Name: 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 학습하세요 붉은털원숭이 PBMC 자극 및 다색 유동세포계측법을 통한 T세포 면역 반응 분석 방법을. 이 기법은 HIV/AIDS 백신 연구에 필수적인 세포 면역 프로파일링을 제공합니다.

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짧은 꼬리 원숭이 혈액과 PBMC 샘플 박사 프라 모드 Nehete 부부 바티 Nehete,이 작품은 부분적으로 NIH 부여 AI 46,969의 자금에 의해 지원되었고, 모든 세포 배양 매체는 중앙 미디어 연구소에 의해 생산되었다, NIH 부여 CA에 의해 자금 지원됩니다 16672.

1) 셀 준비와 antigenic의 자극, 2) 표면 마커 얼룩, 3) 세포 시토킨 얼룩과 4) 유동세포계측법 : 총뿐만 아니라 T 세포의 메모리 하위 집합의 세부 phenotypic 및 기능 분석에 대한 절차는 네 부분으로 나눌 수 분석합니다. 1. 세포 준비와 antigenic의 자극 <ol><li> 두 신선하게 격리뿐만 아니라 cryo 보존된 말초혈 mononuclear 세포 (PBMC)가이 프로토콜에 사용되었습니다. PBMC는 Ficoll - Hypaque (Histopaquen - 1077, 시그마 - 알드리치, ST. 루이스, MO)를 사용하여 밀도 기울기 침강에 의해 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 heparinized 또는 citrated 정맥의 혈액 샘플로부터 격리되었다. PBMC의 Aliquots는 90% FCS에 냉동 저장 및 액체 질소의 10 % DMSO되었습니다. </li><li> cryo - 보존된 PBMC를 사용하는 경우, 냉동 PBMC의 유리병은 액체 질소에서 제거되었으며 신속하게 냉동 매체와를 제거하는 RPMI - 1640 (HyClone 실험실, 로건, UT)로 씻어, 부드럽게 혼합, 37 C의 물을 욕조에 해동 전체 미디어 다시 정지 [CM, 10 %로 RPMI - 1640 보충 열 inactivated FCS (HyClone 연구소), 2mM L - 글루타민 (시그마 - 알드리치), 100U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Invitrogen), 그리고 6 교양 - 잘 조직 배양 플레이트 37 ° 하룻밤 humidified 5 % CO 2 분위기에서 C. 다음날 아침은 생균 카운트는 trypan - 청색 색소 배제 방식에 의해 결정 및 CM에서 다시 정지. </li><li> 세포 시토킨 분석하여 다음 불특정 대 항원에 특정한 자극에 대해 다르​​게 대우했다 : (A) phorbol 12 - myristate와 비 특정 자극에 대한 13 아세테이트 (PMA)와 Ionomycin (I) (시그마 - 알드리치, 성 루이, MO), 0.1ml의 볼륨에있는 세포의 aliquots (1.0 X 10 6 세포 / 음)은 96 잘 조직 배양 플레이트 (BD Biosciences, 프랭클린 호수, 뉴저지)의 개별 우물에서 도금했다. PMA와 Ionomycin는 각각 50ng/ml과 500ng/ml의 최종 농도에서 사용되었습니다. 96 - 웰 조직 배양 플레이트에 대한 최종 합계 볼륨 0.2ml/well입니다 (b)는 항원 특정 자극 들어, 볼륨 1.0 ML 1.0 X 10 6 세포는 24 잘 조직 문화 판의 개별 웰스 (BD Biosciences에서 도금했다 이전 수정 9에서 설명하는 것처럼 우물은 사전 처리되었습니다 프랭클린 호수, NJ). 간단히, 24 잘 조직 문화 플레이트는 4 50mM 트리스 솔루션 2.5 μg / ML / 잘 염소 안티 - 마우스 IgG (H + L) (Kierkegaard 및 페리 연구소, 게이 더 스버그, MD) (PH 8.6)로 코팅했다 ° C 하룻밤. 접시가 멸균 PBS와 공동 stimulatory mAb CD49d, 클론 9F10 (BD Biosciences, 산호세, CA)를 두 번 씻은되었습니다 다음날 아침이 37에 한 시간 동안 잠복기 10 μg / ML에 추가 / 잘 따라했다 ° C.가 부화 후, 접시는 실온에서 멸균 PBS로 두 번 씻어했다. 