다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 Microfluidic 시스템 : 미생물의 창

본 연구에서는 eco chip 장치를 사용하여 물리적 구조와 압력수를 일정하게 유지하거나 변화시킬 수 있음을 보여줍니다. 비병원성 녹색 형광 단백질 발현 VIO 박테리아 균주를 이용한 이동 실험을 통해 표면 화학, 유체 특성 또는 입자 및 미생물의 특성이 미치는 영향을 체계적으로 조사하는 한편, 서식지 구조, 유동 조건 및 접종 균수 등이 기본적인 이동 현상에 미치는 중요성을 설명합니다. 미세유체 소프트웨어는 숨겨진 세계에 대한 설득력 있는 시각을 제공합니다.

안녕하세요, 밴더빌트 대학교 밴더빌트 통합 바이오시스템 복원 교육 연구소의 Dimitri Marker입니다. 저는 Viro Laboratories의 연구 개발 엔지니어 David Schafer입니다. 안녕하세요, 코네티컷 대학교 환경 과학 및 공학 센터의 화학 재료 및 생분자 공학과의 Leslie Sho입니다. 그리고 저 또한 Zebra 소속인 added Dicot입니다.

오늘은 기초 환경 과학 및 공학 연구를 위한 모듈형 미세유체 서식지 어레이(modular microfluidic habitat arrays) 제작 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 산림 매질 내 미생물 이동 상호작용에 마이크로미터 규모 구조가 미치는 영향을 조사하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다.

미세유체 장치를 제작하는 첫 번째 단계는 컴퓨터 보조 설계 또는 CAD 프로그램을 사용하여 장치의 2차원 레이아웃을 그리는 것입니다. 본 실험에서는 AutoCAD를 사용하였으나, Clue-in이나 CorelDraw와 같은 다른 설계 프로그램도 사용할 수 있습니다. 해당 소프트웨어를 통해 설계자는 거시적 영역 전체에 걸쳐 물리적 구조를 충실하게 재현할 수 있으며, 개별 특징들은 5 µm 미만의 해상도로 정의됩니다.

CAD 도면으로부터 포토마스크를 제작합니다. 당사는 매사추세츠 북단에 위치한 Advanced Reproductions Corporation에서 제조한 크롬 마스크를 사용합니다. 미세유체 소자 제작의 다음 몇 단계는 마스터를 만들기 위해 클린룸에서 진행됩니다.

깨끗한 실리콘 웨이퍼를 스핀 코더로 포토레지스트 코팅합니다. 먼저, 웨이퍼를 스핀 코더 플랫폼에 부착하고 SU 8 20 25 포토레지스트 몇 그램을 웨이퍼 중심에 붓습니다. 그런 다음 웨이퍼를 500 RPM에서 15초 동안 1차적으로 회전시켜 도포한 후, 4,000 RPM에서 35초 동안 회전시켜 얇게 코팅합니다.

스핀 코팅 후, 웨이퍼를 95 °C의 핫플레이트 위에 10분 동안 놓아 과잉 용매를 휘발시킵니다. 웨이퍼 준비의 마지막 단계는 엣지 비드(edge bead)를 제거하는 것입니다. 이는 웨이퍼를 다시 스핀 코더로 옮긴 후, 코팅된 웨이퍼의 바깥쪽 가장자리에 SUA 엣지 비드 제거제를 지속적으로 도포하여 수행합니다.

다음 단계는 UV 광선에 선택적으로 노출시켜 포토레지스트의 패턴을 형성하는 것입니다. 먼저, 코팅된 웨이퍼를 평평한 표면에 놓고 그 위에 크롬 마스크를 직접 올립니다. 루비리스(Rubylith) 적색 마스킹 필름은 원하는 영역 외부로 패턴이 전사되는 것을 차단합니다.

