Name: 하와이 밥테일 오징어에서 Hemocytes 구하기 Euprymna scolopes와 공생이 아닌 공생 박테리아들의 준수를 관찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-11T04:52:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 학습하세요 하와이 밥테일 오징어 Euprymna scolopes에서 혈구를 분리하는 방법을. 형광 염색과 GFP 표지 박테리아를 활용한 세포-미생물 상호작용 연구에 활용할 수 있습니다.

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자금 출처 : SVN에 코네티컷 연구 재단과 분자 및 세포 생물학의학과 대학교, 시그마 사이 보조금 수준의 연구와 안토니오 H. 및 마조리 R. AJC에 로마노 대학원 교육 원정대

<ol><li> 0.22 μm의 필터 살균 인공 해수 500 MLS (; 염도 35 PPT F​​SW)를 준비합니다. 0.22 μm의 미크론 필터를 통해 필터 인공 또는 자연 해수는 입자와 세균을 제거합니다. </li><li> FSW의 에탄올의 2 % 용액에 배치하여 한 성인 하와이 밥테일 오징어 (Euprymna scolopes)을 마취. 약 10 분 동안 마취에서 동물을 놓으십시오. 오징어 수영을 중지하고 적극적으로 터치에 응답하지 않습니다. 계속 호흡, 맨틀의 움직임에 의해 표시하고, chromatophore 활동은 계속 관찰하여야한다. </li><li> 표준 왁스 절개 트레이에 직면 복부 측면과 오징어를 넣으십시오. FSW 2 %의 에탄올을 포함하는으로 동물 잠수함. </li><li> 하나의 표준 200 μl 피펫 팁을 사용하여 깔때기와 두 눈 사이에있는 주요 두부 혈관을 폭로 맨틀 다시 가져옵니다. </li><li> 26.5 - 게이지 바늘, 바늘 두개의 혈관과 hemolymph의 50-100 μl 사이의 철회와 살균 한 ML의 주사기를 사용하여. 얼음 멸균 1.5 ML 튜브의 hemolymph를 놓습니다. 참고 : 동물 기증​​자 여러 번 역할을한다면, 오직 주어진 시간에 hemolymph의 10-20 μl를 철회. 일반 해수 탱크에 동물을 반환합니다. 동물은 30 분 이내에 회복됩니다. </li><li> 갓 수집 hemocytes는 오징어 링어의 솔루션 (; 530 MM NaCl, 10 MM KCl, MgCl 2 25 MM 10 MM CaCl 2 10 MM HEPES 버퍼, 산도 7.5 S - 링거스) 500 μl에 씻어 다시 중지됩니다. </li><li> Hemocyte 농도는 hemocytometer에 의해 결정되며, 약 2,000 세포 chambered 유리 커버 풀렸는데에 추가하고, 실온에서 10 분에 대한 유리에 준수해야 사용할 수 있습니다. 이 밀도에서는 hemocytes은 유리 슬라이드 표면에 균일 monolayer를 형성합니다. </li><li> 호스트 hemocytes에 바인딩 세균 관찰, hemocytes 그러한 장염 fischeri ES114 및 / 또는 장염 harveyi B392, 녹색 형광 기자를 포함한 각으로 찬란 표시 박테리아 변종에 노출되어 있습니다. V. fischeri ES114 및 V. harveyi B392은 28에서 바다 물이 tryptone 미디어 (SWT)의 중간 단계 로그 ° 궤도 통에 C로 성장하고 있습니다. 600nm에서 광학 밀도는 셀 밀도를 결정하기 위해 spectrophotometrically 측정됩니다. 박테리아가 원심 분리 (5 분 5000 RPM)에 의해 pelleted 있으며, 표면에 뜨는이 무시되고 펠렛은 S - 링거스에 다시 일시 중지되었습니다. </li><li> 100,000 세균성 세포가 잘하므로 평균 hemocyte 50 세균이있다는 것을 각 챔버에 추가됩니다. hemocyte / 세균 혼합물은 25 S - 링어 S 솔루션 ° 1 H에 대한 C, 바인딩의 최대 수준을 항복하기로 결정 시간 incubated 수 있습니다. </li><li> hemocytes의 세포질은 다음 찬란 0.005 % CellTracker 오렌지 (Invitrogen)와 스테인드 후 세포를 시각화하는 S - 링거스에 씻어 수 있습니다. </li><li> 관련 박테리아 물들다 hemocytes는 자이스 혈구 디스커버리 V20 형광 입체경 또는 Leica SP2 스펙트럼 레이저 공촛점 현미경을 사용하여 형광 볼, 그리고 동물 세포의 전체 표면을 통해 열거됩니다. </li></ol> 대표 결과 두 족류 동물의 hemolymph가 산소에 세포 hemocyanin 아니라 헤모글로빈을 포함하고 있기 때문에, hemolymph은 진한 파란색을 설정합니다. hemolymph의 μl 당 ~ 5000 hemocytes의 평균이 방법을 사용하여 얻을 수 있습니다. chambered 커버 풀렸는데 형광 염색법을 준수 후 hemocytes는 모양 밝은 찬란 빨간색과 amoeboid 나타납니다. 세균 유착, V에 대한 fischeri 동안 V. (혈액 세포 당 1-2 세균 세포) hemocytes을 제대로 준수합니다 harveyi는 (hemocyte 당 10-15 세균 세포) 적극 준수합니다. <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 성인 하와이 밥테일 오징어 Euprymna은 두부 혈관의 위치를 보여주는 scolopes. <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 장염 fischeri (A)와 장염 harveyi (B)에 hemocyte 노출 결과. 레드 셀 커 오렌지, 그린, GFP - 라벨이 세균.