여섯 HIV 봉투 펩티드 8 칵테일을 포함하여 관심이 항원은 (각 펩타이드의 10μg/ml의 최종 농도에 추가되었습니다. 혼자 CM의 세포로 추가 우물은 대조군으로 준비되었습니다. 24의 각 잘에 대한 최종 합계 볼륨 - 잘 조직 배양 플레이트 1.0 ML되었습니다. </li><li> 세포는 37 6 시간 동안 교양되었습니다 ° C humidified 5 % CO 2 분위기 인치 Brefeldin이 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO) 자극의 마지막 4.5 시간 10μg/ml의 문화에 추가되었습니다. 이후, 전지 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브로 전송과 함께 세탁했다 추운 (4 ° C) 유동 세척 버퍼 (Dulbecco의 PBS (DPBS, CA 2 / MG 2 무료, 함께 생활 기술, 락빌, MD) 2퍼센트 열 inactivated FCS), 그리고 다양한 형광 라벨 항체와 얼룩을위한 처리. </li></ol> 2. 얼룩 Immunofluorescence 표면 마커 <ol><li> 자극 세포 처음 4 1ul 죽은 / 라이브 고칠수 아쿠아 형광 반응 염료 물들일되었습니다 ° 30 분 동안 어둠 속에 C, 차가운 흐름 세척 버퍼와 한번 세탁. </li><li> 그런 다음, 다음 적절하게 titrated 형광 - 표시 단클론 항체가 세포에 추가되었습니다 방지 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy7 (SP34 - 2), 안티 - CD8 Alexa700 (RPA - T8), 안티 CD28 PerCP - cy5.5 (L293) , 안티 CD95 APC (DX2) 및 안티 CD4 퍼시픽 블루 (OKT4), (샌디에고, CA) eBioscience에서 CD4 제외 BD Biosciences (프랭클린 호수, NJ)에서, 퍼시픽 블루 (OKT4). 세포는 어두운 4 30 분 ° C에 대한 incubated되었습니다. </li><li> 각 실험에 대한 보상 컨트롤과 형광 빼기 1 (FMO) 모두 10,11가 활용되었다 제어합니다. 보정 컨트롤은 다른 메이커에 얼룩 각의 다른 일의 coeffecients을 결정하기 위해 이용되었다. 보상 컨트롤, 원숭이 중 하나에서 세포 suspensions를 포함하는 튜브의 전체 집합은 단일 색상의 얼룩으로 개별적으로 형광 복합 mAb 물들일되었습니다. FMO는 모든 시약하지만 관심 중 하나를 포함하는 여러 가지 빛깔의 얼룩의 조합이며 긍정 사이의 경계를 결정하는 데 사용됩니다자동 형광 레벨 및 데이터를 복제하여 ND 부정적인 인구는 완전히 스테인드 샘플에 존재. </li><li> 스테인드 세포는 다음 차가운 흐름 세척 버퍼로 세탁하고, 고정 / permeabilization 솔루션 (BD Biosciences, 산호세, CA)에서 해결되었습니다 (이 단계에서 세포가 4 밤새 저장할 수 있습니다 ° C를 어둠 속에서) 적어도 10 분 동안 세포내 시토킨 얼룩을 수행하기 전에. </li></ol> 3. 세포내 시토킨 염색법 <ol><li> 고정 전지는 유동 세척 버퍼로 씻어되었고, 다음 펌 / (BD Biosciences, 산호세, CA) 버퍼를 씻으는 제조 업체의 지시에 따라 추가되었습니다. 간단히, 세포는 1X 펌 / 4 10 분 버퍼를 씻으 ° 어둠 속에 C의 0.1ml에 incubated했다. </li><li> 이에 따라 전지와 incubated 있던 적절 titrated FITC - 라벨 방지 IFN - γ (B27)와 PE - 라벨 4 60 분 반 IL - 2 (MQ1 - 17H12) · 어둠 속에 C. </li><li> 그러면 세포는 permeabilization 솔루션과 두 번 더 씻어되었습니다 </li><li> 최종 세척 후, 세포가 DPBS의 1 % paraformaldehyde에 다시 정지하고 24 시간 이내에 유동세포계측법 분석의 대상이되었다. </li></ol> 4. 유동세포계측법 분석 <ol><li> 또는 청록색 ADP (Dako, 카핀테리아, CA), 스테인드 세포는 LSR II 흐름 cytometer (산호세, CA BD Biosciences)에 인수했다. 