Name: 다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 Microfluidic 시스템 : 미생물의 창 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-03T16:11:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: 배우세요 다공성 매체에서 미생물 이동을 연구하는 간단한 마이크로유체 시스템을 사용하는 방법을. 이 장치는 세균 수송 현상을 실시간으로 시각화하여 환경 복원 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 통합 Biosystems 연구 및 교육 (VIIBRE)에 대한 밴더빌트 연구소 국립 과학 재단 (National Science Foundation),에서와 써얼 시스템 생물학 및 생물 학부 연구 체험 (써얼 SyBBURE)에 의해 부여 # 0,649,883에 의해 지원되었다.

I. Microfluidic 장치 제작 <ol><li> microfluidic 장치를 만드는 첫 번째 단계는 컴퓨터를 통한 도면 (CAD) 프로그램에서 장치의 2 차원 레이아웃을 그릴 것입니다. 우리는 AutoCAD를 사용했지만 다른 드로잉 프로그램은 CleWin 등도 사용할 수 있습니다, 또는 CorelDraw. </li><li> 다음 단계는 photolithographic 마스크를 조작하는 것입니다. 장치 크기에 따라 해상도와 예산을 요구,이 마스크는 사진 필름에서 만든 크롬 (최고 해상도, 높은 비용)에서 가공 또는 고해상도 프린터를 사용하여 오버헤드 투명에 직접 인쇄 수 있습니다. 여기서 우리는 사전 Reproductions 주식 회사, 노스 앤도버, MA에 의해 제조 피크 마스크를 사용했습니다. </li><li> 다음 단계는 제기된 - 구제 금형을 만들 수 감광성의 에폭시로 마스크의 패턴을 전송하는 것입니다. <ol><li> 첫째, 부정적인 SU8 포토 레지스트의 레이어는 원하는 두께로 실리콘 웨이퍼에 냈지, 그리고 초과 용매를 휘발로 구운 것입니다. 포토 레지스트 제제 및 회전 속도가 침전 층의 두께를 제어합니다. </li><li> 그런 다음 패턴은 마스크를 통해 자외선의 미리 정해진 복용량에 노출됩니다. 게시 노출 베이킹 크로스 링크들을 불용성 렌더링 포토 레지스트 코팅의 가벼운 노출 영역을. </li><li> 다음은 unexposed 저항 개발 단계, 긍정적인 인상 - 구호 구조 마스터라는 떠나, 화학 개발자와 제거입니다. </li><li> 세 번째 빵을 단계는 경 베이킹 단계 더 구조를 수정하는 옵션입니다했다. </li></ol></li><li> PDMS 성형 <ol><li> 우리는 microfluidic 장치 1 복제 성형을위한 실리콘 탄성체 폴리 (디메틸 실록산)를 사용합니다. 첫째, 기본 재료는 같은 배양 접시 같은 얕은 용기에 금형 위에 부어 경화 에이전트와 10시 1분 무게 비율의 혼합, 그리고 보이는 거품이 사라지기 전에 진공 하에서 degassed입니다. </li><li> uncured PDMS와 함께 마스터는 다음 65 적어도 4h에 대해 신중하게 파괴 오븐에 배치됩니다 ° C를위한 가교 발생하는 폴리머의. </li><li> PDMS가 확정되면 성형 부분 페트리 접시 밖으로 절단합니다. 구멍이 완성 장치에 microfluidic 공간에 액세스하는 장치의 최고를 부수고있다. </li></ol></li><li> 유리 첨부 파일 <ol><li> 클린 PDMS는 irreversibly 산소 플라즈마에 노출하여 유리를 청소 보세 있습니다. 첫째, 성형 및 천공 PDMS와 깨끗한 유리 슬라이드는 플라즈마 클리너로 결합 표면을 배치하고 있습니다. 우리는 PDC - 32G Harrick 플라즈마 클리너를 사용했습니다. </li><li> 챔버가 폐쇄되면 연산자는 무선 주파수 또는 RF 소스 다음 진공 펌프 켜집합니다. 플라즈마 자기 챔버에서 약간 보라색 발광에 의해 입증, 약실에 점화됩니다. </li><li> 30 초 동안 플라즈마에 노출된 후, RF 소스 다음 진공 펌프가 해제됩니다. </li><li> 신속, 유리 슬라이드와 PDMS 장치는 챔버에서 제거와 직접 접촉 (다운 성형 PDMS 표면 쪽)으로 이동됩니다. 이것은 돌이킬 수 본드를 형성하며, 또한 표면 특성은 친수성하겠습니다. </li><li> 원하는 경우, 다른 표면 화학은 흡착 또는 결합 공유 결합에 의해 표면에 단백질의 고정을 통해 PDMS로 형성될 수 있습니다. </li><li> 장치는 다음 탈이온수, 성장 미디어, 또는 모세관 세력이나 주사기로 부드러운 압력을 사용하여 인공 지하수와 같은 액체로 가득 수 있습니다. </li></ol></li></ol> II. 