다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 Microfluidic 시스템 : 미생물의 창

우리는 에코 칩 장치의 사용을 통해 물리적 구조와 압력 헤드를 일정하게 또는 다양하게 유지할 수 있음을 보여줍니다. VIO 박테리아 균주를 발현하는 비병원성 녹색 형광 단백질을 사용한 수송 실험을 통해 표면 화학, 유체 특성의 영향 또는 입자 또는 미생물의 특성을 체계적으로 조사하는 한편, 기본적인 수송 현상에 대한 서식지 구조, 흐름 조건 및 접종물 크기의 중요성을 설명합니다. 미세유체 소프트웨어는 숨겨진 세계에 대한 설득력 있는 관점을 제공합니다.

안녕하세요, 밴더빌트 대학교(Vanderbilt University)의 통합 바이오시스템 복원 교육을 위한 밴더빌트 연구소(Vanderbilt Institute for Integrative Biosystem Restoration Education)의 디미트리 마커(Dimitri Marker)입니다. 저는 Viro Laboratories의 연구 개발 엔지니어인 David Schafer입니다. 안녕하세요, 저는 코네티컷 대학교 환경 과학 및 공학 센터의 화학 재료 및 생체 분자 공학과의 레슬리 쇼(Leslie Sho)이며, 얼룩말(Zebra)의 다이콧(Dicot)입니다.

오늘 우리는 기초 환경 과학 및 공학 연구를 위한 모듈식 미세유체 서식지 어레이를 만드는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 산림 배지에서 미생물 수송 상호 작용에 대한 마이크로미터 규모의 구조가 미치는 영향을 조사합니다. 시작하겠습니다.

microfluidic 장치를 창조하는 첫걸음은 컴퓨터에 의하여 원조된 그림 또는 CAD 프로그램에 있는 장치의 2차원 배치를 당기기 위한 것입니다. 우리는 AutoCAD를 사용했지만 clue in 또는 coral draw와 같은 다른 그리기 프로그램도 사용할 수 있습니다. 이 소프트웨어를 통해 설계자는 거시적 필드 전체에 걸쳐 물리적 구조를 충실하게 복제할 수 있으며, 개별 기능은 5미크론 미만의 해상도로 정의됩니다.

CAD 도면에서 사진 마스크가 만들어집니다. 우리는 매사추세츠 북쪽 끝에 있는 Advanced Reproductions Corporation에서 제조한 크롬 마스크를 사용합니다. 미세유체 장치 생산의 다음 몇 단계는 마스터를 만들기 위해 클린룸에서 발생합니다.

깨끗한 실리콘 웨이퍼는 스핀 코더에서 포토레지스트로 코팅되어 있습니다. 먼저, 웨이퍼를 스핀 코더 플랫폼에 부착하고 SU 8 20 25 포토레지스트 몇 그램을 웨이퍼 중앙에 붓습니다. 그런 다음 웨이퍼는 500 RPM에서 초기 15 초 스프레드 사이클 동안 회전한 다음 35 초 동안 4, 000 RPM 얇은 코팅 사이클을 수행합니다.

회전 후 웨이퍼를 섭씨 95도에서 10분 동안 핫 플레이트에 올려 놓고 과도한 용매를 휘발시킵니다. 웨이퍼 준비의 마지막 단계는 에지 비드를 제거하는 것입니다. 이는 웨이퍼를 스핀 코더로 되돌려 놓고 코팅된 웨이퍼의 바깥쪽 가장자리에 SUA 에지 속도 제거제의 꾸준한 흐름을 적용함으로써 수행됩니다.

다음 단계는 자외선에 선택적으로 노출시켜 포토레지스트를 패턴화하는 것입니다. 먼저, 코팅된 웨이퍼를 평평한 표면에 놓고 크롬 마스크를 바로 위에 놓습니다. 루비리스 레드 마스킹 필름은 원하는 영역 밖으로 패턴이 전달되는 것을 차단합니다.