외과 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (트리 스타, 애쉬 랜드, OR)를 사용하여 분석되었다. </li><li> 그림. 1 대표적인 동물에서 다른 T 세포의 하위 집합의 분석 활용 게이팅 구조를 보여줍니다. lymphocytes 앞으로 분산형 (FSC) 대 사이드 분산형 (SSC)를 통해 첫번째 문이 있었고, 다음 라이브 lymphocytes는 SSC와 아쿠아 부정적인 인구를 기반으로 식별되었습니다. 인 경우에는 3 번 CD 내의 T 세포는 다음 적극적으로 CD4의 감지 + CD8 - (CD4 + T 세포)에 의해 다음 인 경우에는 3 번 CD에 들어 표현으로 식별 및 CD4 - CD8 + (CD8 + T 세포)되었습니다 인구 + T 세포 인구. CD4 +와 CD8 + T 세포는 더 이상 순진 (TN, CD28 + CD95 -), 중앙 메모리 (TCM, CD28 + CD95 +) 및 효과기 메모리 (TEM, CD28 - CD95 +) 세포처럼 CD28과 CD95 표현에 근거하여 서로 다른 하위 집합으로 구분되었다 문학 5, 10에 설명되어. </li><li> 그림. CD4 +와 CD8 + T 세포의 서로 다른 하위 집합은 PMA와 ionomycin (PMA + I)과 자극에 대한 응답으로 시토킨 생산의 관점에서 기능적 용량 (INF - γ 및 / 또는 IL - 2)에 대한 평가가 얼마나이 표시됩니다. </li></ol> 5. 대표 외과 데이터 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 PBMC 구성은 외과 분석을 사용하여 결정되었다. 그림 1은 대표적인 동물에서 다른 T 세포의 하위 집합의 분석 활용 게이팅 구조를 보여줍니다. lymphocytes 앞으로 분산형 (FSC) 대 사이드 분산형 (SSC)를 통해 첫번째 문이 있었고, 다음 라이브 lymphocytes는 SSC와 아쿠아 부정적인 인구를 기반으로 식별되었습니다. T 세포는 다음 인 경우에는 3 번 CD에 들어 표현식에 의해 확인되었습니다. 인 경우에는 3 번 CD에 들어 내에서 CD4 + CD8 - (CD4 + T 세포)와 CD4 - CD8 + (CD8 + T 세포) 인구는 + T 세포 인구도 결정됩니다. 그림 2에 표시된 CD4 +와 CD8 + T 세포는 더 이상 순진 (TN, CD28 + CD95 -), 중앙 메모리 (TCM, CD28 + CD95 +) 및 효과기 메모리 (TEM로 CD28과 CD95 표현에 근거하여 서로 다른 하위 집합으로 구분되었다 CD28 - CD95 +) 세포. 그림 2A는 INF - γ를 보여줍 unstimulated 및 PMA / ionomycin 자극 CD4 + T 세포, 그리고 하위 집합, 그리고 그림 2B에서 IL - 2 생산 INF - γ와 unstimulated 및 PMA / ionomycin가 CD8을 자극 + T 세포에서 IL - 2 생산을 보여줍니다, 그리고 집합 뚜렷한 시토킨 프로파일 각 하위 집합에 자극에 의​​해 elicited합니다. <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0"> 그림 1. 게이팅 전략은 붉은 털원숭이 macqaues의 PBMC 구성의 흐름 cytometric 분석에 사용. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2atmb.jpg" alt="그림 2A" border="0"> <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2btmb.jpg" alt="그림 2B" border="0"> 그림 2. (A) 총 CD4 + T 세포와 하위 집합.의 시토킨 생산 프로파일 총 CD8 + T 세포와 하위 집합의 (B) 시토킨 생산 프로파일. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2a.jpg">여기를 클릭하십시오</a> 큰 2A의 버전을보고 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2b.jpg">여기 또는</a> 그림 2B의 큰 버전에 대한.