중량 분석에 의해 Microfluidic 장치의 흐름 부량 <ol><li> 장치의 압력 중심의 흐름을 보정하기 위해, 마이크로 구조 흐름 세포가 처음 DI 워터와 함께 미리되었습니다. </li><li> 이러한 플라스틱 주사기 또는 흐름 모듈로 액체가 들어있는 저수지는 (그림 1 참조) 잘 상류 유입구에 연결하고, 저수지에서 유체의 높이가 잘 하류에있는 높이 이상 유지됩니다. </li><li> 샘플은 일정한 간격으로 잘 폐기물의 수집 분석 균형에 무게입니다. </li><li> 총 시간 대 총 볼륨을 세우고있는 곡선의 기울기는 평균 판매량 유량 (그림 2)를 제공합니다. 우리는 압력 헤드의 광범위한 및 다른 압력 유지 시스템에 대한 재현성, 선형 평균 판매율을 발견했습니다. </li></ol> III. 흐름 시각화, 속도 매핑하고, 소수성 / 친수성 ​​상호 작용 <ol><li> 모델 보정을위한, 모두 카르복시 YG 및 일반 YG 표면에서 3 μm의 형광 라텍스 비즈는 Polysciences 주식 회사에서 인수되었으며 0.01 % 고체의 농도에 DI의 물에 희석되었다. </li><li> 서식지를 통해 흐르는 구슬은 Mightex BCE - B013 - U 흑백 카메라가 장착되어 자이스 혈구 Axiovert 25 형광 현미경에 시각되었습니다. </li><li> 개별 프레임은 연거푸 캡처 ImageJ 소프트웨어 패키지 (그림 3)와 영화로 조립되었다. </li></ol> IV. 박테리아 성장과 수송 모델링을위한 Microfluidic 장치 (EcoChip) <ol><li> 비브리오 SP. GFP 칸, 비 병원성 녹색 형광 단백질 표현의 생물은 약 10 9 셀 / ML의 농도 Luria - Bertani 매체에서 14 시간 동안 성장했다. </li><li> 성장 매체의 박테리아는 EcoChip 장치에 도입 장치를 이식하고 19 시간 하루 flocs과 영화를 설립 허용되었습니다. </li><li> 다음 성장 미디어는 우물에서 제거되었으며 서식지의 모든 박테리아의 다른 밀도가 서로 다른 서식지에 남아 있다고 있도록 (ASW의 제조법을 왕 외 2.을 참조하시기 바랍니다) 인공 해수로 플러시했습니다. </li><li> 느린 흐름 조건 3 다른 서식지에서 유지하는 동안 하나의 서식지가, 아니 흐름과 함께 봉인 보관했다. </li><li> 세균성 성장의 형광등과 흰색 광선이 사진은 몇 일 (그림 4)의 기간 동안 매 15-20시간을 촬영했다. </li></ol> V. 대표 결과 흐름 모듈은 여러 개의 서식지를 통해 흐름을 규제하고 배포에 대한 간단한 방법을 제공합니다. 중량 분석은 서식지와 입력 및 출력 우물 사이의 압력 차이의 유압 저항에 따라 서식지 구조를 통해 흐름 속도를 결정하기 위해 쉽고 간단 방법이었다. 비드 흐름 실험을 위해 우리는 uncarboxylated 비즈 (그림 2)에 대한 장치의 표면에 훨씬 더 큰 비드 축적을 관찰했습니다. 또한, 큰 직경 비즈, 6, 10 음, 훨씬 더 작은 구멍 구멍에 개입되고 장치에 축적하기 시작 가능성이 있었다. 빠른 흐름 속도는 입자의 유지 및 유입을 감소. 박테리아 성장 실험 동안, 유동 조건의 영향을 분명 분명하다. 연속 전단 병력 함께 집계에 세균 및 양식 flocs를 발생하고, 개별 세포로 찾을 수 없습니다. 대형 세균성 flocs의 교통은 매크로 시스템에서 공부하는 것은 매우 어려운 중요한 환경 과정입니다. <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. 도식 보여주는 기능과 흐름 모듈의 작동. <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. 다른 열 높이에 대한 중량 분석에 의해 결정 등 구조적인 서식지를 통해 유량. 열 높이 비율 : 40분의 60 = 1.5, 결정 유량 비율 : 1.04 / 0.71 = 1.46. H = 40mm에 대한 결과 유량이 V입니다 = 0.71 μL / 분 및 H에 대한 = 60mm가 V입니다 = 1.04 μ의 L / 분. 예상 평균 선형 판매율은 각각 3.1 mm / s와 4.6 mm / s의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig3.jpg" alt="그림 3"> 그림 3.와 카르복 실화는 구조 서식지를 통해 흐르는 않고 3um 라텍스 구슬의 교통. <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig4.jpg" alt="그림 4"> 그림 4. 박테리아 성장 속도가 느린 흐름의 존재에 종자 밀도의 함수로 biofilm 형성에 변경합니다.

