Name: Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 배우세요 마이크로플루이딕 공동 배양 모델을 사용하여 상피 세포와 박테리아의 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 병원균 정착에 대한 공생 미생물 환경의 영향을 조사하여 위장관 감염 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 (CBET 0,846,453)과 국립 보건원 (1R01GM089999)에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 표준 SU - 8 석판술 1을 (이 동영상에 표시되지 않습니다)를 사용하여 실리콘 마스터의 제작. <ol><li> SU - 8 "마스터"(SU - 8 2050, MicroChem, 뉴턴, MA) 청정실에서 다른 구성 요소를 (서로 다른 두께의 PDMS의 점막, 공동 문화 챔버) fabricating하십시오.을 만들 표준 SU - 8 석판술 방법을 사용하여 이러한 마스터 금형은 모든 microfabrication 시설 (; 예를 들어, 스탠포드 Microfluidics 주조에서 가공 수 있습니다 <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> 이전 PDMS의 복제, 마스터에서 PDMS의 쉬운 버전을 촉진하기 위하여 진공 소스에 연결된 건조기에 플루오로 실란 수증기에 SU - 8 주인을 폭로. 종이 타월로 플루오로 실란의 드롭을 추가 한 분 진공을 적용합니다. 진공을 제거하고 플루오로 실란의 증착을위한 30 분 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 닫힌 용기에 SU - 8 마스터 보관하십시오. </li></ol> 2. 마스터이 SU - 8 PDMS의 복제 성형 <ol><li> 유체 계층과 제어 계층은 SU - 8 마스터에서 PDMS의 복제 성형에 의해 만들어집니다. </li><li> 10시 1분 WT에서 PDMS 사전 폴리머와 가교제를 섞습니다. 일시간 (또는 기포가 PDMS 혼합물에서 제거되기 전까지)에 건조기에 비율 및 데가스. </li><li> 배양 접시에있는 SU - 8 마스터를 놓고 조심스럽게 SU - 8 마스터 위에 PDMS 혼합물을 따라줘. 다시 데가스 PDMS. </li><li> 몰드에 주변 100μm의 균일한 PDMS의 두께를 한 분간 1200 rpm으로 금형을 스핀. </li><li> PDMS를 치료 한 시간 PDMS 80에서 SU - 8 마스터 금형 ° C가 들어있는 배양 접시를 가열. </li><li> 제거 치료 PDMS - 다루는 열판에서 SU - 8 마스터. </li><li> SU - 8 마스터에서 PDMS 금형 껍질. </li><li> 이 세균 인레츠 하나의 콘센트 하나의 공압 포트에 대한 20 게이지 날이 엔드 바늘을 사용하여 PDMS 금형 네 개의 구멍을 드릴. </li></ol> 3. 다층 PDMS 장치의 결합은이 장치를 세 레이어 - 메인 채널, 중앙 공기 계층, 그리고 세균에 대한 채널을 포함하는 바닥 박테리아 레이어를 포함하고 상위 레이어로 조립합니다. 아래에 설명된대로 세 개의 레이어가 모였습니다. <ol><li> 메탄올과 PDMS의 세포막을 젖은 조심스럽게 깨끗한 집게를 사용하여 SU - 8 마스터 금형에서 껍질. 테플론 시트에 플레이스 막. </li><li> 산소 플라즈마 챔버에서 공기 막과 유체 레이어를 놓습니다. 40 초 (산소 압력이 10 sccm, RF 전력 100W)에 대한 플라즈마를 켭니다. </li><li> 플라즈마에 노출된 후 (10 분 이내) 포셉를 사용하여 아래 PDMS 채널에 멤브레인을 맞춥니다. 멤브레인 및 PDMS 레이어에 메탄올을 추가하면 레이어 무료로 운동을하는 데 도움과 정렬이 쉬워집니다. 이 경우, 장치는 메탄올의 증기가 탈출 수 있도록 거즈의 일부에 위치합니다. </li><li> 8 H. 80 ° C에서 열판에 정렬 PDMS 레이어 치료 </li><li> 본드로 조립 합성 PDMS 장치에 상단 채널 3.4 - 맨 아래 레이어에 공기 막에 결합 후, 단계 3.2를 반복합니다. </li></ol> 4. PDMS 장치를 조립 3,4 <ol><li> 진핵 세포와 세균을 심는에 사용되는 입구와 출구 포트에 구멍을 드릴. </li><li> 포트 Tygon 튜빙 (0.01 인치 OD)을 연결하고 20mL 주사기로 당겨 공압 레이어를 운영하고 있습니다. </li><li> PDMS 모델과 산소 플라즈마 챔버에 미리 청소 유리 슬라이드를 놓습니다. 