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</ol>

솔루션 및 버퍼 <ul><li> Ficoll - Hypaque (Histopaquen - 1077, 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO) </li><li> RPMI - 1640 배지 (HyClone 실험실, 로건, UT) </li><li> 태아 소 혈청 (FBS), (HyClone 실험실, 로건, UT) </li><li> L - 글루타민 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO) </li><li> 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 칼스 배드, CA) </li><li> Trypan 파란색 시약 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO) </li><li> 50 MM 트리스, PH 8.6, 4 필터링과 가게 ° C </li><li> Dulbecco의 PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free, 생명 기술, 락빌, MD) </li><li> 흐름 세척 버퍼 : 2% FBS와 DPBS 보완, 4 저장 ° C </li><li> BD Cytofix / Cytoperm 고정 / Permeabilization 솔루션 키트 (BD Biosciences, 산호세, CA) </li></ul> 활성화 요원 <ul><li> Phorbol 12 - myristate 13 - 아세테이트 (PMA) (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO) </li><li> Ionomycin (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO) </li><li> Costimulatory mAb CD49d, 클론 9F10 (BD Biosciences, 산호세, CA) </li><li> 친화력 정화 항체 F (AB) 염소 방지 마우스 IgG (H + L) 2 조각 (Kierkegaard 및 페리 연구소, 게이 더 스버그, MD) </li><li> 특정 인증 요원들은 펩타이드 수영장, 단일 펩티드, 또는 전체 단백질을 포함시킬 수 </li></ul> 시토킨 분비 억제제 <ul><li> Brefedin A (BFA, 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO) </li><li> 잠돌군 Zz 플러그는 (; 산호세, CA BD Biosciences) 또는 사용할 수 있습니다 </li></ul> 항체 <ul><li> 죽은 / 라이브 고칠수 아쿠아 형광 얼룩 키트 (Invitrogen, 칼스 배드, CA) </li><li> 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy7 (SP34 - 2), (BD Biosciences, 산호세, CA) </li><li> CD4 태평양 블루 (OKT4), (eBiosciences (샌디에고, CA) </li><li> CD8 Alexa700 (RPA - T8), (BD Biosciences, 산호세, CA) </li><li> CD28 PerCP - cy5.5 (L293), (BD Biosciences, 산호세, CA) </li><li> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, 산호세, CA) </li><li> IFN - FITC (B27), (BD Biosciences, 산호세, CA) </li><li> IL - 2 PE (MQ1 - 17H12), (BD Biosciences, 산호세, CA) </li></ul>

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이 모델은 현재 백신 및 치료제의 개발을위한 최상의 사용할 수있는 pathogenesis을 이해와 관련하여 HIV - AIDS에 대한 모델뿐 아니라<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. 여기, 우리는 세포 면역 반응에 대한 자세한 phenotypic 및 기능 분석, CD4 세포에 의해 구체적으로 시토킨 생산 +와 CD8 + T 세포뿐만 아니라 개별 메모리 하위 집합에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 모두 CD4에서 인터페론 감마의 생산에 대한 정확한 양적 및 질적 조치 (INF -)와 인터루킨 (IL) -2를 취득 +와 CD8 + T PMA 플러스 ionomycin (PMA + I)를 자극 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이 PBMC에서 세포. 시토킨 프로파일 메모리 세포의 서로 다른 하위 집합에서 다른되었습니다. 또한,이 프로토콜은 항원 특정 CD4의도 작은 분수를 입증하기 위해 우리에게 감도를 제공하는 +와 CD8 + 우리 연구실에서 개발된 HIV 봉투 펩타이드 칵테일 백신과 예방 접종을 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이에서 PBMC 샘플 내의 T 세포 집합. 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법 기술 정확하게 T 세포의 다른 인구를 식별하는 강력한 도구입니다<sup&gt; 4,5</sup&gt; 시토킨 생산 기능이있는<sup&gt; 6</sup&gt; 불특정 또는 특정 항원 자극에 따라<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

우리는 총뿐만 아니라 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 CD4 +와 CD8 + T 세포, HIV / AIDS 백신 연구를위한 이상적인 모델의 메모리 하위 집합에 대한 자세한 phenotypic와 기능 특성에 대한 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 유틸리티를 보여줍니다.

붉은털원숭이 모델은 현재 병인론의 이해뿐만 아니라 개발 측면에서도 HIV-AIDS 연구에 사용할 수 있는 최선의 모델입니다...

