동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

이 비디오 기사의 전반적인 목표는 다음 두 가지 질문에 대한 답변을 제공하는 것입니다. 첫째, 단백질 상호 작용에 대한 연구는 실제로 다른 단백질에 결합할 수 있는 단백질 샘플의 비율을 측정하여 보다 신뢰할 수 있게 이루어질 수 있습니까? 둘째, 키네틱 해석을 통해 구조, 기능 관계를 더 잘 이해할 수 있는 방법은 무엇입니까?

이 두 가지 질문은 라벨을 사용하지 않고 실시간으로 단백질 상호 작용을 감지하는 기기인 Corp X 100과 관련된 실험에서 해결될 것입니다. 이 실험은 소 시스타틴 B와 시스틴 프로테아제 파파인의 상호 작용을 조사하고, 복합체에 있는 두 단백질의 결정 구조는 프로테아제에 결합하는 데 관여하는 여러 잔기를 가리키며 상호 작용하는 각 잔기가 시스타틴 B 파핀 상호 작용에 어떤 영향을 미치는지 확인합니다. 여러 시스타틴 B 변이체는 부위 지시 돌연변이 유발을 통해 생성됩니다.

이러한 실험에서는 재조합 단백질이 올바르게 접히지 않거나 응집되거나 악화되어 부정확하고 재현 불가능한 결과가 발생할 가능성이 항상 있습니다. VIACORE X 100은 CFCA로 약칭되는 무검량 농도 분석을 통해 결합할 수 있는 단백질의 분획을 측정할 수 있는 기능을 갖추고 있습니다. 이 접근법을 사용하면 보정 표준물질을 사용할 수 없는 경우에도 결합 활성이 유지되는 단백질의 농도를 측정할 수 있습니다.

CFCA는 여기에서 시스타틴 B 변이체의 농도를 결정하는 데 사용됩니다. 그런 다음 이러한 데이터는 Pepin에 대한 시스타틴 B 변이체의 결합 역학을 결정하는 데 입력으로 사용되며, BOR X 100을 사용하여 평가됩니다. 안녕하세요, 저는 스웨덴 GE Healthcare의 CLA 그램입니다.

오늘 제 동료인 Eva Pool은 BOR X 100을 사용하여 구조 기능 관계 분석을 수행하는 방법을 보여 드릴 것입니다: 재조합 단백질은 시간이 지남에 따라 부적절한 접힘 또는 느슨한 빈 활성을 나타낼 수 있으며, 이러한 거동은 총 농도 측정에 의존하는 방법으로는 감지할 수 없습니다. 이는 사실상 보정 없는 농도 분석에 의한 농도 측정 후 잘못된 운동 데이터로 이어질 수 있습니다. B.A 코어 X 100은 시스타틴 B 변이체와 페판의 상호 작용의 동역학 및 친화도를 분석하는 데 사용됩니다.

이러한 매개변수는 바인딩 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 실험 설계에 대한 간략한 설명으로 시작하므로 시작하겠습니다. 시스틴(cystine), 프로테아제(protease), 파핀(papin) 및 억제제인 시스타틴 B(cystatin B) 사이의 상호작용은 복합체에 있는 두 단백질의 결정 구조에 의해 밝혀진 바와 같이 소수성 접촉에 의해 지배됩니다.

억제제 측에서 접촉 영역은 N 및 C 단자 Ns와 두 개의 헤어핀 루프입니다. 본 연구에서는 4개의 돌연변이를 조사하였으며, 각 돌연변이에는 시스타틴 B.의 이합체화를 방지하기 위해 도입된 시스테인 3개의 돌연변이가 포함되어 있으며, 결정 구조에서 밝혀진 맥락에 따라 류신 73은 글리신 히스타민 75로 돌연변이되었고 티로신 97은 알라닌으로 변이되었습니다. 두 개의 글리신 돌연변이는 히스티딘 75 및 류신 73 곁사슬의 중요성을 조사하기 위해 도입되었으며, 티로신 잔기는 시스타틴 B의 C 말단과 Pepin 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 알라닌으로 돌연변이되었습니다.

3개의 이중 돌연변이와 INE 3에서 시리아 단일 돌연변이가 파파인 S 메틸 포핀의 촉매 비활성 변이체와의 상호 작용에 대해 테스트되었습니다. 이 촉매 비활성 형태의 Proteus는 활성 틈새에서 CYS 25에 부착된 메틸기를 가지고 있습니다. 단순화를 위해 프로토콜 전체에서 이 변형 propan이라고 부릅니다.

