붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

이 비디오는 말초 혈액 단핵 세포 또는 pbmc를 자극하고 염색하는 절차를 보여줍니다. 다색 유세포 분석을 위해 전혈에서 분리한 pbmc의 Alec Watts를 조직 배양 플레이트에 넣습니다. 세포는 면역 반응을 일으키기 위해 화학적, 생물학적으로 자극을 받습니다.

자극 후, 발현된 표면 마커를 기반으로 세포 유형을 식별하기 위해 항체 칵테일을 추가합니다. 그런 다음 세포를 투과하고 다른 항체 칵테일을 첨가하여 세포 내 사이토카인의 발현을 검출하고, 그런 다음 세포를 사실에 의해 분석하여 pbmc의 특정 하위 집합에 대한 사이토카인 프로파일을 결정합니다. 안녕하세요, 저는 텍사스 대학교 MB 앤더슨 암 센터 면역학과 Dr.Jagan SAS 연구실의 Amy Courtney입니다.

안녕하세요, 저도 연구실에서 온 홍입니다. 오늘은 T 세포 반응에 대한 다중 세포 분석 분석을 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 Reus Maca의 세포 면역 반응을 연구합니다.

시작하겠습니다. Trian Blue Dye 배제 방법에 의해 Reuss Maca에서 pbmc의 생존 가능한 세포 수를 결정하기 위해 혈액 세포 분석기를 사용하여 이 프로토콜을 시작합니다. 층류 후드 reus에서 작업.

100마이크로리터의 세포 현탁액에서 비특이적 자극을 위해 밀리리터당 1,000만 개의 세포 농도로 완전한 배지에서 세포를 96웰 조직 배양 플레이트의 각 웰로 현탁시킵니다. 그런 다음 PMA 및 CIN을 포함하는 배지 100마이크로리터를 추가하여 총 부피를 0.2밀리리터로 만들고 최종 농도는 PMA 밀리리터당 50나노그램, 음성 대조군 웰의 경우 밀리리터 CIN당 500나노그램을 추가하고 각각에 완전한 배지 단독 100마이크로리터를 추가합니다. 1.5 시간 후에 가습 된 5 % 이산화탄소 대기에서 섭씨 37 도의 세포를 잘 배양합니다.

밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도에서 배양에 Felden A를 넣고 추가로 4.5시간 동안 배양합니다. felden A는 금 G 장치의 trapp 사이토카인에 첨가되어 면역 염색으로 가시성을 높이고, 자극 원심분리기를 사용하여 매체를 제거한 다음 저속으로 200마이크로리터의 냉기 유동 세척, 완충액 및 원심분리기를 첨가하여 세척합니다. 이 세척을 반복한 다음 50마이크로리터의 플로우 워시 버퍼를 다시 보냅니다.

이제 세포는 재현탁된 세포의 각 웰에 대한 표면 마커의 발현을 위해 염색할 준비가 되었습니다. 제조업체 및 S 지침에 따라 준비된 살아있는 죽은 고정성 아쿠아 형광 반응성 염료 1마이크로리터를 추가합니다. 세포가 배양하는 동안 섭씨 4도의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.

마이크로 튜브의 사실에 사용할 염색 용액을 준비합니다. 먼저 다음을 적절하게 포함하는 스탠딩 칵테일을 준비합니다. 적정 형광 표지 단클론 항체, 안티 CD 3 PE SCI 7, 안티 CD 8 알렉사 700 안티 CD 28 당 CCP SCI 5.5, 안티 CD 95 PC 및 안티 CD 4 퍼시픽 블루 유입 세척 버퍼.

다음으로, 각 형광 접합 항체의 튜브를 단색 염색으로 개별적으로 준비하여 다른 검출기로의 각 개별 염색의 파급 계수를 결정하는 데 사용할 보상 제어를 준비합니다. 마지막으로, 관심 시약을 제외한 모든 시약을 결합하여 형광 마이너스 하나 또는 FMO 염색을 준비합니다. 이것은 완전히 염색된 샘플에 존재하는 자가형광 수준과 데이터를 복제하여 양성 모집단과 음성 모집단 사이의 경계를 결정하는 데 사용됩니다.