본 영상은 말초혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cells, pbmc)를 자극하고 염색하는 절차를 보여줍니다. 다색 유세포 분석을 위해, 전혈에서 분리한 pbmc를 조직 배양 플레이트에 분주합니다. 세포에 화학적 또는 생물학적 자극을 주어 면역 반응을 유도합니다.자극 후, 발현된 표면 마커를 기반으로 세포 유형을 식별하기 위해 항체 칵테일을 첨가합니다. 그 다음 세포를 투과화하고 다른 항체 칵테일을 첨가하여 세포 내 사이토카인의 발현을 검출하며, 이후 FACS로 분석하여 PBMC의 특정 하위 집단에 대한 사이토카인 프로파일을 결정합니다. 안녕하세요, 저는 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암센터 면역학과의 Dr. Jagan SAS 연구실 소속 에이미 코트니(Amy Courtney)입니다.안녕하세요, 연구실의 홍입니다. 오늘은 T세포 반응의 다중 사이토메트리 분석 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 붉은털원숭이의 세포성 면역 반응을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. Trypan Blue 염색 제외법을 이용하여 Reuss Maca에서 추출한 PBMC의 생존 세포 수를 측정하기 위해 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 이 프로토콜을 시작하십시오. 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 작업을 진행하십시오.비특이적 자극을 위해 세포를 완전 배지에 1mL당 1천만 개의 세포 농도로 부유시킨 후, 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 세포 부유액 100µL를 분주합니다. 그다음, PMA와 CIN이 포함된 배지 100µL를 첨가하여 최종 부피를 0.2mL로 맞추며, 이때 PMA의 최종 농도는 50ng/mL, CIN의 최종 농도는 500ng/mL가 되도록 합니다. 음성 대조군 웰에는 완전 배지만 100µL를 각각 첨가합니다. 세포를 37°C, 습윤화된 5% CO2 분위기에서 1.5시간 동안 배양합니다.최종 농도가 10 µg/mL가 되도록 felden A를 배양액에 첨가하고 4.5시간 동안 추가로 배양합니다. 면역 염색 시 가시성을 높이기 위해 gold G 장치 내의 trapp 사이토카인에 felden A를 첨가합니다. 자극 후 원심분리하여 배지를 제거한 다음, 200 µL의 차가운 flow wash buffer를 첨가하여 세척하고 낮은 속도로 원심분리합니다. 이 세척 과정을 반복한 후, 50 µL의 flow wash buffer에 다시 현탁합니다.이제 재현탁된 세포가 담긴 각 웰에 표면 마커 발현을 확인하기 위한 염색을 진행할 준비가 되었습니다. 제조사의 지침에 따라 준비한 live dead fixable aqua 형광 반응성 염료 1 µL를 첨가합니다. 세포를 4 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다.마이크로 튜브에 FACS 분석에 사용할 염색 용액을 준비합니다. 먼저, 다음의 항목들을 적절히 포함하여 염색 칵테일을 준비하십시오. 적정된 형광 표지 단클론 항체(anti-CD3 PE SCI 7, anti-CD8 Alexa 700, anti-CD28 per CCP SCI 5.5, anti-CD95 APC 및 anti-CD4 Pacific Blue)와 Flow Wash Buffer입니다.다음으로, 각 형광 접합 항체를 단색 염색으로 개별 튜브에 준비하여 다른 검출기로 유입되는 각 개별 염색의 스필오버 계수를 결정하는 데 사용할 보정 컨트롤을 준비합니다. 마지막으로, 관심 있는 시약을 제외한 모든 시약을 조합하여 형광 마이너스 원(Fluorescence Minus One, FMO) 염색을 준비합니다. 이는 완전 염색된 샘플에 존재하는 데이터와 자가형광 수준을 대조함으로써 양성 집단과 음성 집단 사이의 경계를 결정하는 데 사용됩니다.세포를 live dead 염색액으로 배양한 후, 차가운 flow wash buffer로 한 번 세척하여 과잉 염료를 제거하고 wash buffer를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 준비된 염색 용액을 첨가합니다. 세포를 4 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다.과량의 항체를 제거하기 위해 염색된 세포를 차가운 flow wash buffer로 세척합니다. 그 다음 BD fixation permeation solution 100 µL를 첨가하여 최소 10분 동안 반응시킵니다. 세포를 사용할 때까지 4 °C의 암소에 최대 24시간 동안 보관하거나, 세포 내 사이토카인을 염색하기 위해 다음 단계로 진행합니다.먼저 1X perm. Wash buffer 100 µL로 세포를 투과화하고, 세포를 배양하는 동안 4 °C의 암소에서 10분 동안 배양하십시오. 이전과 같이 1X perm wash buffer를 사용하여 염색 항체, 보정 대조군(compensation controls) 및 FMO 대조군을 준비하십시오.세포를 10분 동안 배양한 후, 원심분리하여 1x perm wash buffer를 제거합니다. 적절한 염색 항체를 첨가합니다. 그 다음, 세포와 항체를 4°C의 암소에서 60분 동안 배양합니다.투과액으로 세포를 2회 세척합니다. 마지막 세척 후, 세포를 고정하기 위해 DPBS 내 1% Paraformaldehyde에 다시 현탁합니다. 세포를 사용 전까지 최대 24시간 동안 4°C의 암소에 보관하십시오.세포 염색이 완료되면, LSR II 유세포 분석기 또는 Cytek DP 유세포 분석기를 사용하여 FACS를 수행합니다. 그 후 FlowJo 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. Rhesus macaque의 PBMC 구성은 FACS 분석을 통해 결정되었습니다.이 그림은 대표 동물로부터 얻은 서로 다른 T 세포 하위 집단의 분석에 사용된 게이팅 도식을 보여줍니다. 림프구는 먼저 전방 산란광 FSC 대 측방 산란광 SSC를 통해 게이팅 되었으며, 이후 SSC 및 AQUA 음성 집단을 기반으로 살아있는 림프구를 식별하였습니다. 이어서 CD3 발현을 통해 T 세포를 식별하였으며, CD3 양성 T 세포 집단 내에서 CD4 양성, CD8 음성 및 CD4 음성, CD8 양성 집단 또한 결정하였습니다.CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포는 CD28 및 CD95 발현을 기준으로 나이브 세포, 중앙 기억 세포 및 작동 기억 세포의 서로 다른 하위 집단으로 추가 구분되었습니다. 이 그림은 자극하지 않은 상태와 pma, CIN으로 자극한 CD4 양성 T 세포 및 그 하위 집단에서의 인터페론 감마와 IL-2 생성을 보여줍니다.자극에 의해 유도된 뚜렷한 사이토카인 프로파일에 주목하십시오. 각 하위 집합에서 PBMC의 다중 유세포 분석을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다.이 절차를 수행할 때, 단색 보정 대조군과 형광 마이너스 원(fluorescent minus one) 대조군을 모두 설정하는 것이 중요합니다. 유세포 분석 데이터를 적절하게 분석하기 위해서는 이 두 가지 대조군이 모두 필요합니다. 보정 대조군 선택에 관한 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.또한, 형광 표지 항체를 사용할 때는 빛 노출로부터 시료를 보호하기 위해 샘플을 가려주는 것이 중요하다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