CFCA는 분석물 분자가 표면으로 확산됨에 따라 결합율이 제한되는 조건에서 결합 속도 측정에 의존합니다. 이것은 리간드의 높은 고정 수준에 의해 선호됩니다. 고정 절차를 시작하기 전에 실험에 사용된 HEP 버퍼를 왼쪽 트레이에 놓고 두 튜브를 모두 삽입합니다.

또한 오른쪽 트레이에 빈 쓰레기통을 놓습니다. 그런 다음 새 센서 석고 5를 코어 X 100 소프트웨어를 통해 기기 초기화에 삽입하고 시작 화면에서 도크 칩 도구 항목을 클릭합니다. 소프트웨어에서 문서 시작을 클릭합니다.

다음으로, 고정 마법사를 사용하여 시작 화면에서 검열 CM 5에 대한 커플링을 조준하여 파페 및 고정을 설정하고 다른 옵션 버튼을 클릭한 다음 마법사를 선택합니다. 그러면 사용 가능한 마법사가 있는 창이 표시됩니다. 고정을 선택한 다음 오른쪽 하단에 있는 고정 마법사의 첫 번째 화면이 나타나고 센서 석고 5에 대한 결합을 목표로 하는 것이 기본값입니다.

flow cell 2 아래의 상자를 체크하여 flow cell 2에서 고정합니다. 플로우 셀 1은 아래의 세 가지 사용 가능한 옵션 중에서 기준 표면으로 사용하기 위해 수정되지 않은 상태로 유지됩니다. 오른쪽 대상 수준에서 접촉 시간 지정 상자를 선택하고 접촉 시간으로 변경하고 접촉 시간을 900초로 지정합니다.

다음으로, capturing molecule slash ligand solution(분자 슬래시 리간드 용액) 아래에 고정화 매개변수를 입력합니다. 파파인을 입력합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다.

다음 화면에는 샘플 랙의 레이아웃이 표시됩니다. 위치 1은 et 에탄올아민을 유지하여 리간드 파파인을 칩 표면에 조준 커플링한 후 남은 활성을 비활성화하는 데 사용됩니다. 에탄올아민 용액을 위치 2의 위치 1에 삽입합니다.

리간드를 배치하십시오 파파인 파파인은 과량의 황산메틸에 저장되고 10 밀리몰 아세트산 나트륨 완충액에 밀리리터당 50 마이크로그램을 암시합니다. pH 4.5는 이중 증류수 피펫 85 마이크로리터의 EDC가 있는 아민 커플링 키트의 EDC 및 NHS 커플링 시약을 바이알로 재구성합니다. 캡을 씌우고 위치 3에 놓습니다.

위치 4에서 NHS에 대해 동일한 볼륨을 사용합니다. 기기가 이 파일에서 ED, C 및 NHS를 혼합할 수 있도록 파일 5는 뚜껑을 닫고 비어 있어야 합니다. 또한 H2O 위치의 세척 파일을 깨끗한 탈이온수로 채우는 것을 잊지 마십시오.

화면의 윤곽에 따라 랙이 채워지면 Load samples를 클릭하고 랙을 기기에 로드합니다. 랙이 로드되면 Next(다음)를 클릭합니다. 실행이 시작되기 전에 체크리스트가 표시됩니다.

모든 글머리 기호가 충족될 때 충족되는지 확인하십시오. 시작 버튼을 눌러 실행이 시작됩니다. 주행은 고정 절차 중에 시작됩니다.

데이터는 실시간으로 수집됩니다. 먼저, 커플링 시약이 주입됩니다. 다음으로 파페(pape)를 칩 표면에 결합하고 절차는 나머지 활성 에스테르의 비활성화로 끝납니다.

실행 후 대화 상자 창에 실행 결과가 요약되어 표시됩니다. 이 창에 고정 수준이 표시됩니다. 전체 커플링 절차로 인해 약 3000RU의 고정 파파인이 생성되어야 합니다.

파파인이 센서 칩에 고정되면 시스타틴 B 돌연변이 샘플을 최소 300마이크로리터에서 총 약 10나노몰로 희석하여 CFCA 분석을 시작합니다. 나중에 분석 설정에서 사용할 수 있도록 희석 계수를 기록하십시오. 먼저 assay 폴더의 concentration 섹션에 있는 이전 섹션에서 설명한 대로 마법사 대화 상자를 불러옵니다.