에 대한 플라즈마를 켜고 진공을 적용하지 않고 20 초 (산소 압력이 20 sccm, RF 전력 300W). </li><li> 유리 슬라이드에 섬 벽 (PDMS) 결합 사이의 접촉을 방지하기 위해, 즉시 장치에 주사기를 연결하고 주사기를 당겨과 장소에 개최하여 진공을 적용합니다. </li><li> 부드럽게 유리에 PDMS 모델 (2 분 이내) 누르십시오. </li><li> 80 PDMS 장치를 치료 10 분 ° C. </li></ol> 5. fibronectin과 유리 표면을 처리 <ol><li> 모든 포트에 Tygon 튜빙을 연결 후 15 분 동안 자외선을 쬐면 장치를 소독. </li><li> 입력하고 채널에있는 이물질을 제거하는 채널로 살균 PBS를 흐름. 공기 방울을 제거하는 10 분 동안 흐름을 적용합니다. 공기 방울이 쉽게 때문에 가스 투과성의 PDMS을 이스케이프 처리할 수 있습니다. </li><li> 채널에 공기 거품의 형성을 방지하기 위해 공압 채널에 색상 염료 솔루션을 채우십시오. </li><li> 유리에 진핵 세포 시딩를 촉진하려면 장치에 fibronectin의 1 μg / ML 솔루션을 도입 37 40 분 품어 ° C.를 </li><li> 성장 미디어 1 ML과 초과 fibronectin을 씻으십시오. </li></ol> 6. 공생 E.의 형성 및 측정 콜리 biofilm에제도 <ol><li> OD 600 M9 최소 매체의 공생 박테리아 (예 : E. 대장균 BW25113/pCM18)을 희석 폐쇄 실 / 제도에 공생 biofilm을 형성을위한 ~ 1. </li><li> 긍정적 - 액체 압력을 적용하여 그 섬에 벽을 닫습니다. 수제 공기 - 투 - 액체 압력 변환기는 채널에 공기 방울 형성​​을 방지하는 데 사용됩니다. </li><li> 공생 E. 소개 밸브와 제도에 대장균은 폐쇄하고, 박테리아는 32에서 1 시간 동안 첨부할 수 있습니다 ° C. </li><li> 무소속의 박테리아를 씻고 12 시간 0.25mL/hr에서 희석 세균 현탁액 (OD 600 ~ 0.05)을 perfuse. </li><li> 느슨하게 연결된 박테리아를 제거하고 진핵 세포 부착을 준비하는 신선한 DMEM 성장 매체와 biofilm을 씻어. </li><li> 이미지 Leica TCS SP5 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (배녹번, IL), 그리고 IMARIS 소프트웨어 5를 사용 biofilm 아키텍처를 시각화를 사용하여 biofilm. </li></ol> 7. 세균성 섬들이 6-8 주변의 진핵 세포를 심는 <ol><li> 5 X 10 5 세포 / ML의 시딩 밀도에 대한 DMEM 매체 조직 문화 술병과 resuspend에서 헬라 세포를 Trypsinize. </li><li> 2 ML / Picoplus의 주사기 펌프 (하버드 Apparattus, MA)를 사용 분의 유량에있는 장치에 헬라 세포를 소개합니다. 섬의 벽이 세균성 biofilm은 헬라 세포 지역에서 분리되도록 저하되었는지 확인하십시오. 시딩의 균일 결정 수 있도록이 단계는 가벼운 현미경의 무대에서 수행되어야합니다. </li><li> 5 % CO 2 배양기에서 37 6 H에 대한 채널 및 부화 ° C의 세포 현탁액의 움직임을 줄이기 위해 셀 콘센트 클램프. </li><li> 무소속의 세포를 제거하는 0.5 ML / HR에서 성장 매체와 장치를 Perfuse. </li><li> 새로고침 헬라와 공생 E.위한 DMEM 매체 대장균 매 6 시간. </li></ol> 8. 아일랜드와 진핵 세포에 노출에 병원성 세균 소개 <ol><li> E. 준비 대장균 O157 : H7 (EHEC)가 100:1 200:1 (헬라 세포 당 EHEC의 수)의 감염의 다중성 (뫄)에서 헬라 세포를 감염 있습니다. </li><li> 린스와 느슨하게 연결된 공생 세균을 씻어. </li><li> 제도에 희석 EHEC 중지 (OD 600 ~ 0.1) 소개합니다. </li><li> ° 흐름없이 6 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 C는 공생 biofilm에있는 신호에 노출 수 EHEC 수 있도록 37 장치를 품어. </li><li> 6 시간 동안 헬라 세포에 공생 제도 EHEC를 노출 PDMS 벽을 리프트. </li><li> PBS와 채널을 씻어 라이브 / 데드 키트 (L3224, Invitrogen, CA)을 사용하여 살고 죽은 세포에 대한 얼룩. </li><li> 자이스 혈구 Axiovert 200M 형광 현미경 및 이미지 여러 위치 살고 죽은 세포의 수를 예상하고있다. </li></ol> 9. 대표 결과 9 GI 트랙트 감염의 이벤트 시퀀스는 헬라 세포의 monolayer과 공생 E.을 개발하여 했었습니다 콜리 biofilm 사전 헬라 세포의 감염에 공생 biofilm에 EHEC을 알아가는 겁니다. microfluidic 공동 문화 모델의 제조에 관련된 단계는 그림 1에 표시됩니다. 그림 2A의 공동 문화 장치의 3 차원 렌더링을 보여줍니다. 