에 oocytes 씻으십시오 : <ol class="lalpha"><li> 볼륨의 절반을 제거 메탄올로 바꿉니다. </li><li> "A"두 단계를 반복합니다. </li><li> 솔루션의 모든 제거 메탄올로 바꿉니다. </li><li> 메탄올 세척을 반복합니다. </li></ol></li><li> Oocytes는 이미지를 준비하기 전까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 6 부 : 공촛점 현미경으로 영상 RNA의 현지화 <ol><li> 이미징 전에 이미지 표면을 커버하기 위해 유리 바닥 FluoroDish (WPI 주)에 머리 S 지우기 매체를 (2시 1분 벤질 벤조 산 벤질 알코올 -) 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 양도 메탄올의 볼륨을 최소화, 메탄올에서 FluoroDish로 oocytes을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 거꾸로 공촛점 현미경에 이미지 (우리는 성공적으로 자이스 혈구 LSM510와 Leica TCS SP2를 사용했습니다.) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 :.. 찬란 Labelled 성적 Microinjection하여 Subcellular RNA 현지화의 시각화 알렉사 플루어 546으로 표시 A. 따라 microinjection, RNA가 처음에 핵에 제한됩니다 B.이 문화 여덟 시간 후, 찬란 표시 제어 RNA가 균일하게 볼 수 있습니다 oocyte의 세포질에서 배포. C. 그러나, 수송 기계를 모집 해당 시퀀스를 포함하는 찬란 표시된 RNA가 oocyte (아래 방향)의 식물 극에 subcellular 지방화의 과정에서 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm의.

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

실험 동물을 사용하는 실험은 브라운 대학에서 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.