세포가 살아있는 죽은 염색체에서 배양된 후 차가운 흐름 세척 버퍼로 한 번 세척하여 과도한 염료를 제거하고 세척 버퍼를 흡인합니다. 그런 다음 준비된 염색 용액을 추가합니다. 섭씨 4도의 어두운 곳에서 30분 동안 세포를 배양합니다.

염색된 세포를 Cold Flow 세척 버퍼로 세척하여 과도한 항체를 제거합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 BD 고정 투과 용액을 최소 10분 동안 추가합니다. 세포를 사용할 때까지 섭씨 4도의 어두운 곳에서 최대 24시간 동안 보관하거나 세포 내 사이토카인을 라벨링하여 세포 내 사이토카인을 라벨링합니다.

먼저 100마이크로리터의 1X 펌에 있는 세포를 퍼밍합니다. 세척 완충액은 세포가 배양하는 동안 어둠 속에서 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 염색 항체, 보상 대조군 및 FMO 대조군을 이전과 같이 하나의 파마 세척 완충액에 준비합니다.

세포를 10분 동안 배양한 후 스핀다운하여 1x 펌 세척 버퍼를 제거합니다. 적절한 염색 항체를 추가합니다. 그런 다음 배양 후 어둠 속에서 섭씨 4도에서 60분 동안 세포와 항체를 배양합니다.

투과 용액으로 세포를 두 번 씻습니다. 최종 세척 후 resus는 세포를 DPBS의 1% 파라폼 알데히드로 현탁시켜 세포를 고정합니다. 세포를 최대 24시간 동안 사용할 때까지 섭씨 4도의 어두운 곳에서 보관하십시오.

세포가 염색되면 LSR 2 유세포 분석기 또는 cyan a DP 유세포 분석기를 사용하여 사실을 확인합니다. 그런 다음 FlowJo 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. reuss Maca의 PBMC 조성은 팩스 분석을 사용하여 측정되었습니다.

이 그림은 대표 동물의 다양한 T 세포 부분 집합을 분석하는 데 사용되는 게이팅 방식을 보여줍니다. 림프구는 먼저 전방 산란 FSC 대 측면 산란 SSC를 통해 게이트를 측정한 다음 SSC 및 AQUA 음성 모집단을 기반으로 살아있는 림프구를 식별했습니다. 그런 다음 CD 3 개의 발현 CD 4 개의 양성, CD 8 개의 음성 및 CD 4 개의 음성 CD 8 개의 양성 집단으로 T 세포를 확인했으며, CD 3 개의 양성 T 세포 집단 내에서도 결정했다.

CD 4개의 양성 T 세포와 CD 8개의 양성 T 세포는 순진한 중앙 기억 및 효과기 기억 세포로서 CD 28 및 CD 95 발현에 기초하여 다른 하위 집합으로 더 구별되었습니다. 이 그림은 Unstimulated 및 pma에서 인터페론 감마 및 IL 2 생산을 보여줍니다. CIN은 CD에 4개의 양성 T 세포와 하위 집합을 자극했습니다.

자극에 의해 유도된 뚜렷한 사이토카인 프로파일에 주목하십시오. 각 하위 집합에서. pbmc의 다중 유세포 분석을 수행하는 방법을 보여드려야 합니다.

이 절차를 수행할 때 단일 색상 보정 컨트롤과 형광 마이너스 원 컨트롤을 모두 설정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 두 가지 제어 기능은 모두 유세포 분석 데이터의 적절한 분석을 위해 필요합니다. 보상 통제 선택에 대한 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오.

또한 형광 표지 항체를 사용할 때는 빛 노출로부터 보호하기 위해 샘플을 덮는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.