공동 문화 장치 진핵 세포 배양 챔버와 박테리아 섬의 두 영역은 서로 다른 색상의 염료 (세균성 섬에 대한 진핵세포 지역과 녹색 보라색)과 그림 2B에 표시됩니다. 주변 진핵세포 지역에서 세균성 문화의 영역을 분리의 가능성은 그림 2C는 색 염료를 사용하여 표시됩니다. 그림 3은 상피 세포 및 박테리아의 공동 문화 대표 결과를 보여줍니다. 그림 3A가에 의해 공생 biofilm (녹색) 섬 식민지를 보여줍니다 EHEC (적색). 그림 3B는 상피 세포와 공생 E.의 병렬 배치를 보여줍니다 박테리아 섬 EHEC과 대장균. EHEC 및 GFP 표현 공생 세균을 표현 RFP는 상피 세포에서 박테리아 섬에 고립의 가능성을 보여주는, PDMS 벽이 저하됩니다 섬의 현지 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 공동 문화 모델 셀 시딩 제도. (1) PDMS 벽이 섬을 형성 저하되어 공생 박테리아는 섬에 소개하고 있으며, fibronectin은 섬에서 흘렀을 것입니다. (2) 헬라 세포는 섬 주변 지역에서 씨앗을 품고 있습니다. (3) 헬라 세포가 합류를 달성하고 공생 biofilm이 개발되면, EHEC는 섬에 소개됩니다. (4) PDMS 벽이 해제됩니다EHEC로 섬 주변 헬라 세포를 노출까지. 밸브 작동 삽입된 페이지 보여주는 세부 사항. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="그림 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2A"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="그림 2bc" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2bc"> 그림 2 : 상피 세포 및 박테리아의 공동 문화 Microfluidic 모델입니다. 상피 세포 사이에 박테리아 섬을 형성 pneumatically - actuated 트래핑 지역을 보여주는 공동 문화 장치 (A) 3 차원 연주. 각 세균의 섬 (1200 μm의 직경과 간격 1,000 μm의)는 성장 미디어를 제공하고 섬에서 낭비를 제거하는 별도의 입구와 출구가 있습니다. 다른 영역을 (상피 세포 구역, 세균 제도) 표시 색상 염료와 공동 문화 장치 (B) 현미경. (C) 공압 트래핑 시스템의 충실도는 pneumatically 활성화 채널 (파란색)를 사용하여 PDMS 벽 (왼쪽 패널) 저하 폐쇄 섬 제도에 자주색 염료를 소개하고, 48 H.에 대한 주위 노란색 염료를 흐르는으로 표시됩니다 PDMS 벽이 (오른쪽 패널)을 올랐을 때, 섬 지역은 주변의 노란색 염색에 노출됩니다. 스케일 바 500 μm의를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 헬라 세포 및 박테리아의 공동 문화. RFP - 표현 EHEC 및 GFP - 표현 E.의 (A) 형광 이미지 아일랜드에서 대장균 BW25113. (B) 전송의 중첩, 녹색 및 장치에 적색 형광 이미지. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+integrated+passive+valves+and+pumps+for+flexible+polymer+3-dimensional+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems.</a> Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).</li>
<li>Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatically+controllable+flexible+and+polymeric+microfluidic+valve+fabricated+via+in+situ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromech+Microeng%22%5BJournal%5D)">A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development.</a> J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).</li>
<li>Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+multiplexed+control+of+latching+pneumatic+valves+using+microfluidic+logical+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures.</a> Lab Chip. 6, 623-631 (2006).</li>