여기 우리는 Xenopus의 oocytes에서 mRNA의 현지 시각을위한 프로토콜을 제시했습니다. 이 방법은, 찬란 표시 RNA의 성적표를 사용하면 이전에 dig​​oxigenin - 표시된 성적표와 함께 취득하고 간단하고 원위치 기반 접근법 (마우리과 멜튼, 1992, 고터오 외., 1997)보다 빠르고보다 노이즈 비율 높은 신호를했습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 엔지니어 순서 변이를 RNA 빠르게 생체내 기능에 대해 테스트할 수 있습니다. 또한, 추가 알렉사 - UTP의 fluorophores을 사용하여 여러 RNA 종 같은 oocyte에서 시각하실 수 있습니다. 우리는 알렉사 플루어 488-5 - UTP 때문에 488 나노미터 파장 범위에서 autofluorescence의과 비교 Xenopus oocytes 알렉사 플루어에 546-14 - UTP이 우수한 결과를 제공 것으로 나타났습니다 있으나 두 RNAS의 듀얼 이미징은 (가뇽과 그럼에도 불구하고이 가능합니다 마우리 ...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X 텍사스 버퍼 <ul><li class="none"> 60 MM MgCl 2 </li><li class="none"> 400 MM 트리스 - HCL (산도 7.5) </li><li class="none"> 20 MM spermidine - HCL </li></ul> 20x 모자 / NTP 믹스 <ul><li class="none"> 10 MM CTP </li><li class="none"> 10 MM ATP </li><li class="none"> 9 밀리 UTP </li><li class="none"> 이 MM GTP </li><li class="none"> 20 MM G (PPP) G 총액 아날로그 (뉴 잉글랜드 Biolabs) </li></ul> G - 50 컬럼 <ul><li class="none"> 100 ML의 수화물 5g Sephadex G - 50 비즈 (시그마 알드리치) H 2 O.을 deionized 30 분 DEPC는 - 치료. 그리고 압력솥. 실온에서 불완전한 주식을 저장합니다. 사용하기 전에, 다음 RNase 무료 솔루션을 추가합니다 : </li><li class="none"> 0.5 ML 0.2 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li class="none"> 1 ML 1 M 트리스의 산도 8.0 </li><li class="none"> 0.5 ML 20% SDS </li><li class="none"> 4 ° C.에 완전한 G - 50 솔루션을 저장 </li><li class="none"> 제거하고 폐기 플런저를 3 ML 주사기 (BD Biosciences)로부터 15 ML 원뿔 튜브 (코닝)에 주사기의 총구를 놓습니다. 글라스울 (동전의 절반 크기 플러그)의 소량으로 주사기를 꽂습니다. </li><li class="none"> 구슬을 resuspend하는 소용돌이 완료 G - 50 솔루션입니다. </li><li class="none"> 빈 열 2 ML G - 50 솔루션을 추가합니다. </li><li class="none"> benchtop의 원심 분리기 1,000 X g에서 1 분간 돌린다. </li><li class="none"> 각 열의 200 μl DEPC - 처리 deionized H 2 O를 추가합니다. 스핀. </li><li class="none"> 세 세척 총 두 번 더 씻어 반복합니다. </li><li class="none"> 새로운 15 ML 원뿔 관에 주사기 배럴을 제거합니다. </li></ul> Collagenase 솔루션 <ul><li class="none"> 클로스 트리 디움 histolyticum (시그마 알드리치)에서 75 MG collagenase </li><li class="none"> 25 ML 0.1 M KPO 3 + (산도 7.4) </li></ul> MBSH 버퍼 <ul><li class="none"> 88 MM NaCl </li><li class="none"> 1 ㎜ KCl </li><li class="none"> 2.4 MM NaHCO 3 </li><li class="none"> 0.82 MM MgSO 4 7H 2 O X </li><li class="none"> 0.33 MM 칼슘 (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0.41 MM CaCl 2 X 6H 2 O </li><li class="none"> 10 MM HEPES (산도 7.6) </li></ul> Oocyte 문화 미디엄 <ul><li class="none"> 50% L15 미디어 </li><li class="none"> 15 MM HEPES (산도 7.6) </li><li class="none"> 1 MG / ML 인슐린 </li><li class="none"> 100 MG / ML gentamicin </li><li class="none"> 50 U / ML nystatin </li><li class="none"> 50 U / ML 페니실린 </li><li class="none"> 50 MG / ML 스트렙토 마이신 </li></ul> MEMFA 솔루션 <ul><li class="none"> 0.1 M의 대걸레 (산도 7.4) </li><li class="none"> 이 MM EGTA </li><li class="none"> 1 ㎜ MgSO 4 </li><li class="none"> 3.7 %의 포름 알데히드 </li></ul> 컴퓨팅 RNA 수율 <ul><li class="none"> &quot;입력&quot;과 표준 신틸레이션 계수기를 사용하여 &quot;통합&quot;샘플의 노출당 비용 (CPM)를 결정합니다. </li><li class="none"> 법인 = ( &quot;법인&quot;) / (10 X &quot;입력&quot;) </li><li class="none"> 일반 정관 값은 0.03 ~ 0.10 사이의 범위와. </li><li class="none"> 다른 polymerases에 대한 최대 산출 이론 : T3 T7, SP6 - 2.64 μg </li><li class="none"> μg = (효소의 최대 수율이 사용) X (정관)의 반응 수율 </li><li class="none"> 50 NM = (μg RNA) /로 RNA를 희석 320 / (기지에서 RNA의 길이) / (5X10 -8) </li><li class="none"> 반응은 일반적으로 수확량 ~ 50 NM에서 RNA의 50-100 μl. </li></ul>