다음으로, 300 milli JUUL per cm square dose의 UV 광선이 스폿 운반 시스템을 사용하여 마스크를 통해 코팅된 웨이퍼로 전달됩니다. 마지막으로, 웨이퍼를 섭씨 95도에서 15분 동안 베이킹하여 포토레지스트의 빛에 노출된 영역을 가교하여 불용성으로 만듭니다. 주를 창조하는 있는 마지막 단계는 융기된 기복 구조를 남겨두는 감광저항의 non cross-linked 지구를 제거하기 위한 것입니다.

먼저, 웨이퍼는 스핀 코더로 한 번 더 반환되고 개발자 솔루션으로 덮입니다. 현상액을 코팅된 웨이퍼에 약 5분 동안 방치한 다음 스핀오프하여 웨이퍼에 명확하게 명백한 패턴을 생성합니다. 남아 있는 잔류물은 회전하는 웨이퍼에 이소프로필 알코올을 분출하여 씻어냅니다.

이 단계에서는 약 5초에서 10초 동안 2200RPM의 회전 속도를 사용합니다. 마지막으로, 완성 된 마스터는 질소 가스 스트림을 사용하여 건조되고 장치 주조에 필요할 때까지 접시에 보관됩니다. 우리는 실리콘 엘라스토머 폴리메틸 알란을 사용하여 미세유체 장치를 제작합니다.

먼저, 기본 재료와 경화제가 10:1 중량 비율로 플라스틱 컵에 전달됩니다. 다음으로, 혼합물을 혼합합니다. Andy는 생각이 많은 AR 100 컨디셔닝 믹서를 사용하여 거품을 일으켰습니다.

사이클이 완료되면 액체 PDMS를 마스터 위에 고르게 붓습니다. 그런 다음 마스터와 경화되지 않은 PDMS가 들어 있는 접시를 진공 챔버에 넣어 가스를 제거합니다. 폴리머 기포가 거의 즉시 나타납니다.

모든 거품이 사라질 때까지 가스 제거가 계속됩니다. 접시를 섭씨 65도의 레벨 오븐에 최소 4시간 동안 넣어 폴리머 가교를 완전히 허용합니다. 그런 다음 경화된 PDMS를 재사용 가능한 마스터에서 조심스럽게 제거합니다.

처음 4개의 모서리는 메스를 사용하여 패터닝된 영역 바깥쪽으로 잘 절단되고, 장치는 핀셋을 사용하여 패터닝된 웨이퍼로부터 박리됩니다. 원하는 경우 가위를 사용하여 장치의 가장자리를 트리밍할 수 있습니다. 장치의 하위 섹션은 성형된 PDMS 장치의 나머지 부분과 분리될 수 있습니다.

다음으로, PDMS를 통해 액세스 구멍을 뚫습니다. 우리는 작은 아버에 장착된 여러 가지 크기로 시판되는 생검 펀치를 사용합니다. 프레스 PDMS 코어는 집게를 사용하여 제거됩니다.

마지막으로, 트리밍 및 펀칭된 장치는 이소프로필 알코올과 폼 팁 폴리프로필렌 면봉을 사용하여 세척합니다. 장치는 질소를 사용하여 건조된 다음 오븐에 넣어 모든 용매 흔적을 제거합니다. microfluidic 장치를 만들기에 있는 마지막 단계는 유리제 활주 기질에 PDMS를 접착시키고, 그 후에 액체로 첫째로 채우는 것입니다.

PDMS 장치와 유리 슬라이드는 접합 표면이 플라즈마 세정기 안으로 최대 간격으로 배치됩니다. 이 실험에서는 PDC 32G 헤릭 플라즈마 클리너를 사용합니다. 진공이 설정되고 블루 바이올렛 플라즈마가 보이면 타이머가 30초로 설정됩니다.

플라즈마 발생기가 차단되었습니다. 챔버에 다시 압력이 가해지고, 챔버와 접합 표면에서 가져온 장치와 슬라이더가 접촉하게 됩니다. 챔버에서 활성화된 구성 요소를 제거할 때 표면이 활성화된 상태로 유지되도록 빠르게 움직이는 것이 중요합니다.