<li>Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole+is+an+inter-species+biofilm+signal+mediated+by+SdiA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA.</a> BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+with+tunable+topographies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices with tunable topographies.</a> Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).</li>
<li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li>
<li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-Chip%22%5BJournal%5D)">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li>
</ol>

병원체 첨부 파일과 식민지에 대한 기존의 assays은 병원균이 추가되어있는 조직에 문화 접시에있는 진핵 세포의 monolayer를 활용. 이러한 모델들은 진핵 세포에서 개발한 공생 박테리아 biofilm을 포함하지 않는 생리학 관련되지 않습니다. 진핵 세포에 미리 재배 세균성 문화의 간단한 또​​한 biofilms가 높은 시간이 지남에 따라 발전 구조를 구성하는 본 형태로 이어질 가능성이 있으며, 실질적으로 불가능하지 않을 경우 그것은 박테리아의 존재의 문화 진핵 세포로, 매우 어렵습니다 생존에 상당한 손실없이 오랜 기간 동안. 병원균은 상피 세포에 부착 이러한 모델에서 공생 biofilm을 탐색하지 않기 때문에,이 모델은 정확하게 GI 트랙트의 상피 세포와 공생 박테리아의 조직을 모방하지 않습니다. 여기서 우리는 진핵 세포 및 박테리아의 공동 문화 pneumatically 제어 트래핑을 사용하는 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다. 모델 병원체로 모델 진핵 세포 라인과 EHEC 같은 헬라 세포를 사용하여, 우리...

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고해상도 (16,256 dpi) 포토리소그래피 마스크</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td>프로그래머블 스핀 코터</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>마스크 정렬기</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>산소 플라즈마 식각기</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>시린지 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead 생존능/세포독성 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

인간의 위장 (GI) 트랙트는 장의 상피 세포와 비 병원성 (공생) 박테리아가 공존하는 독특한 환경입니다. 이것은 병원체가 공생 레이어에 발생하는 microenvironment가 식민지의 범위를 결정하는 중요하다고 제안되었습니다. 병원체 식민 조사를 위해 현재 문화 방법은 잘 그들은 GI 요로 microenvironment를 모방하는 방식으로 박테리아와 상피 세포의 공동 문화를 활성화하지로 가설을 조사 적합하지 않습니다. 여기 우리는 진핵 세포 및 박테리아의 독립적인 문화를 수있는 microfluidic 공동 문화 모델을 설명하고, 병원체 식민지에 공생 microenvironment의 효과를 테스트. 공동 문화 모델은 공생을 개발하여 증명<em&gt; 대장균</ementerohemorrhagic 소개 다음 헬라 세포 사이&gt; biofilm,<em&gt; E. 대장균</em&gt; (EHEC) 공생 섬에, GI의 요로 감염에서 사건의 순서를 모방 순서 인치

이 프로토콜은 상피 세포와 세균의 동시와 언어 문화 microfluidic 공동 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 putative probiotic 박테리아 변종의 효과를 pathogenesis에 다른 수용성 분자 신호의 역할을 조사뿐만 아니라 화면을 사용할 수 있습니다.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

인체 위장관(GI tract)은 장 상피 세포와 비병원성(공생) 박테리아가 공존하는 독특한 환경입니다. 이곳은 ...