머릿속 rna 현지화에서 xenopus oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA의 지방화는 세포 극성을 설립의 보존 메커니즘입니다. Vg1 mRNA는 Xenopus laevis oocytes과 공간의 Vg1 단백질의 유전자 발현을 제한하는 행위의 식물 극을 localizes. 이러한 방식으로 Vg1 배포 꽉 제어는 개발 배아에서 적절한 세균 계층 사양이 필요합니다. mRNA의 3 &#39;UTR에서 RNA의 시퀀스 요소는 Vg1 지역화 요소 (VLE)가 필요하며 직접 전송하기에 충분합니다. 생체내에 Vg1 mRNA의 인식 및 전송을 연구하기 위해, 우리는 단순한 시각적인 판독을 통해 트랜스 팩터 감독 전송 메커니즘의 광범위한 분석을 수있는 이미징 기술을 개발했습니다. RNA의 지방화를 시각화하기 위해, 우리는 찬란 표시 VLE의 RNA를 합성하고 개별 oocytes에 대한 본 사항이 명시를 microinject. 주입된 RNA의 전송을 허용하는 oocyte 문화 후, oocytes 사전 공촛점 현미경으로 영상을 고정하고 탈수 있습니다. mRNA의 현지화 패턴의 시각화는 RNA 수송의 전체 경로를 모니터링 및 CIS - 행동 VLE (루이스 외., 2008에 바인딩 증명서 및 횡단 행동 요소 내의 요소에 대한 RNA 수송 감독의 역할을 식별에 대한 기록을 제공합니다 Messitt 외., 2008). 우리는 추가 RNAS과 단백질 (가뇽과 마우리, 2009 Messitt 외., 2008)와 함께 공동 지방화를 통해이 기술을 확장 있고, 모터 단백질의 파괴와 cytoskeleton와 함께 (Messitt 외., 2008) 탐침을 mRNA의 지방화를 기본 메커니즘.

의 시각화<em&gt; 생체내에</em&gt; RNA 교통이 찬란 표시 RNA의 성적의 microinjection에 의해로 수행됩니다<em&gt; Xenopus</em&gt; oocytes, 공촛점 현미경으로 따라갔다.

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

RNA 국소화는 세포 극성을 형성하는 보존된 기전입니다. Vg1 mRNA는 Xenopus laevis 난모세포의 식물극으로 국소화되며 Vg1 단백질의 유전자 발현을 공간적으로 제한하는 역할을 합니다. 이러한 방식으로 Vg1 분포를 엄격하게 제어하는 것은 발달 중인 배아의 적절한 배엽 분화에 필수적입니다. mRNA의 3' UTR에 존재하는 RNA 서열 요소인 Vg1 국소화 요소(VLE)는 수송을 유도하는 데 필요하며 충분한 조건을 제공합니다. Vg1 mRNA의 생체 내 인식 및 수송을 연구하기 위해, 본 연구진은 단순한 시각적 판독을 통해 트랜스-인자 유도 수송 기전을 광범위하게 분석할 수 있는 이미징 기술을 개발했습니다. RNA 국소화를 시각화하기 위해, 형광 표지된 VLE RNA를 합성하여 이를 개별 난모세포에 미세 주입합니다. 주입된 RNA의 수송이 이루어지도록 난모세포를 배양한 후, 공초점 현미경으로 이미징하기 전에 난모세포를 고정하고 탈수시킵니다. mRNA 국소화 패턴의 시각화는 RNA 수송의 전체 경로를 모니터링하고, 전사체 내의 시스-작용 요소 및 VLE에 결합하는 트랜스-작용 인자의 RNA 수송 유도 역할을 확인하는 판독 지표를 제공합니다(Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). 본 연구진은 추가적인 RNA 및 단백질과의 공동 국소화(Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008)를 통해, 그리고 모터 단백질 및 세포골격의 파괴(Messitt et al., 2008)와 병행하여 이 기술을 확장함으로써 mRNA 국소화의 근저에 있는 기전을 조사하였습니다.