부드러운 압력은 좋은 접착을 보장하는 데 도움이 됩니다. 접착의 품질은 집게로 모서리를 당겨 확인합니다. 그런 다음 친수성 내부는 완충 매체와 같은 수용액으로 쉽게 채워지거나 탈이온화될 수 있습니다.

수액은 각 소스 웰과 해당 미세다공성 플로우 셀을 통해 투여됩니다. 모든 챔버가 가득 차면 경화된 PDMS의 얇은 층을 전체 장치에 배치하여 증발을 지연시키고 무균 상태를 유지하는 데 도움을 줍니다. 장치에서 압력 구동 흐름을 보정하려면 마이크로 구조의 플로우 셀에 탈이온수를 예압하고 유체 전달 인터페이스 및 멸균 밀봉 역할을 하는 유량 모듈을 장치 상단에 배치합니다.

이 유량 모듈은 단독으로 사용하거나 플라스틱 주사기와 같은 저장소가 포함된 외부 유체에 연결할 수 있습니다. 플라스틱 주사기 또는 흐름 모듈과 같은 액체가 포함된 저장소를 업스트림 입구에 연결합니다. 저장소의 유체 높이를 하류 높이보다 높게 잘 유지하십시오.

음, 업스트림 저장소와 각 다운스트림 출구 우물 사이의 높이 차이는 장치를 통한 유속을 정량화하기 위해 압력 구동 흐름의 원동력을 정의합니다. 뭉툭한 끝이 있는 25 게이지 바늘은 일정한 간격으로 다운스트림 우물에서 샘플을 수집하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 15분에서 20분마다 샘플을 채취하여 샘플 사이의 실제 경과 시간을 주의 깊게 기록합니다.

주사기의 무게는 분석 저울에서 샘플링 전과 후에 기록됩니다. 집계 부피 대 집계 시간은 평균 질량 유량과 동일한 기울기로 차트화됩니다. 입구 저장소와 출구 저장소의 단면이 크면 유체가 장치를 통해 이동할 때 Y축의 샘플링 부피와 X축의 샘플 시간을 플롯할 때 유속이 크게 변하는 것을 방지할 수 있습니다.

선의 기울기를 얻기 위해 Excel과 같은 간단한 그래프 프로그램에서 기울기는 평균 체적 유량에 사용됩니다. 카르복시, YG 및 일반 YG 표면이 있는 3개의 마이크로몰 형광 라텍스 비드의 희석 용액을 사용하여 흐름을 시각화하고 표면 상호 작용을 연구합니다. 먼저, 비드 용액을 0.01% 고형물 농도의 탈이온수에 준비합니다.

용액이 업스트림 유정에 추가되고 흐름 모듈이 zu에 다시 연결됩니다. 플로우 비드 흐름은 1시간 동안 시각화되고 MITx BCEB 0 1 3 U 흑백 카메라가 장착된 Zeiss AIOt 25 형광 현미경에서 약 10분마다 기록됩니다. 개별 프레임은 빠르게 연속적으로 캡처되고 형광 조명 및 투과광 조명이 있는 Image J와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 동영상으로 조립됩니다.

구슬과 구조가 모두 보입니다. 투과광이 차단되면 밝은 형광 구슬만 보입니다. 바닥 표면을 따라 증착되거나 수집기에 부착된 고정 비드는 장치 전체에서 분명합니다.

살아있는 박테리아를 사용하는 실험을 위해 Vibrio 종과 같은 배양액, 박테리아를 발현하는 비병원성 녹색 형광 단백질이 준비됩니다. 첫째, 스톡 문화가 딥 프리 스토리지에서 제거됩니다. 멸균 LB 성장 배지가 있는 플라스크에 스톡 배양액이 접종됩니다.