본 프로토콜은 공생 미세환경이 병원균의 정착에 미치는 영향을 테스트하기 위해 진핵 세포와 박테리아의 독립적인 배양이 가능한 새로운 미세유체 공동 배양 모델의 사용법을 보여줍니다. 공동 배양 모델은 HeLa 세포 사이에 공생 E. coli 바이오필름을 형성한 후, 위장관 감염의 사건 발생 순서를 모방하여 공생 섬(commensal island) 내에 장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E. coli 또는 EHEC)을 도입함으로써 입증됩니다.EHEC에 의한 상피세포 군집화 정도는 형광 현미경을 사용하여 시각화합니다. 안녕하세요, 저는 텍사스 A&M 대학교 화학공학과 분자 시스템 생명공학 연구실에서 나왔습니다. 오늘은 인간 위장관의 조직 구조를 모사하는 방식으로 마이크로 장치 내에서 박테리아와 eCard 세포를 함께 배양하는 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 병원성 박테리아가 상피 세포에 정착하기 전 위장관 내에서 접하는 신호가 정착 과정에 어떤 영향을 미치는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 실험에 앞서, 의도한 실험 용도에 맞게 설계 및 제작된 실리콘 마스터를 준비하십시오.예를 들어, Stanford Microfluidics Foundry에서 설계된 마스터를 제작하면 이를 통해 후속 실험용 복제 몰드를 만들 수 있습니다. 본 프로토콜에서 설명하는 3층 구조 장치를 위해서는 진핵 세포 배양층과 공압층을 위한 두 개의 막, 그리고 하나의 박테리아 채널을 위한 몰드가 필요하며, 박테리아, 공압 및 진핵 세포 배양층의 채널 높이는 각각 5, 200, 100 micrometers입니다. 복제 몰드를 준비하기 전, 진공원에 연결된 데시케이터 내에서 SU-8 마스터를 fluorocycline 증기에 노출시키십시오. 마스터에서 PDMS 몰드가 쉽게 분리되도록 진공 챔버 내의 종이 타월에 fluorolane 한 방울을 떨어뜨리고 1분 동안 진공을 가하십시오.진공을 해제하고 fluoro가 증착될 수 있도록 30분 동안 대기합니다. 향후 복제 몰드를 제작할 수 있도록 SU-8 마스터를 페트리 접시에 보관합니다. PDMS 전폴리머와 가교제를 10:1의 중량비로 준비하여 충분히 혼합한 후, 진공 챔버에서 1시간 동안 혼합물의 기포를 제거합니다.기포를 제거하려면 SU-8 마스터를 페트리 접시에 넣고, 마스터 위에 PDMS를 조심스럽게 붓습니다. 이때 마스터 층에는 5 g의 PDMS를, 박테리아 층에는 30 g의 PDMS를 사용합니다. 기포 제거를 위해 PDMS를 다시 10분 동안 탈기합니다. 다음으로, 몰드를 1분 동안 회전시켜 PDMS가 균일한 막으로 퍼지도록 합니다.본 프로토콜에서는 진핵세포 배양 막의 경우 1200 RPM으로 회전시켜 150 µm 두께로 제작하고, 공압 막의 경우 800 RPM으로 회전시켜 250 µm 두께로 제작합니다. 스핀 코팅 후, 스핀 코팅된 PDMS와 SU-8 마스터 몰드가 담긴 페트리 접시를 상온에서 15분 동안 유지한 다음, 핫플레이트에서 80 °C로 한 시간 동안 가열합니다. PDMS 경화 후, PDMS에 메탄올을 적시고 깨끗한 포셉을 사용하여 SU-8 마스터 몰드에서 조심스럽게 떼어냅니다.박테리아 층을 실체 현미경 위에 놓고 20 gauge blunt end needle을 사용하여 구멍 세 개(박테리아 입구 두 개와 출구 한 개)를 뚫습니다. 3층 구조의 장치는 공압 층을 박테리아 층에 접합한 후, 진핵 세포 배양 층을 박테리아 및 공압 층에 접합하는 순서로 조립합니다.공압 막(pneumatic membrane)과 박테리아 층을 유리 슬라이드 위에 놓고, 산소 압력 10 standard cubic centimeters per minute(SCCM) 및 무선 주파수(RF) 전력 100 watts 조건의 산소 플라스마 챔버에서 40초 동안 플라스마에 노출시킵니다. 막에 메탄올을 첨가하면 층의 자유로운 이동이 촉진되어 정렬이 더 쉬워집니다. 