<ol><li>Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+protozoa+through+narrow+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mobility of protozoa through narrow channels.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).</li>
</ol>

EcoChip 시스템은 개별 실험의 요구에 적응합니다. 새 주인은 비교적 쉽게 만들 수 있으며, 마스터가 조작된되면 필요에 따라 추가로 정확하게 복제 장치 캐스트하실 수 있습니다. 흐름 모듈은 사용이 간단 특별한 장비 또는 복잡한 연결을 필요로하지 않으며, 간단한 변수위 압력 기반의 플로우 시스템으로 모델링 될 수 있습니다. 이 작품은 추가 확장 지속하고 있으며, humic 산성 코팅 채널을 생성하고, 체계적으로 흐르는 유체의 수성 화학 변화가 있습니다. 이 방법을 사용하여 다공성 매체의 표면 및 성장 및 수송 현상과 박테리아의 마이크로 규모의 상호 작용을 직접 관찰하고 체계적으로 조사 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU8-2025</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 비드</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 microfluidic 시스템 : 미생물의 창

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

다공성 매체에서 미생물의 성장과 교통 지하수 및 표면 물, 환경에서 영양분의 재활용뿐만 아니라, 직접에 대한 식수 공급에 병원균의 전송 품질에 대한 중요한 의미를했습니다. 자연 다공성 매체는 복잡한 물리적 토폴로지, 다양한 표면 화학, 영양분과 전자 acceptors 동적 그라디언트, 그리고 미생물의 곳곳에 분포로 구성되어 있습니다. 이러한 기능은 해석하기 어려운 미생물 교통 매크로 규모의 조사의 결과를 만들어 마이크론의 길이 규모 이상의 대폭 다양하고, 기계론의 모델의 검증 도전. 여기 간단한 microfluidic 장치, 마이크로 구조 서식지와 미생물 상호 작용을 시각화하기 위해 관찰된 현상에 영향을 미치는 핵심 프로세스를 파악하고, 체계적으로 예측 모델의 유효성을 검사하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 간단하고 사용하기 쉬운 흐름 세포는 투명, biocompatible와 산소 투과 재료 - 폴리 (디메틸 실록산) 밖으로 건설되었다. 석판술의 표준 방식은 마이크로 구조 마스터하기 위해 사용되었으며, 복제 성형은 주인의 마이크로 구조 흐름 세포를 캐스팅하는 데 사용되었다. 흐름 세포 챔버의 물리적 디자인은 실험 요구에 적용할 수 있습니다 microchannels은 단순 선형 연결에서 복잡한에 따라 다를 수있는 것은 2 μm의 한 작은 기능 크기 토폴로지. 우리 모듈형 EcoChip 흐름 전지 어레이는 중력 중심의 흐름 모듈에 의해 동일 챔버 및 흐름 제어 수십 있습니다. 우리는 표면 화학, 유체 성질 또는 미생물 인구의 특성의 영향을 조사하는 동안 EcoChip 장치의 사용을 통해, 신체 구조 및 압력 머리가 지속적으로 개최하거나 체계적으로 다양한 수있다는 것을 보여준다. 비 병원성를 사용하여 전송 실험을 통해 녹색 형광 단백질 표현<em&gt; 장염</em&gt; 박테리아 스트레인, 우리는 해비타트 구조, 흐름 조건, 그리고 근본적인 수송 현상에 inoculums 크기의 중요성을 설명하고, 실시간 입자 규모의 관측과 함께, microfluidics은 숨겨진 세계의 뛰어난 전망을 제공 보여줍니다.