일회용 접종 루프를 사용하여 플라스크를 밤새 진탕하여 약 10에서 밀리리터당 9번째 세포의 농도를 가진 고정상 배양을 생성합니다. 응용 분야에 따라 박테리아의 초기 농도를 보다 정확하게 정량화할 수 있습니다. 멸균 완충액으로 채워진 미세유체 장치가 준비됩니다.

그런 다음 상류 우물의 멸균 액체를 비우고 20마이크로리터의 박테리아 배양물로 교체합니다. 피펫을 사용하여 출력 웰에 주사기를 사용한 부드러운 흡입을 사용하여 박테리아를 장치에 파종합니다.배양 후, 웰 내 박테리아의 양은 집락화 후 각 웰의 형광 강도를 정량화하여 결정할 수 있습니다. 상류 입구 우물은 이전과 같이 비워지고 25ppm 염으로 플러시된 버퍼로 교체됩니다.

인공 해수 부드러운 압력이 주사기로 상류 우물에 가해지며, 20-40 마이크로 리터의 완충 용액으로 개별 플로우 셀이 플러싱됩니다. 이는 초기 세척 후 플로우 셀의 미세유체 토양 부분의 불량한 부피의 약 100-200배입니다. 다공성 매체를 통한 박테리아의 장기 관류는 앞에서 보여진 것과 정확히 같이 flow module을 사용하여 이루어집니다.

박테리아의 성장과 이동에 대한 형광등 및 백색광 이미지는 시간이 지남에 따라 측정할 수 있습니다. 이 실험에서는 Q 이미징 잉크의 컬러 5 냉각 CCD 카메라를 사용하여 7일 동안 15-20시간마다 이미지를 촬영합니다. 우리의 장치는 또한 원시 동물에 의한 포식으로부터 박테리아 피난처를 제공하는 물리적 서식지 구조의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 볼.

다음은 미세 다공성 플로우 셀의 박테리아이며, 장치에서 볼 수 있는 훨씬 더 큰 섬모 원생동물 eolo가 박테리아를 뜯어먹습니다. 미세유체 장치의 유체 흐름을 분석하면 평균 유속이 40mm 압력 헤드의 경우 분당 0.71마이크로리터임을 알 수 있습니다. 압력 헤드를 60mm로 증가시킴으로써 유량은 분당 1.04마이크로리터로 비례하여 증가했습니다.

장치에서 다양한 표면 화학 물질을 가진 비드를 사용할 때 장치 표면에서 un carboxylated beads가 더 많이 축적되는 것을 관찰합니다. 직경이 6-10mm인 구슬은 더 작은 기공 구멍에 동반될 가능성이 훨씬 더 높았습니다. 더 큰 정수압으로 인한 더 빠른 유속으로 인해 비드 보유 및 동반이 감소했으며, 이는 eco chipp 미세유체 장치의 박테리아 성장을 분석할 것으로 예상됩니다.

우리는 장치의 여러 부문에서 이미지 강도의 질적 차이에 주목합니다. 형광 강도는 채널 내 미생물 바이오매스에 대한 대용물로 정량화할 수 있습니다. 진행 중인 실험에서 우리는 낮은 유동 조건의 지속적인 전단력이 이러한 이미지에서 명백한 것처럼 박테리아 응집 및 무리 형성을 유발하는 것으로 보이는 것을 관찰했으며, 방금 간단한 미세유체 장치를 만들고 사용하여 입자 규모를 측정하거나, 다공성 매체를 통한 충돌 수송을 하거나, 미시 구조 서식지에서 미생물 상호 작용을 조사하는 방법을 보여주었습니다.

플로우 셀(flow cell)을 사용하여 연구를 수행할 때는 비드의 부력과 콜로이드 및 수집기의 표면 화학적 성질을 고려하는 것이 중요합니다. 미세유체 체제로 축소할 때 표면 효과가 관찰된 현상을 지배할 수 있습니다. 실질적으로 모든 물리적 구조를 미세유체 플로우 셀 설계에 통합할 수 있습니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.