다음으로, 스폿 전달 시스템을 사용하여 마스크를 통해 코팅된 웨이퍼에 300 mJ/cm²의 UV 광량을 조사합니다. 마지막으로, 웨이퍼를 95 °C에서 15분 동안 베이킹하여 포토레지스트의 광 노출 영역을 가교시켜 불용성으로 만듭니다. 마스터 제작의 마지막 단계는 가교되지 않은 포토레지스트 영역을 제거하여 돌출된 릴리프 구조를 남기는 것입니다.

먼저, 웨이퍼를 다시 스핀 코더로 옮겨 현상액으로 덮습니다. 코팅된 웨이퍼 위에 현상액을 약 5분간 방치한 후 스핀 오프 시키면, 웨이퍼 상에 패턴이 명확하게 나타납니다. 남은 잔여물은 회전하는 웨이퍼 위에 이소프로필 알코올을 분사하여 씻어냅니다.

이 단계에서는 약 5~10초 동안 2200 RPM의 회전 속도를 사용합니다. 마지막으로, 완성된 마스터를 질소 가스 흐름으로 건조한 후 장치 캐스팅에 필요할 때까지 디시에 보관합니다. 저희는 실리콘 엘라스토머인 polymethyl alane을 사용하여 미세유체 장치를 제작합니다.

먼저, 기초 재료와 경화제를 10:1의 중량비로 플라스틱 컵에 넣습니다. 그다음, 혼합물을 섞어줍니다. Andy는 Thinky AR 100 컨디셔닝 믹서를 사용하여 기포를 제거했습니다.

사이클이 완료되면, 액체 PDMS를 마스터 위에 고르게 붓습니다. 마스터와 경화되지 않은 PDMS가 담긴 디쉬를 진공 챔버에 넣고 가스를 제거합니다. 그러면 폴리머 기포가 거의 즉시 나타납니다.

모든 기포가 사라질 때까지 탈기를 계속합니다. 폴리머의 가교 반응이 완전히 일어날 수 있도록 디쉬를 65 °C의 수평 오븐에 넣고 최소 4시간 동안 둡니다. 그 후, 경화된 PDMS를 재사용 가능한 마스터에서 조심스럽게 제거합니다.

메스를 사용하여 패턴 영역의 충분한 바깥쪽에서 처음 네 개의 가장자리를 절단한 후, 핀셋을 사용하여 패턴 웨이퍼에서 장치를 떼어냅니다. 필요한 경우 가위를 사용하여 장치의 가장자리를 다듬을 수 있습니다. 성형된 PDMS 장치의 일부 구역을 나머지 부분과 분리하여 사용할 수 있습니다.

다음으로, PDMS에 액세스 홀을 뚫습니다. 작은 아버(arbor)에 장착된 다양한 크기의 시판용 생검 펀치(biopsy punch)를 사용합니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 코어를 제거합니다.

마지막으로, 트리밍과 펀칭이 완료된 장치를 이소프로필 알코올과 폼 팁 폴리프로필렌 면봉을 사용하여 세척합니다. 장치를 질소로 건조한 후 오븐에 넣어 용매의 모든 흔적을 제거합니다. 미세유체 장치 제작의 마지막 단계는 PDMS를 유리 슬라이드 기판에 본딩한 다음, 먼저 유체를 채우는 것입니다.

PDMS 장치와 유리 슬라이드의 본딩 면이 위를 향하도록 플라스마 세정기에 넣습니다. 본 실험에서는 PDC 32 G herrick 플라스마 세정기를 사용합니다. 진공 상태가 형성되고 청자색 플라스마가 보이면, 타이머를 30초로 설정합니다.

플라즈마 발생기를 끕니다. 챔버의 압력을 다시 높인 후, 장치와 슬라이더를 챔버에서 꺼내 접합 표면을 서로 밀착시킵니다. 활성화된 구성 요소를 챔버에서 꺼낼 때는 표면의 활성 상태가 유지될 수 있도록 신속하게 이동하는 것이 중요합니다.

