하와이 밥테일 오징어에서 Hemocytes 구하기 Euprymna scolopes와 공생이 아닌 공생 박테리아들의 준수를 관찰

성체 꼬마오징어를 수조에서 꺼내어 2% ethanol 여과 해수 용액으로 마취시킨 후, 두부 혈관을 통해 채혈합니다. 26.5게이지 주사기로 추출한 혈림프는 푸른색을 띱니다.

헤모시아닌의 존재로 인해, 혈구 세포를 원하는 농도로 희석하여 8개의 챔버가 있는 커버슬립에 분주합니다. 혈구 세포가 커버슬립에 부착되면, 형광 염료인 Cell Tracker Orange로 염색하고 GFP가 표지된 박테리아로 자극을 준 뒤, 이를 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 커네티컷 대학교 분자 및 세포 생물학과의 Spencer Olm입니다.

저는 NY Home Lab의 Andrew Collins입니다. 오늘은 하와이 밥테일 오징어(Hawaiian bobtail squid)에서 혈림프 또는 혈액을 추출하는 절차를 보여드리겠습니다. 이 opis를 프라이밍합니다.

보브테일 오징어는 하와이 해안의 산호초 인근에 서식하는 야행성 동물로, 좋아하는 먹이인 새우를 사냥하러 나가는 밤에 공생균이 만들어내는 빛을 이용해 자신의 몸을 위장합니다. 우리는 실험실에서 이러한 연관성을 이용해 유익균이 어떻게 동물 조직에 정착하는지 연구합니다. 본 실험실에서는 이 절차를 통해 숙주의 선천 면역 체계 구성 요소와 생물 발광 박테리아 파트너인 VIO ide 간의 상호작용을 연구합니다.

그럼 시작하겠습니다. 혈림프를 추출하기 전에, 500 mL의 여과 멸균 인공 해수에 2% 에탄올을 섞어 갓 조제한 용액이 담긴 1 L 비커에 성체 오징어 한 마리를 넣어 마취시킵니다. 10분 후, 오징어는 서서히 헤엄치게 되며 접촉에 적극적으로 반응하지 않게 됩니다.

하지만 외투막의 움직임과 색소포의 활동으로 나타나는 지속적인 호흡 및 색소 세포의 활성은 여전히 관찰되어야 합니다. 비커에 담긴 멸균 해수 에탄올 용액 일부를 표준 왁스 해부 트레이에 붓고, 오징어의 복면이 위로 오도록 하여 트레이에 잠기게 합니다. 표준 200 µL 피펫 팁 하나를 사용하여 깔때기와 외투막을 뒤로 당겨 두 눈 사이에 위치한 주 두부 혈관을 노출시킵니다.

26.5 gauge 바늘이 장착된 멸균 주사기를 사용하여 두부 혈관을 천자하고, 50~100 µL 또는 10~20 µL의 혈림프를 채취합니다. 해당 동물을 여러 번 공여자로 사용할 경우, 채취한 혈림프를 멸균된 1.5 mL 튜브에 담아 얼음 위에 보관하십시오. 이 단계가 올바르게 수행되었다면 오징어의 혈액은 짙은 파란색으로 보여야 합니다.

동물을 일반 해수 탱크로 옮겨 회복시킨 후, 상온의 미세 원심분리기로 혈림프를 원심분리하여 혈구(hemo)를 펠렛화하고 상층액을 파이펫으로 제거합니다. 세척을 위해 혈구를 500 µL의 오징어 링거 용액에 재부유시킵니다. 그 후 다시 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다.

마지막으로, 혈구와 오징어 링거액을 재현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 농도를 결정합니다. 그런 다음 유리 커버슬립의 각 챔버에 약 2000개의 세포를 첨가합니다.

세포가 유리에 부착되도록 약 10분 동안 둡니다. 이 정도의 밀도에서 hemos는 유리 표면에 균일한 단층을 형성해야 합니다. 28 °C의 오비탈 쉐이커에서 박테리아를 준비하는 동안 hemos를 얼음 위에 보관하십시오.

녹색 형광 리포터 유전자를 포함하는 Vireo 박테리아의 한 가지 또는 여러 균주를 해수 tritone 배지에서 mid log phase까지 배양합니다. 분광광도계를 사용하여 600nm에서 배양액의 광학 밀도를 측정하여 세포 밀도를 결정한 후, 원심분리를 통해 박테리아 펠렛을 형성하고 상층액을 제거한 뒤 펠렛을 재현탁합니다. 1mL의 squid ringer 용액에 박테리아를 넣고 이를 혈구(hemocytes)에 첨가합니다.

챔버당 100,000마리의 박테리아가 들어 있는 챔버 글라스 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드를 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 최대 결합을 달성하기 위해, 세포질을 염색할 수 있도록 최종 농도가 0.005%가 되게 cell tracker orange를 첨가합니다.

30분 동안 배양한 후, 150 µL의 신선한 오징어 링거액(squid ringer solution)으로 세척합니다. 공초점 현미경으로 염색된 헤모사이트(hemoctyes)와 결합된 박테리아를 관찰하고, 헤모사이트 전체 표면의 박테리아 수를 측정합니다. 이제 GFP가 표지된 비공생 박테리아인 Vibrio harveyi와 천연 오징어 공생균인 Vibrio fischeri를 처리한 헤모사이트의 대표 이미지를 보여드리겠습니다.

박테리아를 처리하지 않은 헤모사이트(hemo site)의 이미지입니다. 세포가 붉게 보이며 활성화된 상태입니다. 따라서 위족과 같은 돌기들이 형성된 것을 확인할 수 있습니다.

세포에 공생 박테리아인 filio fii를 처리하면, 소수의 박테리아가 세포 표면에 결합하는 것을 볼 수 있습니다. 반면, 비공생 박테리아인 filio Harvey Harveyi를 혈구(hemos)에 노출시키면 훨씬 더 많은 박테리아가 결합합니다. 지금까지 보브테일 오징어에서 혈림프를 추출하고, 혈구를 분리하여 이러한 오징어 세포에 대한 박테리아 부착 특성을 분석하는 실험에 사용하는 방법을 살펴보았습니다.

이 프로토콜은 혈구 세포가 커버슬립 표면에 부착된 후 고정함으로써 면역화학 분석용으로 수정될 수 있습니다. 또한 동물로부터 혈구 세포를 얻은 후 RNA, DNA 및 단백질을 추출할 수 있습니다. 이상으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.