<ol><li>Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+host+hemocytes+during+the+initiation+of+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis.</a> Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unseen+forces%3A+the+influence+of+bacteria+on+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unseen forces: the influence of bacteria on animal development.</a> Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+between+symbiotic+Vibrio+fischeri+and+the+haemocytes+of+Euprymna+scolopes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes.</a> Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+animal-bacterial+association%3A+recruiting+symbiotic+Vibrios+from+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+the+light-organ+microenvironment+of+Euprymna+scolopes%3A+description+of+a+population+of+host+cells+in+association+with+the+bacterial+symbiont+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri.</a> Biol Bull. 195, 89-97 (1998).</li>
<li>Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+fischeri+and+its+host%3A+it+takes+two+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).</li>
</ol>

유익한 세균과 호스트 사이의 분자 신호를 중재에 면역 체계의 역할에 관한 연구, 최근에 그들의 microbiota와 eukaryotes의 공동 진화에 대한 우리의 이해에 중요한 기여를 만들었습니다. 오징어 / 비브리오 시스템은이 분야 2,3,5,6,8의 근본적 질문에 답변을 취급하기 쉬운 모델 시스템으로 자신을 증명되었습니다. 오징어 Euprymna scolopes의 가벼운 기관은 발광 박테리아 비브리오 fischeri들에 의해 독점적으로 식민지를 허용합니다. 조직 그 집에는 박테리아가 해수와 접촉에 남아 있기 때문에, 오징어는 특정 공생을 육성뿐만 아니라 다른 박테리아를 제외 계속해야합니다. 계속 연구는 대식 세포와 같은 hemocytes 가능성이 설립이 협회 1,4,7의 유지에 중요한 역할을하는 것으로 나타났습있다. 오징어 호스트는 적응 면역이 협회에서 발견되는 놀라운 특이성은 타고난 면역 시스템을 통해 전체 또는 부분적으로 중재되어야 부족하기 때문에....

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek 챔버형 #1.0 붕규산 유리 커버글라스 시스템 (8-챔버)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>26.5 G 1ml 라텍스 프리 인슐린 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery V20 현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SP2 공초점 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