multicolor-flow-cytometry-analyses-cellular-immune-response-rhesus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포, γδ T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 단핵구를 식별하기 위해 두 개의 형광 색소를 사용하는 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다. 표면 마커에 대해 형광 색소 접합 항체로 세포를 배양하면 최적의 유세포 분석 게이팅 전략을 사용하여 세포 subset을 식별할 수 있습니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 면역 세포 subset을 식별하기 위한 유세포 분석 분석

면역 능력이 쥐의 흉강에 II-45 악성 세포의 이식에 의한 흉막 악성 중피종의 소성을 쥐 모델의 생성이 제공됩니다. 유세포 방법도 기재되어 25 ㎕의 혈액 샘플로부터이 동물 일곱 면역 세포 서브 세트를 분석한다.

II-45 동계 쥐의 Mesothelioma 모델에서 소성을 주입 및 주변 면역 세포 모니터링

여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 + 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

여기, 분리와 CD4의 특성에 대 한 프로토콜+ T-세포 인간 주변 혈액에서 하위 집합 설명. CD4 정화+ T-세포 cytometry T follicular 도우미 셀 하위 집합의 비율을 결정 하 여 분석 된다.

CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

이 연구는 cytometry 반응성 산소 종 (선생님) 생산은 FcγR의 활성화에서 결과 검색의 사용을 보여줍니다. 항균 및 산화 환 원 신호 면역성이 있는 복합물, opsonized 미생물, 또는 직접 FcγR cross-linking에 식 세포의 기능을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정

여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.

골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.

Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

학습하세요 붉은털원숭이 PBMC 자극 및 다색 유동세포계측법을 통한 T세포 면역 반응 분석 방법을. 이 기법은 HIV/AIDS 백신 연구에 필수적인 세포 면역 프로파일링을 제공합니다.

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

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