Microfluidic 장치는 실시간으로 적절한 물리적인 비늘에서 복잡한 자연의 프로세스를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 표면 하의에 박테리아의 성장과 교통 수단을 공부하고 자연 다공성 매체의 주요 기능을 모방한 것이었 간단한 microfluidic 장치를 개발했습니다.

다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 Microfluidic 시스템 : 미생물의 창

다공성 매질 내의 미생물 성장 및 이동은 지하수와 지표수의 수질, 그리고 ... 내 영양소의 순환에 중요한 영향을 미칩니다.

본 연구에서는 eco chip 장치를 사용하여 물리적 구조와 압력수를 일정하게 유지하거나 변화시킬 수 있음을 보여줍니다. 비병원성 녹색 형광 단백질 발현 VIO 박테리아 균주를 이용한 이동 실험을 통해 표면 화학, 유체 특성 또는 입자 및 미생물의 특성이 미치는 영향을 체계적으로 조사하는 한편, 서식지 구조, 유동 조건 및 접종 균수 등이 기본적인 이동 현상에 미치는 중요성을 설명합니다. 미세유체 소프트웨어는 숨겨진 세계에 대한 설득력 있는 시각을 제공합니다.안녕하세요, 밴더빌트 대학교 밴더빌트 통합 바이오시스템 복원 교육 연구소의 Dimitri Marker입니다. 저는 Viro Laboratories의 연구 개발 엔지니어 David Schafer입니다. 안녕하세요, 코네티컷 대학교 환경 과학 및 공학 센터의 화학 재료 및 생분자 공학과의 Leslie Sho입니다. 그리고 저 또한 Zebra 소속인 added Dicot입니다.오늘은 기초 환경 과학 및 공학 연구를 위한 모듈형 미세유체 서식지 어레이(modular microfluidic habitat arrays) 제작 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 산림 매질 내 미생물 이동 상호작용에 마이크로미터 규모 구조가 미치는 영향을 조사하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다.미세유체 장치를 제작하는 첫 번째 단계는 컴퓨터 보조 설계 또는 CAD 프로그램을 사용하여 장치의 2차원 레이아웃을 그리는 것입니다. 본 실험에서는 AutoCAD를 사용하였으나, Clue-in이나 CorelDraw와 같은 다른 설계 프로그램도 사용할 수 있습니다. 해당 소프트웨어를 통해 설계자는 거시적 영역 전체에 걸쳐 물리적 구조를 충실하게 재현할 수 있으며, 개별 특징들은 5 µm 미만의 해상도로 정의됩니다.CAD 도면으로부터 포토마스크를 제작합니다. 당사는 매사추세츠 북단에 위치한 Advanced Reproductions Corporation에서 제조한 크롬 마스크를 사용합니다. 미세유체 소자 제작의 다음 몇 단계는 마스터를 만들기 위해 클린룸에서 진행됩니다.깨끗한 실리콘 웨이퍼를 스핀 코더로 포토레지스트 코팅합니다. 먼저, 웨이퍼를 스핀 코더 플랫폼에 부착하고 SU 8 20 25 포토레지스트 몇 그램을 웨이퍼 중심에 붓습니다. 그런 다음 웨이퍼를 500 RPM에서 15초 동안 1차적으로 회전시켜 도포한 후, 4,000 RPM에서 35초 동안 회전시켜 얇게 코팅합니다.스핀 코팅 후, 웨이퍼를 95 °C의 핫플레이트 위에 10분 동안 놓아 과잉 용매를 휘발시킵니다. 웨이퍼 준비의 마지막 단계는 엣지 비드(edge bead)를 제거하는 것입니다. 이는 웨이퍼를 다시 스핀 코더로 옮긴 후, 코팅된 웨이퍼의 바깥쪽 가장자리에 SUA 엣지 비드 제거제를 지속적으로 도포하여 수행합니다.