산소 플라스마 노출 후 10분 이내에 핀셋과 실체 현미경을 사용하여 박테리아 층을 페트리 접시에 옮깁니다.박테리아의 입구 및 출구 구멍을 기준으로 중간 공압 막을 박테리아 층에 맞춥니다. 정렬 후, 정렬된 PDMS 구조가 포함된 페트리 접시를 80 °C의 핫플레이트 위에 8시간 동안 올려 결합시킵니다. 이 과정이 완료되면 공압 채널을 제어하기 위해 공압 층에 구멍을 뚫습니다.다음으로, 진핵 세포 배양 채널을 조립된 복합 PDMS 장치에 접합하기 위해 조립부터 정렬까지의 단계를 반복합니다. 진핵 세포 파종에 사용되는 입구 및 출구 포트에 구멍을 뚫습니다. 포트에 tigon 튜빙을 연결하고 20 milliliter 주사기를 사용하여 당겨줌으로써 공압층을 작동시킵니다.복합 PDMS 구조체와 미리 세척한 유리 슬라이드를 산소 플라즈마 챔버에 넣습니다. 진공을 가하지 않은 상태에서 플라즈마를 20초 동안 작동시킵니다. 산소 플라즈마 챔버에서 복합 PDMS 구조체를 꺼내어 20 milliliter 주사기를 연결합니다.밸브와 유리가 접촉하는 것을 방지하기 위해 즉시 당겨 진공 상태를 만듭니다. 1분 이내에 슬라이딩합니다. 플라스마 노출 후, 복합 PDMS 구조물을 유리 위에 부드럽게 누릅니다.핫플레이트의 80 °C에서 10분 동안 PDMS 장치를 경화시킵니다. 그 후, 각 포트에 tigon 튜빙을 연결하고 UV 하에서 15분 동안 장치를 멸균합니다. 다음으로, 1 mL 시린지에 멸균된 PBS 500 µL를 채워 채널 내로 주입하여 잔해물을 제거합니다.공기 방울이 관찰되면, 배출 튜브를 이노르(einor) 마이크로 원심분리 튜브로 고정하고 가벼운 압력을 가해 가스 투과성 PDMS 층을 통해 공기 방울을 밀어냅니다. 채널 내에 공기 방울이 형성되는 것을 방지하기 위해 공압 채널에 멸균수를 채웁니다.기구 내 공압 채널의 기포 형성을 방지하기 위해 수제 공기-액체 압력 변환기를 사용합니다. 유클리드 세포를 유리에 시딩하기 위해, 500 µL의 피브로넥틴을 진입구의 세포 배양 영역으로 주입합니다. 시린지를 사용하여 밸브를 닫은 상태로 유지하고 37 °C에서 40분 동안 배양합니다.마지막으로 시린지 펌프를 사용하여 1 mL의 성장 배지로 과잉의 fibronectin을 세척합니다. 이제 장치는 공생 바이오필름 형성 실험에 사용할 준비가 되었습니다. 박테리아를 M nine 최소 배지에 희석하여 OD 600이 약 1이 되도록 합니다. 본 예시에서는 e coli 실험실 균주를 사용하였으나, 어떠한 비병원성 박테리아 균주도 사용할 수 있습니다.양압을 가하여 박테리아와 진핵세포 배양 영역을 구분하는 밸브를 닫습니다. 시린지 펌프를 사용하여 OD 600이 약 1.0인 e coli 0.2 milliliters를 아일랜드 내로 주입하고, 32 degrees Celsius에서 1시간 동안 박테리아가 부착되도록 둡니다. 배양 후.OD 600이 약 0.05인 희석된 박테리아 현탁액과 신선한 M9 최소 배지를 시간당 0.25 mL의 속도로 12시간 동안 관류합니다. 시린지 펌프를 사용하여 시간당 0.5 mL의 속도로 0.5 mL의 신선한 무혈청 및 무항생제 DMEM 배지로 바이오필름을 헹궈 느슨하게 부착된 박테리아를 제거하고 진핵세포 부착을 준비합니다. Leica TCS SP5 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 바이오필름을 촬영하고 MS 소프트웨어를 통해 바이오필름 구조를 시각화합니다.트립신을 사용하여 조직 배양 플라스크에서 HeLa 세포를 떼어내어 현탁합니다. HeLa 세포를 DMEM 배지에 현탁하여 최종 부피 0.1 mL, 세포 밀도 5 × 10⁵ cells/mL가 되도록 준비합니다. Pico-Plus 시린지 펌프를 사용하여 2 mL/min의 유량으로 장치의 진핵생물 영역에 HeLa 세포를 주입합니다.다음으로, 광학 현미경을 사용하여 공생 박테리아 영역과 진핵 세포 영역을 분리하는 밸브가 완전히 닫혀 박테리아 바이오필름이 헬포 세포 영역과 분리되었는지 확인합니다. 