교정 무료를 선택한 다음 새로 선택하십시오. 마법사의 첫 번째 화면에는 주입 순서가 표시됩니다. 센서 칩 CM 5와 직접 고정 분석 접근 방식이 여기에 사용되기 때문에 설정은 변경되지 않은 상태로 유지될 수 있습니다.

다음 화면에서 다음을 클릭합니다. run 및 run startup cycles 전에 확인란을 prime 상태로 둡니다. 또한 기본 시작 주기 수를 변경하지 않고 3으로 둡니다.

솔루션 필드의 이름에 heaps buffer를 입력합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다. 다음 화면에서 재생 용액의 이름인 20 millimolar sodium hydroxide를 입력합니다.

다른 매개변수는 변경하지 않고 그대로 둡니다. 다음을 클릭하여 샘플 테이블을 봅니다. 샘플 테이블에 따라 샘플을 설정합니다.

샘플 테이블의 각 행은 두 개의 사이클을 생성합니다. 하나는 분당 10마이크로리터의 유속이고 다른 하나는 분당 100마이크로리터의 유속입니다. 공백으로 실행을 시작합니다.

그런 다음 섭씨 20도에서 희석 계수 확산 계수와 분자량이라는 이름을 입력합니다. 각 돌연변이에 대해 확산 계수는 제품 웹 사이트의 웹 도구를 사용하여 계산할 수 있습니다. 이 도구에 대한 링크는 소프트웨어의 지원 탐색기에 제공됩니다.

각 샘플을 실행하고 복제하는 것이 좋으므로 빈 행에서 마지막 샘플까지 전체 테이블을 복사하여 테이블 맨 아래에 붙여넣습니다. 계속하려면 next(다음)를 클릭합니다. 다음 화면에는 샘플 랙이 표시됩니다.

소프트웨어가 설명한 레이아웃에 따라 샘플과 시약을 랙에 놓습니다. load samples(샘플 로드) 버튼을 눌러 랙을 기기에 로드합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다.

샘플을 로드한 후 체크리스트가 있는 알림 화면이 표시됩니다. 모든 것을 확인한 다음 시작을 누르십시오. 데이터는 실행 중에 실시간으로 수집됩니다.

실행이 완료되면 수집된 데이터를 표시하는 창을 닫습니다. 새 결과 항목이 주 창에 나타나는지 확인합니다. 데이터에서 농도를 계산하려면 새 결과 항목을 선택하고 버튼을 클릭하십시오.

코어 X 100을 통해 평가합니다. 평가 소프트웨어는 도구 모음에서 수집된 모든 데이터를 표시하기 시작하고 농도 분석을 선택한 다음 메뉴에서 무료로 보정을 선택합니다. 첫 번째 창에서 분석에 포함할 데이터를 선택합니다.

목록을 스크롤하고 보기 목록을 단계별로 실행하여 모든 샘플에 대한 데이터를 봅니다. 데이터를 제외하려면 목록에서 확인 표시를 제거합니다. 다음을 클릭하여 계산을 시작합니다.

CFCA 상호 작용 모델은 피팅이 완료되면 실험 데이터에 자동으로 피팅되며, 결과 창에 각 샘플에 대한 결과가 보고됩니다. 각 샘플에 대한 피팅을 단계별로 진행하려면 테이블에서 해당 행을 선택합니다. 측정된 농도라고 하는 열은 분석된 샘플의 농도를 보여줍니다.

원래 샘플의 농도는 이전에 입력한 희석 계수를 사용하여 계산되고 완료되면 계산된 농도 열에 표시되며 마침을 클릭하여 결과를 저장합니다. 이제 CFCA 분석을 통해 단백질의 농도를 알게 되었으므로 후속 동역학 측정을 위한 훌륭한 기반을 확보했습니다. 역학 분석은 이제 결합 메커니즘에 대한 주요 아미노산 잔기의 중요성을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

키네틱 해석 설정을 시작하겠습니다. 역학 분석은 시작 화면의 기기에 새로운 센서 칩 CM 5를 도킹하는 것으로 시작됩니다. kinetic의 친화도에 대한 분석 워크플로우를 생성하도록 선택합니다.

왼쪽 상단 모서리에 리간드에 대한 정보가 입력되는 대화 상자 창이 나타납니다. 리간드 이름 상자에 papain이라는 이름을 입력하고 종 유형 목록에서 다른 단백질을 선택합니다. 그런 다음 제시된 두 가지 대안적인 리간드 부착 접근법 중 센서 칩 CM 5를 사용하여 공유 리간드를 고정화(immobilize ligand)를 선택하면 권장되는 분석 워크플로우가 이제 창의 오른쪽에 요약되어 있습니다.