가벼운 압력을 가하면 접착 상태를 개선하는 데 도움이 됩니다. 핀셋으로 모서리를 당겨 접착 품질을 확인합니다. 그 후, 친수성 내부 공간을 완충 용액 또는 탈이온수와 같은 수용액으로 쉽게 채울 수 있습니다.

각 소스 웰과 그에 해당하는 미세다공성 유동 셀에 수성 유체를 주입합니다. 모든 챔버가 가득 차면, 증발을 억제하고 멸균 상태를 유지하기 위해 경화된 PDMS의 얇은 층을 장치 전체에 덮습니다. 장치 내의 압력 구동 유동을 보정하기 위해, 미세 구조 유동 셀에 탈이온수를 미리 채우고, 유체 전달 인터페이스 및 멸균 씰 역할을 하는 유동 모듈을 장치 상단에 배치합니다.

이 유량 모듈은 단독으로 사용하거나 플라스틱 주사기와 같은 외부 유체 저장조에 연결하여 사용할 수 있습니다. 플라스틱 주사기와 같은 액체 저장조 또는 유량 모듈을 상류 입구에 연결하십시오. 저장조 내 유체의 높이가 하류 높이보다 높게 유지되어야 합니다.

상류 저수조와 각 하류 배출정 사이의 높이 차이는 장치를 통한 유량을 정량화하기 위한 압력 구동 흐름의 추진력을 정의합니다. 25 gauge 둔단 바늘을 사용하여 일정 간격으로 하류정에서 샘플을 수집합니다. 예를 들어, 샘플 간의 실제 경과 시간을 주의 깊게 기록하며 15~20분마다 샘플을 수집합니다.

분석 저울을 사용하여 샘플링 전후의 시린지 무게를 기록합니다. 응집체 부피와 응집체 시간의 관계를 도표로 나타내며, 이때의 기울기는 평균 질량 유량과 같습니다. 유출 웰에 비해 유입 저장조의 단면적이 크기 때문에 유체가 장치를 통과할 때 유량이 크게 변하는 것을 방지할 수 있습니다. Y축에 샘플링된 부피를, X축에 샘플링 시간을 표시하여 그래프를 그립니다.

Excel과 같은 간단한 그래프 작성 프로그램을 사용하여 직선의 기울기를 구하며, 이 기울기는 평균 부피 유량으로 사용됩니다. 표면의 carboxy, YG 및 plain YG 특성을 가진 3 µM 농도의 형광 라텍스 비드 희석 용액을 사용하여 흐름을 시각화하고 표면 상호작용을 연구합니다. 먼저, 탈이온수 내 비드 농도가 0.01%solids가 되도록 비드 용액을 준비합니다.

용액을 상류 웰에 첨가하고 유동 모듈을 다시 연결합니다. 비드 유동을 한 시간 동안 관찰하며, MITx BCEB 0 1 3 U 단색 카메라가 장착된 Zeiss AIOt 25 형광 현미경을 사용하여 약 10분 간격으로 기록합니다. 형광 조명과 투과광 조명을 사용하여 개별 프레임을 빠르게 연속 캡처한 후, Image J와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 동영상으로 제작합니다.

비드와 구조물이 모두 보입니다. 투과광을 차단하면 밝은 형광 비드만 보입니다. 바닥 표면을 따라 증착되었거나 수집기에 부착된 정지 상태의 비드들이 장치 전체에서 확인됩니다.

Vibrio 종과 같이 살아있는 박테리아를 사용하는 실험을 위해, 비병원성 녹색 형광 단백질 발현 박테리아를 준비합니다. 먼저, 저온 냉동 보관된 스톡 배양액을 꺼냅니다. 멸균된 LB 성장 배지가 담긴 플라스크에 스톡 배양액을 접종합니다.