하와이 밥테일 오징어에서 hemocytes 구하기 euprymna scolopes와 공생이 아닌 공생 박테리아들의 준수를 관찰

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

유익한 세균과 호스트 사이의 분자 신호를 중재에 면역 체계의 역할에 관한 연구, 최근에 그들의 microbiota와 eukaryotes의 공동 진화에 대한 우리의 이해에 중요한 기여를 만들었습니다. 하와이 밥테일 오징어 사이의 공생 협회,<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; 그리고 발광 생물 세균<em&gt; 장염 fischeri</em&gt; 동물의 개발에 유익한 박테리아의 영향을 이해하기위한 모델 시스템으로 이용되었습니다. 최근 연구는 대식 세포와 같은 hemocytes은 오징어 호스트의 타고난 면역 체계의 유일한 세포 구성 요소, 가능성이 설립이 협회의 유지 보수를 중재에 중요한 역할을하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은에서 hemocytes를 얻는 방법을 보여줍니다 것입니다<em&gt; E. scolopes</em&gt; 그리고 박테리아 바인딩 assays에서 이러한 세포를 사용합니다. hemolymph가 기본 두부 혈관에서 주사기로 수집하기 전에 어른 오징어 먼저 anesthetized 있습니다. 압축을 푼 hemolymph에 포함된 호스트 hemocytes는, chambered 유리 coverslips을 준수하고 녹색 형광 단백질로 분류 공생에 노출되는<em&gt; 장염 fischeri</em&gt;이 아닌 공생<em&gt; 장염 harveyi</em&gt;. hemocytes은 형광 염료 (셀 트래커 오렌지, Invitrogen)에 counterstained 후 형광 현미경을 사용하여 시각입니다.

이 동영상은 하와이 밥테일 오징어에서 hemocytes (혈액 세포)을 구하는 방법을 보여줍니다 것입니다<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt; 세포 생물학 및 세균 유착 assays에 사용하기 위해. Hemocytes은 형광 염료와 스테인드 및 GFP - 라벨 박테리아에 노출됩니다.

하와이 밥테일 오징어에서 Hemocytes 구하기 Euprymna scolopes와 공생이 아닌 공생 박테리아들의 준수를 관찰

최근 몇 년 동안 유익균과 숙주 간의 분자 신호 전달을 매개하는 면역 체계의 역할에 관한 연구들은...