에펜도르프 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 세포 배출구를 고정함으로써 채널 내 세포 현탁액의 이동을 줄이고, 5% 이산화탄소 배양기에서 37 °C로 6시간 동안 배양합니다. 배양 후, 시린지 펌프를 사용하여 0.5 mL/hr의 속도로 50 µL의 DMEM 성장 배지를 장치에 관류시킵니다.부착되지 않은 세포를 제거하기 위해, hela 및 공생 e coli 영역의 DMEM 배지를 6시간마다 교체합니다. hela 세포를 감염시키기 위해 M nine 배지에서 e coli oh 1 5 7 H seven 또는 EHEC를 준비하며, 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)는 hela 세포 1개당 EHEC 세포 100~200개로 설정합니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 느슨하게 부착된 공생 박테리아를 씻어냅니다. 시린지 펌프를 사용하여 OD 600이 약 0.1인 희석된 EHEC 현탁액 100 µL를 0.25 mL/h의 유속으로 아일랜드 내로 주입합니다.이후, EHEC이 공생 바이오필름에 존재하는 신호에 노출될 수 있도록 유동 없이 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 6시간 동안 장치를 배양합니다. 배양이 끝나면, 진공 펌프를 사용하여 진공을 형성함으로써 공생 박테리아 영역과 진핵 세포 영역을 분리하는 밸브를 열고, 6시간 동안 밸브를 열어 둡니다. 이를 통해 공생 박테리아 바이오필름 내의 HEC을 heela 세포에 노출시키며, 이어서 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 다시 6시간 동안 배양합니다.제조업체의 지침에 따라 준비된 장치에 live dead 염색약을 주입하십시오. helo 세포 생존율을 염색하기 위해, helo 세포 사멸 추정의 대조군으로서 1 mL 주사기를 사용하여 0.1 mL의 정지 용액을 장치의 진핵생물 영역에 주입하십시오. EHEC이 없는 경우, 이전의 세 단계를 반복하고 멸균된 무혈청 및 무항생제 DMEM 배지를 장치에 주입하십시오.EHEC 대신 Zeiss AIOt 200 M 형광 현미경을 사용하여 여러 위치의 이미지를 촬영하고, 최소 7곳 이상의 위치에서 얻은 이미지로부터 녹색 세포의 수를 세어 적색으로 표시된 사멸한 상피세포 중 녹색으로 표시된 살아있는 상피세포의 수를 추정합니다. 이제 트라이얼 층 미세유체 장치의 대표 이미지를 보여드리겠습니다. 이 이미지에서는 서로 다른 배양 영역을 나타내기 위해 불활성 식용 색소를 사용하였습니다.보라색 염료는 진핵세포 배양 영역을 나타내며, 녹색 염료는 공생 세균 바이오필름을 나타냅니다. 이 이미지에서 우리는 박테리아 영역의 보라색 염료가 주변의 노란색 염료와 뚜렷하게 구분되는 것을 통해 진핵세포 영역과 박테리아 영역을 서로 분리하여 유지하는 것이 가능함을 입증합니다. 여기서는 녹색 단백질을 발현하는 공생 세균 바이오필름에 적색 단백질을 발현하는 병원성 박테리아가 군집을 형성하는 모습이 나타나 있습니다.이 이미지에서 볼 수 있듯이, EHEC 및 공생 박테리아는 박테리아 바이오필름을 둘러싸고 있는 hela 세포와 구별됩니다. 지금까지 박테리아와 상피 세포의 공배양을 위한 건식 층 마이크로 장치를 조립하는 방법과 일반적으로 이러한 신호가 병원균의 군집화에 미치는 영향을 조사하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 장치 내의 모든 기포를 제거하고, 적절한 다중 세포 감염 농도로 이 병원균을 사용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이상입니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

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