일회용 백금루프를 사용하여 플라스크를 흔들어주며 밤새 배양하여, 밀리리터당 약 10⁹ cells 농도의 정지기 배양액을 얻습니다. 응용 분야에 따라 박테리아의 초기 농도를 더 정확하게 정량할 수 있습니다. 멸균 버퍼가 채워진 미세유체 장치를 준비합니다.

그 다음 상류 웰의 멸균 액체를 비우고 20 µL의 박테리아 배양액으로 교체합니다. 피펫을 사용하여 박테리아를 디바이스에 접종하며, 이때 출력 웰에서 시린지로 부드럽게 흡입합니다. 배양 후, 군집 형성 후 각 웰의 형광 강도를 정량화하여 웰 내의 박테리아 양을 결정할 수 있습니다. 상류 입구 웰을 이전과 동일하게 비우고 25 ppt 염분 농도의 완충액으로 세척합니다.

주입기(syringe)를 사용하여 상류 웰(well)에 인공 해수를 완만하게 가압하여, 개별 유체 칩(flow cell)을 20 to 40 µL의 완충 용액으로 세척합니다. 이는 초기 세척 후 유체 칩 내 미세유체 토양 부분의 공극 부피보다 약 100 to 200배 많은 양입니다. 다공성 매질을 통한 박테리아의 장기 관류는 앞서 설명한 것과 동일하게 유동 모듈을 사용하여 수행합니다.

박테리아의 성장 및 이동에 대한 형광 및 백색광 이미지를 시간에 따라 측정할 수 있습니다. 본 실험에서는 Q imaging ink사의 color five cooled CCD 카메라를 사용하여 7일 동안 15~20시간마다 이미지를 촬영합니다. 당사의 장치는 또한 물리적 서식지 구조가 원생동물의 포식으로부터 박테리아에게 피난처를 제공하는 효과를 조사하는 데 사용될 수 있습니다.

미세다공성 유동 셀 내의 박테리아와, 장치 내에서 박테리아를 섭식하고 있는 훨씬 더 큰 섬모 원생동물 eulo의 모습이 보입니다. 미세유체 장치의 유체 흐름을 분석한 결과, 40 millimeter 압력수두에서 평균 유속은 0.71 microliters per minute인 것으로 나타났습니다. 압력수두를 60 millimeter로 높이자 유속은 1.04 microliters per minute로 비례하여 증가했습니다.

장치 내에서 다양한 표면 화학 특성을 가진 비드를 사용할 때, 카르복실화되지 않은 비드가 장치 표면에 더 많이 축적되는 것을 관찰하였습니다. 직경 6~10 mm의 비드는 더 작은 기공 입구에 포획될 가능성이 훨씬 높았습니다. 더 높은 정수압으로 인해 유속이 빨라지면 비드의 유지 및 포획이 감소하였으며, 이는 eco chipp 미세유체 장치에서 박테리아 성장을 분석할 때 예상되는 결과와 일치합니다.

장치의 서로 다른 구역에서 이미지 강도의 정성적 차이가 나타남을 알 수 있습니다. 형광 강도는 채널 내 미생물 생물량의 대리 지표로서 정량화될 수 있습니다. 진행 중인 실험에서, 저유량 조건의 지속적인 전단력은 이 이미지들에서 분명하게 나타나듯이 박테리아 응집 및 플록 형성을 유발하는 것으로 관찰됩니다. 지금까지 입자 크기 측정, 다공성 매질을 통한 충돌 수송 측정, 또는 미세 구조 서식지에서의 미생물 상호작용 조사를 위해 간단한 미세유체 장치를 제작하고 사용하는 방법을 살펴보았습니다.

유동 셀을 이용한 연구를 수행할 때, 비드의 부력과 콜로이드 및 수집기의 표면 화학적 특성을 고려하는 것이 중요합니다. 미세유체 영역으로 규모를 축소하면 표면 효과가 관찰되는 현상에 지배적인 영향을 미칠 수 있습니다. 실제로 거의 모든 물리적 구조를 미세유체 유동 셀 설계에 통합할 수 있습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.