다음 단계는 UV 광선에 선택적으로 노출시켜 포토레지스트의 패턴을 형성하는 것입니다. 먼저, 코팅된 웨이퍼를 평평한 표면에 놓고 그 위에 크롬 마스크를 직접 올립니다. 루비리스(Rubylith) 적색 마스킹 필름은 원하는 영역 외부로 패턴이 전사되는 것을 차단합니다.다음으로, 스폿 전달 시스템을 사용하여 마스크를 통해 코팅된 웨이퍼에 300 mJ/cm²의 UV 광량을 조사합니다. 마지막으로, 웨이퍼를 95 °C에서 15분 동안 베이킹하여 포토레지스트의 광 노출 영역을 가교시켜 불용성으로 만듭니다. 마스터 제작의 마지막 단계는 가교되지 않은 포토레지스트 영역을 제거하여 돌출된 릴리프 구조를 남기는 것입니다.먼저, 웨이퍼를 다시 스핀 코더로 옮겨 현상액으로 덮습니다. 코팅된 웨이퍼 위에 현상액을 약 5분간 방치한 후 스핀 오프 시키면, 웨이퍼 상에 패턴이 명확하게 나타납니다. 남은 잔여물은 회전하는 웨이퍼 위에 이소프로필 알코올을 분사하여 씻어냅니다.이 단계에서는 약 5~10초 동안 2200 RPM의 회전 속도를 사용합니다. 마지막으로, 완성된 마스터를 질소 가스 흐름으로 건조한 후 장치 캐스팅에 필요할 때까지 디시에 보관합니다. 저희는 실리콘 엘라스토머인 polymethyl alane을 사용하여 미세유체 장치를 제작합니다.먼저, 기초 재료와 경화제를 10:1의 중량비로 플라스틱 컵에 넣습니다. 그다음, 혼합물을 섞어줍니다. Andy는 Thinky AR 100 컨디셔닝 믹서를 사용하여 기포를 제거했습니다.사이클이 완료되면, 액체 PDMS를 마스터 위에 고르게 붓습니다. 마스터와 경화되지 않은 PDMS가 담긴 디쉬를 진공 챔버에 넣고 가스를 제거합니다. 그러면 폴리머 기포가 거의 즉시 나타납니다.모든 기포가 사라질 때까지 탈기를 계속합니다. 폴리머의 가교 반응이 완전히 일어날 수 있도록 디쉬를 65 °C의 수평 오븐에 넣고 최소 4시간 동안 둡니다. 그 후, 경화된 PDMS를 재사용 가능한 마스터에서 조심스럽게 제거합니다.메스를 사용하여 패턴 영역의 충분한 바깥쪽에서 처음 네 개의 가장자리를 절단한 후, 핀셋을 사용하여 패턴 웨이퍼에서 장치를 떼어냅니다. 필요한 경우 가위를 사용하여 장치의 가장자리를 다듬을 수 있습니다. 성형된 PDMS 장치의 일부 구역을 나머지 부분과 분리하여 사용할 수 있습니다.다음으로, PDMS에 액세스 홀을 뚫습니다. 작은 아버(arbor)에 장착된 다양한 크기의 시판용 생검 펀치(biopsy punch)를 사용합니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 코어를 제거합니다.마지막으로, 트리밍과 펀칭이 완료된 장치를 이소프로필 알코올과 폼 팁 폴리프로필렌 면봉을 사용하여 세척합니다. 장치를 질소로 건조한 후 오븐에 넣어 용매의 모든 흔적을 제거합니다. 미세유체 장치 제작의 마지막 단계는 PDMS를 유리 슬라이드 기판에 본딩한 다음, 먼저 유체를 채우는 것입니다.PDMS 장치와 유리 슬라이드의 본딩 면이 위를 향하도록 플라스마 세정기에 넣습니다. 본 실험에서는 PDC 32 G herrick 플라스마 세정기를 사용합니다. 진공 상태가 형성되고 청자색 플라스마가 보이면, 타이머를 30초로 설정합니다.플라즈마 발생기를 끕니다. 챔버의 압력을 다시 높인 후, 장치와 슬라이더를 챔버에서 꺼내 접합 표면을 서로 밀착시킵니다. 활성화된 구성 요소를 챔버에서 꺼낼 때는 표면의 활성 상태가 유지될 수 있도록 신속하게 이동하는 것이 중요합니다.가벼운 압력을 가하면 접착 상태를 개선하는 데 도움이 됩니다. 