성체 꼬마오징어를 수조에서 꺼내어 2% ethanol 여과 해수 용액으로 마취시킨 후, 두부 혈관을 통해 채혈합니다. 26.5게이지 주사기로 추출한 혈림프는 푸른색을 띱니다.헤모시아닌의 존재로 인해, 혈구 세포를 원하는 농도로 희석하여 8개의 챔버가 있는 커버슬립에 분주합니다. 혈구 세포가 커버슬립에 부착되면, 형광 염료인 Cell Tracker Orange로 염색하고 GFP가 표지된 박테리아로 자극을 준 뒤, 이를 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 커네티컷 대학교 분자 및 세포 생물학과의 Spencer Olm입니다.저는 NY Home Lab의 Andrew Collins입니다. 오늘은 하와이 밥테일 오징어(Hawaiian bobtail squid)에서 혈림프 또는 혈액을 추출하는 절차를 보여드리겠습니다. 이 opis를 프라이밍합니다.보브테일 오징어는 하와이 해안의 산호초 인근에 서식하는 야행성 동물로, 좋아하는 먹이인 새우를 사냥하러 나가는 밤에 공생균이 만들어내는 빛을 이용해 자신의 몸을 위장합니다. 우리는 실험실에서 이러한 연관성을 이용해 유익균이 어떻게 동물 조직에 정착하는지 연구합니다. 본 실험실에서는 이 절차를 통해 숙주의 선천 면역 체계 구성 요소와 생물 발광 박테리아 파트너인 VIO ide 간의 상호작용을 연구합니다.그럼 시작하겠습니다. 혈림프를 추출하기 전에, 500 mL의 여과 멸균 인공 해수에 2% 에탄올을 섞어 갓 조제한 용액이 담긴 1 L 비커에 성체 오징어 한 마리를 넣어 마취시킵니다. 10분 후, 오징어는 서서히 헤엄치게 되며 접촉에 적극적으로 반응하지 않게 됩니다.하지만 외투막의 움직임과 색소포의 활동으로 나타나는 지속적인 호흡 및 색소 세포의 활성은 여전히 관찰되어야 합니다. 비커에 담긴 멸균 해수 에탄올 용액 일부를 표준 왁스 해부 트레이에 붓고, 오징어의 복면이 위로 오도록 하여 트레이에 잠기게 합니다. 표준 200 µL 피펫 팁 하나를 사용하여 깔때기와 외투막을 뒤로 당겨 두 눈 사이에 위치한 주 두부 혈관을 노출시킵니다.26.5 gauge 바늘이 장착된 멸균 주사기를 사용하여 두부 혈관을 천자하고, 50~100 µL 또는 10~20 µL의 혈림프를 채취합니다. 해당 동물을 여러 번 공여자로 사용할 경우, 채취한 혈림프를 멸균된 1.5 mL 튜브에 담아 얼음 위에 보관하십시오. 이 단계가 올바르게 수행되었다면 오징어의 혈액은 짙은 파란색으로 보여야 합니다.동물을 일반 해수 탱크로 옮겨 회복시킨 후, 상온의 미세 원심분리기로 혈림프를 원심분리하여 혈구(hemo)를 펠렛화하고 상층액을 파이펫으로 제거합니다. 세척을 위해 혈구를 500 µL의 오징어 링거 용액에 재부유시킵니다. 그 후 다시 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다.마지막으로, 혈구와 오징어 링거액을 재현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 농도를 결정합니다. 그런 다음 유리 커버슬립의 각 챔버에 약 2000개의 세포를 첨가합니다.세포가 유리에 부착되도록 약 10분 동안 둡니다. 이 정도의 밀도에서 hemos는 유리 표면에 균일한 단층을 형성해야 합니다. 28 °C의 오비탈 쉐이커에서 박테리아를 준비하는 동안 hemos를 얼음 위에 보관하십시오.녹색 형광 리포터 유전자를 포함하는 Vireo 박테리아의 한 가지 또는 여러 균주를 해수 tritone 배지에서 mid log phase까지 배양합니다. 분광광도계를 사용하여 600nm에서 배양액의 광학 밀도를 측정하여 세포 밀도를 결정한 후, 원심분리를 통해 박테리아 펠렛을 형성하고 상층액을 제거한 뒤 펠렛을 재현탁합니다. 1mL의 squid ringer 용액에 박테리아를 넣고 이를 혈구(hemocytes)에 첨가합니다.챔버당 100,000마리의 박테리아가 들어 있는 챔버 글라스 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드를 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 최대 결합을 달성하기 위해, 세포질을 염색할 수 있도록 최종 농도가 0.005%가 되게 cell tracker orange를 첨가합니다.30분 동안 배양한 후, 150 µL의 신선한 오징어 링거액(squid ringer solution)으로 세척합니다. 공초점 현미경으로 염색된 헤모사이트(hemoctyes)와 결합된 박테리아를 관찰하고, 헤모사이트 전체 표면의 박테리아 수를 측정합니다. 이제 GFP가 표지된 비공생 박테리아인 Vibrio harveyi와 천연 오징어 공생균인 Vibrio fischeri를 처리한 헤모사이트의 대표 이미지를 보여드리겠습니다.박테리아를 처리하지 않은 헤모사이트(hemo site)의 이미지입니다. 세포가 붉게 보이며 활성화된 상태입니다. 따라서 위족과 같은 돌기들이 형성된 것을 확인할 수 있습니다.세포에 공생 박테리아인 filio fii를 처리하면, 소수의 박테리아가 세포 표면에 결합하는 것을 볼 수 있습니다. 반면, 비공생 박테리아인 filio Harvey Harveyi를 혈구(hemos)에 노출시키면 훨씬 더 많은 박테리아가 결합합니다. 지금까지 보브테일 오징어에서 혈림프를 추출하고, 혈구를 분리하여 이러한 오징어 세포에 대한 박테리아 부착 특성을 분석하는 실험에 사용하는 방법을 살펴보았습니다.이 프로토콜은 혈구 세포가 커버슬립 표면에 부착된 후 고정함으로써 면역화학 분석용으로 수정될 수 있습니다. 또한 동물로부터 혈구 세포를 얻은 후 RNA, DNA 및 단백질을 추출할 수 있습니다. 이상으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

미국 말굽 게, Limulus polyphemus은 틀림없이 모든 무척추 동물의 혈액의 다량을 위해 가장 편리한 소스입니다. 혈액의 일반적인 순환, 세분화 amebocyte, 그리고 플라즈마, hemocyanin, C - 반응 단백질 및 α2 - macroglobulin에서 3 풍부한 단백질에 하나의 셀 유형, 구성의 간단하다. 혈액은 심장에서 수집되고 혈액 세포 및 플라즈마 원심 분리로 구분됩니다.

미국 호르세쇼 게, Limulus Polyphemus의 혈액 수집

이 프로토콜은 상피 세포와 세균의 동시와 언어 문화 microfluidic 공동 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 putative probiotic 박테리아 변종의 효과를 pathogenesis에 다른 수용성 분자 신호의 역할을 조사뿐만 아니라 화면을 사용할 수 있습니다.

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