고정화 단계부터 시작하여 분석 단계까지 이어집니다. 계속하려면 계속을 누릅니다. Assay workflow를 요청에 따라 이름을 입력하고 save를 눌러 저장합니다.

이제 소프트웨어는 모든 단계와 연결된 버튼으로 분석 작업 흐름을 간략하게 설명합니다. 센서 표면 준비의 첫 번째 단계는 동원 pH를 찾는 것입니다. 이 pH가 알려져 있으므로 나타나는 대화 상자에서 알려진 값 입력을 누릅니다.

버퍼 이름, 아세테이트 및 pH 4.5를 입력하고 저장을 선택합니다. 이제 분석 워크플로우가 이 단계가 완료되었음을 나타내는 녹색 확인 표시로 업데이트됩니다. 이제 움직이지 못하게 할 때입니다: 움직이지 못하게 된 단계에서 실행 버튼을 누르십시오.

이것은 CFCA 분석을 위한 프로판 및 고정화에 사용된 것과 동일한 마법사를 불러옵니다. 역학 분석을 위한 파핀의 고정화는 더 적은 시간 동안 더 희석된 용액이 주입된다는 점을 제외하고는 여기에서 동일한 방식으로 설정됩니다. 이는 시스타틴의 결합 속도가 돌연변이일 수 있는 상황이 확산에 의해 제한되는 상황을 피하기 위해 파핀을 덜 고정시켜 운동 데이터를 단독으로 측정할 수 있도록 하기 위함입니다. 리간드의 이름과 고정 pH는 분석 워크플로우의 이전 단계에서 입력되었기 때문에 둘 다 여기에 사전 설정되어 있습니다.

유일하게 필요한 업데이트는 접촉 시간에 대해 50초입니다. 그런 다음 고정이 앞서 표시된 대로 진행됩니다. 고정 수준 후 예상되는 바인딩은 50 R ru입니다.

실행 버튼 옆에 있는 녹색 확인 표시는 고정이 완료되었음을 나타냅니다. 다음으로, 단계의 워크플로우에 재생 솔루션을 입력합니다. 나타나는 대화 상자에서 알려진 값 입력(Enter known values)을 클릭하여 재생성 조건을 찾습니다.

재생 솔루션과 접촉 시간을 입력합니다. 그런 다음 저장을 클릭합니다. 이제 리간드가 고정되고 재생 조건이 입력되었으므로 run kinetics Affinity assay 상자에서 kinetics 데이터를 생성하도록 모든 설정이 완료되었으며 kinetics의 첫 번째 단계에서 run 버튼을 누릅니다.

Affinity wizard는 여기에서 사용되는 단일 사이클 역학에 대한 모든 사이클의 주입 순서를 간략하게 설명하며, 아무 것도 변경할 필요가 없습니다. 계속하려면 다음을 클릭하십시오. 다음 단계에서는 실행하기 전에 시스템의 프라이밍을 나타내는 기본 설정을 유지합니다.

칩 표면의 평형을 맞추기 위해 하나의 시동 주기를 실행하도록 선택합니다. 다음으로, 샘플에 대한 주입 파라미터를 정의합니다. 재생 솔루션이 이전에 지정되었고 설정이 미리 정의되어 있으므로 화면의 매개변수를 변경할 필요가 없습니다.

다음을 클릭합니다. 마지막으로 샘플을 지정합니다. 각 돌연변이 변형에 대해 두 개의 행을 입력하며, 하나는 비어 있고 다른 하나는 샘플이 있습니다.

블랭크 사이클은 가장 높은 농도 매개변수를 0으로 설정하여 표시됩니다. 2. 시스타틴 B 변형체는 각 실행에 적합할 수 있습니다. 각 돌연변이에 대해 분자량, 최고 농도 및 희석 계수를 입력하고 다음을 누릅니다.

다음 화면에는 샘플 랙이 요약되어 있습니다. 단백질 샘플의 희석 시리즈를 준비하고 캡이 있는 바이알을 랙에 넣습니다.화면에 설명된 대로 버퍼가 있는 바이알은 13번 위치에 배치되고 재생 용액이 있는 바이알은 14번 위치에 배치됩니다. 물 위치에 깨끗한 물을 채우십시오.

랙을 기계에 놓고 load samples(샘플 로드) 버튼을 눌러 샘플을 로드한 후 next(다음)를 클릭합니다. 이전과 마찬가지로 실험 실행을 진행하기 전에 상호 작용 데이터가 실시간으로 나타나기 시작 를 눌러 최종 확인을 수행합니다. 실행이 완료되면 방금 시연된 대로 나머지 시스타틴 B 변형체를 즉시 실행하도록 진행합니다.