핀셋으로 모서리를 당겨 접착 품질을 확인합니다. 그 후, 친수성 내부 공간을 완충 용액 또는 탈이온수와 같은 수용액으로 쉽게 채울 수 있습니다.각 소스 웰과 그에 해당하는 미세다공성 유동 셀에 수성 유체를 주입합니다. 모든 챔버가 가득 차면, 증발을 억제하고 멸균 상태를 유지하기 위해 경화된 PDMS의 얇은 층을 장치 전체에 덮습니다. 장치 내의 압력 구동 유동을 보정하기 위해, 미세 구조 유동 셀에 탈이온수를 미리 채우고, 유체 전달 인터페이스 및 멸균 씰 역할을 하는 유동 모듈을 장치 상단에 배치합니다.이 유량 모듈은 단독으로 사용하거나 플라스틱 주사기와 같은 외부 유체 저장조에 연결하여 사용할 수 있습니다. 플라스틱 주사기와 같은 액체 저장조 또는 유량 모듈을 상류 입구에 연결하십시오. 저장조 내 유체의 높이가 하류 높이보다 높게 유지되어야 합니다.상류 저수조와 각 하류 배출정 사이의 높이 차이는 장치를 통한 유량을 정량화하기 위한 압력 구동 흐름의 추진력을 정의합니다. 25 gauge 둔단 바늘을 사용하여 일정 간격으로 하류정에서 샘플을 수집합니다. 예를 들어, 샘플 간의 실제 경과 시간을 주의 깊게 기록하며 15~20분마다 샘플을 수집합니다.분석 저울을 사용하여 샘플링 전후의 시린지 무게를 기록합니다. 응집체 부피와 응집체 시간의 관계를 도표로 나타내며, 이때의 기울기는 평균 질량 유량과 같습니다. 유출 웰에 비해 유입 저장조의 단면적이 크기 때문에 유체가 장치를 통과할 때 유량이 크게 변하는 것을 방지할 수 있습니다. Y축에 샘플링된 부피를, X축에 샘플링 시간을 표시하여 그래프를 그립니다.Excel과 같은 간단한 그래프 작성 프로그램을 사용하여 직선의 기울기를 구하며, 이 기울기는 평균 부피 유량으로 사용됩니다. 표면의 carboxy, YG 및 plain YG 특성을 가진 3 µM 농도의 형광 라텍스 비드 희석 용액을 사용하여 흐름을 시각화하고 표면 상호작용을 연구합니다. 먼저, 탈이온수 내 비드 농도가 0.01%solids가 되도록 비드 용액을 준비합니다.용액을 상류 웰에 첨가하고 유동 모듈을 다시 연결합니다. 비드 유동을 한 시간 동안 관찰하며, MITx BCEB 0 1 3 U 단색 카메라가 장착된 Zeiss AIOt 25 형광 현미경을 사용하여 약 10분 간격으로 기록합니다. 형광 조명과 투과광 조명을 사용하여 개별 프레임을 빠르게 연속 캡처한 후, Image J와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 동영상으로 제작합니다.비드와 구조물이 모두 보입니다. 투과광을 차단하면 밝은 형광 비드만 보입니다. 바닥 표면을 따라 증착되었거나 수집기에 부착된 정지 상태의 비드들이 장치 전체에서 확인됩니다.Vibrio 종과 같이 살아있는 박테리아를 사용하는 실험을 위해, 비병원성 녹색 형광 단백질 발현 박테리아를 준비합니다. 먼저, 저온 냉동 보관된 스톡 배양액을 꺼냅니다. 멸균된 LB 성장 배지가 담긴 플라스크에 스톡 배양액을 접종합니다.일회용 백금루프를 사용하여 플라스크를 흔들어주며 밤새 배양하여, 밀리리터당 약 10⁹ cells 농도의 정지기 배양액을 얻습니다. 응용 분야에 따라 박테리아의 초기 농도를 더 정확하게 정량할 수 있습니다. 멸균 버퍼가 채워진 미세유체 장치를 준비합니다.그 다음 상류 웰의 멸균 액체를 비우고 20 µL의 박테리아 배양액으로 교체합니다. 피펫을 사용하여 박테리아를 디바이스에 접종하며, 이때 출력 웰에서 시린지로 부드럽게 흡입합니다. 배양 후, 군집 형성 후 각 웰의 형광 강도를 정량화하여 웰 내의 박테리아 양을 결정할 수 있습니다. 