본 절차에서는 형광 표지된 RNA 전사체를 Xenopus oocytes에 주입하고 그 국소화를 모니터링합니다. 먼저, RNA를 형광 뉴클레오타이드로 표지합니다.인비트로(in vitro) 전사 반응 후, RNA를 미세주입 장치에 로딩합니다. 난모세포를 주입용 접시에 놓고 주의 깊게 미세주입합니다. 마지막으로, 공초점 현미경으로 이미징하기 전 RNA 국소화가 일어날 수 있도록 난모세포를 배양합니다.안녕하세요, 저는 브라운 대학교 분자생물학, 세포생물학 및 생화학과의 Kimberly Mallory 박사 연구실 소속 James Gagnan입니다. 오늘은 Xenopus 난모세포에서 세포 내 RNA 국소화를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 초기 척추동물 발달 과정 중 RNA 국소화에 필요한 RNA 구조와 단백질 인자를 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.그럼 시작해 보겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 함께 제공된 서면 프로토콜에 기술된 대로 방사성 및 형광 표지가 모두 된 mRNA를 전사하십시오. 템플릿 DNA를 분해하기 위해 DNase를 첨가한 다음, EDTA를 첨가하여 반응을 중단시키십시오.G 50 컬럼을 이용해 원심분리하여 결합되지 않은 뉴클레오타이드와 기타 작은 분자들을 제거합니다. 그 다음 에탄올 침전법으로 RNA를 농축하고, 세척 후 재현탁합니다. 신틸레이션 계수법(scintillation counting)으로 농도를 측정한 후, RNA를 50 nM로 희석하여 5 µL씩 분주해 -80 °C에서 보관합니다.미세주입을 수행할 준비가 되면, 표지된 RNA의 aliquote를 해동하고 70°C에서 5분 동안 변성시킵니다. 그다음, 실온의 원심분리기에서 최대 속도로 10분 동안 원심분리하여 입자성 물질을 제거하고 얼음 위에 보관합니다. 이어서, 3mg/mL 농도의 용액 25mL가 담긴 50mL 원뿔형 튜브에 Xenopus laevis 난소 조각을 잘라 넣어 난모세포를 분리합니다.pH 7.4의 0.1 M 인산칼륨 완충액에 포함된 콜라게나아제. 배치 간 편차가 있으므로 18 °C에서 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 콜라게나아제 처리 시간은 달라질 수 있으므로 육안 검사를 통해 주의 깊게 모니터링해야 합니다.탈엽(defoliation)이 확실히 이루어지도록 15분 동안 또는 난모세포가 난소로부터 눈에 띄게 분리될 때까지 계속 흔들어 준 후, 난모세포가 원심분리관 바닥에 가라앉도록 둡니다. 용액을 제거하고 MBSH 버퍼로 교체합니다. 이 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.다음으로, 표준 광학 현미경 하에서 3~4단계의 CYTES를 수동으로 분류하여 MBSH 버퍼에 담습니다. 3단계 cytes는 완전히 불투명하며 흰색입니다. 반면 4단계 cytes는 크기가 약간 더 크고 색소가 섞여 점무늬가 있습니다.약간 투명한 난모세포는 너무 미성숙하며, 완전히 색소가 침착되었거나 색소 분포가 편향된 난모세포는 너무 성숙한 상태입니다. 마지막으로, 3.5인치 모세관을 당기고 베벨링하여 외경이 약 0.05 millimeters인 니들을 제작해 미세주입을 준비합니다. 이제 mRNA, 난모세포, 니들이 모두 준비되었으므로 미세주입을 진행합니다.먼저 주입 1회당 2nm가 주입되도록 3차 증류수로 니들을 보정합니다. 가스 제어 마이크로 인젝터를 사용하여 니들에 액체를 충전하고 마이크로미터를 이용해 방울 크기를 보정하십시오. 보정이 완료되면 주입할 RNA를 니들에 충전합니다. 다음으로, 분리된 난모세포를 MBSH 완충액이 담긴 주입용 디시 위에 놓습니다. 이때 디시에는 검은색 폼 고무 층이 포함되어 있어야 합니다.검은색 배경에서 흰색 난세포가 뚜렷하게 보입니다. 그런 다음 각 난세포에 50 nanomolar 농도의 RNA 2 liters를 조심스럽게 주입하십시오. 각 난세포에는 한 번만 주입해야 하며, 주입이 완료되면 바늘에 막힘이 없는지 정기적으로 확인하십시오.남은 RNA를 배출하고, 니들을 증류수로 헹군 다음 주입할 다음 RNA를 로딩하십시오. 주입 후, 주입된 난세포를 멸균된 24-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 웰당 최대 1,000개의 난세포를 배양할 수 있습니다.버퍼를 제거하고 웰당 400 µL의 cyte 배양 배지로 교체합니다. 그런 다음 배양 중 습한 환경을 유지하기 위해 젖은 종이 타월이 들어 있는 플라스틱 용기에 배양 플레이트를 넣고, 원하는 배양 기간에 따라 8시간에서 48시간 사이의 시간 동안 oocyte를 18 °C에서 배양합니다. 