나머지 시스타틴 B 변이체가 연속적으로 실행되는 경우, 단계에서 해당 확인란의 선택을 취소하여 프라임 단계 및 시작 주기를 생략합니다. 각 실행이 완료되면 링크에서 데이터에 액세스할 수 있습니다. 모든 결과는 분석 워크플로우입니다.

이 워크플로우 내에서 생성된 모든 결과가 포함된 대화 상자 창이 나타납니다. 운동율 상수를 계산하려면 평가할 결과를 선택하고 평가를 누르면 코어 X 100 평가 소프트웨어가 다시 시작되어 모든 집합적 데이터가 표시됩니다. 도구 모음 메뉴에서 kinetics affinity를 선택합니다.

첫 번째 스크리닝에서는 시리아 돌연변이체에 대한 시스테인 3이 평가를 위해 선택됩니다. 이 돌연변이의 데이터는 이 돌연변이에 대해 수행된 빈 실행과 함께 표시됩니다. 다음. 다음 화면에는 샘플이 있는 실행에서 빈 실행에서 뺀 데이터가 표시됩니다.

kinetics 버튼을 클릭하여 kinetics를 평가하도록 선택합니다. 이제 데이터를 일대일 교호작용 모형에 적합하도록 선택합니다. 맞춤 버튼을 클릭하면 피팅이 계산될 때 화면에 표시됩니다.

준비가 되면 품질 관리가 자동으로 적용되고 하단에 강조 표시됩니다. 품질 관리 항목을 살펴본 다음 센서 그램 데이터를 확인하여 센서 그램이 충분한 곡률을 보이는지 확인합니다. 또한 수집된 데이터와 적합 모형 간의 차이를 보여주는 잔차 그림을 살펴보십시오.

체계적이고 비무작위적인 편차에 주의하십시오. 이 핏은 허용됩니다. 이제 보고서 탭에서 운동 데이터를 살펴보겠습니다.

연관 비율 상수, 해리 속도 상수, 평형 해리 상수. 완료되면 다른 모든 돌연변이에 대해 동일한 절차를 반복하여 finish를 누릅니다. 다음은 조사된 다양한 시스타틴 B 변이체에 대한 CFCA 분석의 대표적인 결과입니다.

특정 결합 농도 데이터는 분당 10 및 100 마이크로리터의 유속으로 얻은 센서 그램에서 추출됩니다. Two 80 측정에 의해 결정된 농도와 CFCA에 의해 결정된 농도를 비교할 때, 대부분의 경우 단백질이 류신 73 글리신 변이체에 대해 완전히 활성인 반면, 활성 단백질의 분율은 매우 낮다는 것이 분명합니다. pepin에 결합하는 시스타틴 B 변이체의 동역학은 단일 주기 동역학을 사용하여 측정됩니다.

센서 그램은 검은색으로 오버레이된 일대일 상호 작용 모델에 대해 kinetic을 사용하여 공백 및 참조 빼기 데이터를 표시합니다. 류신 73 변이체에 대해 CFCA에 의해 측정된 특정 결합 농도는 2개의 80 측정에 의해 결정된 총 단백질 농도의 약 10%에 불과합니다. 운동 매개변수를 계산할 때 올바른 농도를 사용할 때 Lucien 73의 연관률이 다른 변형의 연관률과 유사하다는 것이 분명해집니다.

돌연변이의 결합률은 야생형 단백질의 결합률과 비슷하지만, 돌연변이의 해리율 상수는 평형 해리 상수의 증가에 따라 두 자릿수에 가까운 수준으로 더 높을 수 있습니다. 감소된 친화도는 주로 해리율 증가에 따라 달라지며, 이는 복합체가 형성된 후 억제제를 효소에 부착된 상태로 유지함으로써 두 번째 결합 루프와 C 말단 말단이 모두 결합 친화도에 기여한다는 것을 나타내며, 돌연변이 중 하나가 매우 낮은 결합 활성을 갖는 것으로 판명되었기 때문에 이 결론에 무보정 농도 분석의 사용이 필수적이었습니다. 제 동료 Pol은 이제 구조화된 함수 연구에서 bi core X 100을 사용하는 방법을 보여주었습니다. 이러한 실험을 수행할 때 농도 분석과 역학 분석은 모두 동일한 결합 절차를 기반으로 하지만 실험 조건이 상당히 다르다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.