상류 입구 웰을 이전과 동일하게 비우고 25 ppt 염분 농도의 완충액으로 세척합니다.주입기(syringe)를 사용하여 상류 웰(well)에 인공 해수를 완만하게 가압하여, 개별 유체 칩(flow cell)을 20 to 40 µL의 완충 용액으로 세척합니다. 이는 초기 세척 후 유체 칩 내 미세유체 토양 부분의 공극 부피보다 약 100 to 200배 많은 양입니다. 다공성 매질을 통한 박테리아의 장기 관류는 앞서 설명한 것과 동일하게 유동 모듈을 사용하여 수행합니다.박테리아의 성장 및 이동에 대한 형광 및 백색광 이미지를 시간에 따라 측정할 수 있습니다. 본 실험에서는 Q imaging ink사의 color five cooled CCD 카메라를 사용하여 7일 동안 15~20시간마다 이미지를 촬영합니다. 당사의 장치는 또한 물리적 서식지 구조가 원생동물의 포식으로부터 박테리아에게 피난처를 제공하는 효과를 조사하는 데 사용될 수 있습니다.미세다공성 유동 셀 내의 박테리아와, 장치 내에서 박테리아를 섭식하고 있는 훨씬 더 큰 섬모 원생동물 eulo의 모습이 보입니다. 미세유체 장치의 유체 흐름을 분석한 결과, 40 millimeter 압력수두에서 평균 유속은 0.71 microliters per minute인 것으로 나타났습니다. 압력수두를 60 millimeter로 높이자 유속은 1.04 microliters per minute로 비례하여 증가했습니다.장치 내에서 다양한 표면 화학 특성을 가진 비드를 사용할 때, 카르복실화되지 않은 비드가 장치 표면에 더 많이 축적되는 것을 관찰하였습니다. 직경 6~10 mm의 비드는 더 작은 기공 입구에 포획될 가능성이 훨씬 높았습니다. 더 높은 정수압으로 인해 유속이 빨라지면 비드의 유지 및 포획이 감소하였으며, 이는 eco chipp 미세유체 장치에서 박테리아 성장을 분석할 때 예상되는 결과와 일치합니다.장치의 서로 다른 구역에서 이미지 강도의 정성적 차이가 나타남을 알 수 있습니다. 형광 강도는 채널 내 미생물 생물량의 대리 지표로서 정량화될 수 있습니다. 진행 중인 실험에서, 저유량 조건의 지속적인 전단력은 이 이미지들에서 분명하게 나타나듯이 박테리아 응집 및 플록 형성을 유발하는 것으로 관찰됩니다. 지금까지 입자 크기 측정, 다공성 매질을 통한 충돌 수송 측정, 또는 미세 구조 서식지에서의 미생물 상호작용 조사를 위해 간단한 미세유체 장치를 제작하고 사용하는 방법을 살펴보았습니다.유동 셀을 이용한 연구를 수행할 때, 비드의 부력과 콜로이드 및 수집기의 표면 화학적 특성을 고려하는 것이 중요합니다. 미세유체 영역으로 규모를 축소하면 표면 효과가 관찰되는 현상에 지배적인 영향을 미칠 수 있습니다. 실제로 거의 모든 물리적 구조를 미세유체 유동 셀 설계에 통합할 수 있습니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Scheidweiler, D. 외. 유체 장치와 현미경 및 유동 세포분석을 결합하여 공간적 규모를 넘어 다공성 배지 내 미생물 수송을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 무작위로 배열된 기둥들로 구성된 다공성 매트릭스를 통해 박테리아의 운동성을 정량화하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 형광 표지된 박테리아를 장치에 투입하고, 다공성 매트릭스를 통과해 관찰 채널로 이동하는 동안 현미경으로 영상화한 후 분석하여 돌파 곡선(BTC)을 생성합니다.