주입된 oocyte의 배양이 완료되면 현미경 관찰을 위한 준비 과정을 진행할 수 있습니다.사멸한 난모세포를 골라내고 생존한 난모세포를 유리 바이알에 넣습니다. 통상적으로 난모세포의 90% 이상의 생존율이 관찰됩니다. 버퍼를 M-E-M-F-A 고정액으로 교체하고 세포를 20분 동안 흔들어 줍니다.고정 기간이 끝난 후, 고정 과정 중에 난모세포가 햇빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. 고정액을 제거하고 동일한 부피의 MBSH 완충액으로 교체하여 난모세포를 세척합니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복하여 총 두 번 세척합니다.다음으로, 난모세를 무수 메탄올로 세척합니다. 먼저, 부피의 절반을 제거하고 메탄올로 채웁니다. 이 과정을 두 번 더 반복합니다.이러한 세척 과정 후에 모든 용액을 제거하고 메탄올로 교체합니다. 이 메탄올 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 고정 및 탈수된 난모세포는 이미징 준비가 될 때까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.이미징 전에, 이미징 표면을 덮을 수 있도록 glass bottom WPI fluoro dish에 Marie's clearing medium을 추가합니다. 메탄올에서 fluoro dish로 난모세포를 조심스럽게 옮기되, 함께 옮겨지는 메탄올의 부피를 최소화하십시오. 도립 공초점 현미경으로 난모세포를 이미징하며, Zeiss LSM 510과 Leica TCS SP 모두 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 이제 미세주입 직후의 세포 내 RNA 국소화 대표 이미지들을 보여드리겠습니다. 형광 표지된 대조군을 8시간 동안 배양한 후에는 핵 내에서 형광 RNA를 확인할 수 있습니다.RNA가 난모세포의 세포질에 균일하게 분포되어 있는 것을 볼 수 있습니다. 그러나 운송 장치를 모집하는 서열을 포함하고 형광 표지된 RNA는 난모세포의 식물극으로 세포 내 국소화되는 과정을 확인할 수 있습니다. 지금까지 형광 표지된 RNA를 zap cytes에 미세 주입하고 공초점 현미경으로 RNA 국소화를 관찰하는 방법을 보여드렸습니다.이 절차를 수행할 때, 배양액의 RNA 오염을 방지하기 위해 DEPC 처리된 용액을 사용하고, 항생제가 포함된 OCM에서 난모세포를 배양하며, 광퇴색을 방지하기 위해 가능한 한 난모세포를 햇빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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Biology

생물학

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

Xenopus ectoderm은 배아의 세포 극성의 연구에 대한 매력적인 모델이되고있다. 분석은 형광 단백질의 subcellular 배포는 ectoderm 세포에 과세되는, 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 신호의 공간적 제어 관련 주소 질문을하는 데 도움이됩니다.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한...

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

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생산<em&gt; Xenopus의 tropicalis</em&gt; 달걀은 미세 소관 관련 RNA를 식별하기 위해 추출

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

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Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

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우리는 초기 배아 발생 시 단일 세포에서 조기 배아 발생 시 접합 게놈 활성화 중 발생 전사를 시각화하는 방법을 설명합니다.

초기 배아 단일 세포에서 접합 게놈 활성화 시각화

배우세요 Xenopus 난모세포에서 형광 표지 RNA를 이용한 RNA 현지화 시각화 방법을. 공초점 현미경으로 실시간 RNA 운동을 관찰하여 세포 내 유전자 발현 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

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