마이크로플루이딕 장치를 이용한 박테리아 운동성 평가

출처: Kurz, D. L. 외 다공성 매질에서 생체 클로깅을 연구하기 위한 마이크로플루이딕 플랫폼. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 바이오필름 형성을 연구하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 박테리아 현탁액이 마이크로채널에 주입된 후 바이오필름 현상을 위해 배양합니다. 그 후 유동을 재개하고, 압력 모니터링과 영상을 사용하여 시간에 따른 바이오필름 형성과 기공 폐쇄를 감지합니다.

바이오필름 형성 중 실시간 영상 및 압력 추적을 위한 마이크로유체 장치

이 프로토콜에서는 원핵 생물의 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 생물반응기(PLBR)의 제작, 설정 및 기본 작동이 소개됩니다. 산업적으로 관련된 미생물을 원리 증명으로 분석하여 기존 방법으로는 거의 불가능했던 특정 기간 동안의 성장 속도, 형태 및 표현형 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

미세유체 칩을 제작하여 탠덤 버블 생성을 위한 한 쌍의 금색 점과 근처의 단세포 패터닝을 위한 피브로넥틴 코팅 섬을 생성했습니다. 그 결과 생성된 유동장은 입자 이미지 속도계로 특징지어졌으며 세포막 반작용, 막 변형 및 세포 내 칼슘 반응을 포함한 다양한 생체 효과를 연구하는 데 사용되었습니다.

단일 세포 수준에서 캐비테이션 버블 (들) -cell 상호 작용 및 결과 Bioeffects을 조사하기위한 표면 패터닝와 마이크로 유체 시스템

이 절차의 목표는 쉽고 빠르게 사용자 정의 형상과 저항 유기 액체 기름 복구 연구 하 여 붓기와 미세 장치를 생산 하는입니다. 입니다 형 처음 생성 이며 에폭시 기반 장치를 캐스팅 하는 데 사용 합니다. 대표 변위 연구 보고 됩니다.

다공성 매체에 있는 기 공-규모 이벤트 프로세스 오일 복구 응용 프로그램에 대 한 특성화를 위한 미세 장치

획기적인 곡선(BtC)은 다공성 미디어에서 박테리아의 운반을 연구하는 효율적인 도구입니다. 여기에서는 현미경 검사법과 유동 세포계 계수와 함께 유체 장치를 기반으로 한 도구를 소개하여 BtC를 획득합니다.

유체 장치를 현미경 검사법과 유동 세포측정과 결합하여 공간 저울을 가로지르는 다공성 미디어에서 미생물 수송을 연구합니다.

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

본 프로토콜은 고해상도 현미경 이미징과 동시 압력 차이 측정을 결합하여 준 2D 다공성 배지에서 생물막 발달을 연구하는 미세 유체 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 다공성 매체의 공극 크기와 유체 유속이 생물 막힘에 미치는 영향을 정량화합니다.

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이 프로토콜은 개방형 웰 형식과 유체 흐름 기능을 통합하는 재구성 가능한 멤브레인 기반 세포 배양 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 표준 프로토콜과 호환되며 오픈 웰과 미세유체 배양 모드 간의 가역적 전환이 가능하여 엔지니어링 및 생명과학 실험실의 요구 사항을 모두 수용할 수 있습니다.

정적 장벽 조직 모델을 동적 미세생리학 시스템으로 변환

이 프로토콜은 망간 산화물 광물의 미생물 침전을 연구하기 위한 미세유체 시스템을 제시합니다. 생체광물 형성은 광학 현미경과 영상 분석을 통해 현장에서 측정됩니다. 이 접근법은 다공성 환경에서 다른 독특한 색을 가진 생물 광물의 침전을 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

다공성 매체 내 금속 산화물의 미생물 침전을 조사하는 마이크로유체 플랫폼

배우세요 다공성 매체에서 미생물 이동을 연구하는 간단한 마이크로유체 시스템을 사용하는 방법을. 이 장치는 세균 수송 현상을 실시간으로 시각화하여 환경 복원 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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