Name: 안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 배우세요 미세유체 장치를 이용해 E. coli RP 4 37의 화학적 이동성을 정량화하는 방법을. 안정적인 농도 기울기에서 박테리아의 이동 패턴을 분석하여 생명공학 연구에 활용할 수 있습니다.

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1. 표준 SU - 8 석판술 1을 (이 동영상에 표시되지 않습니다)를 사용하여 실리콘 마스터의 제작. <ol><li> microfluidic 네트워크 및 chemotaxis 챔버를 포함하는 PDMS 금형을 fabricating위한 SU - 8 "마스터"(SU - 8 2025, MicroChem, 뉴턴, MA)를 만드는 표준 SU - 8 석판술 방법을 사용하십시오. 이러한 마스터 금형은 모든 microfabrication 시설 (; 예를 들어, 스탠포드 Microfluidics 주조에서 가공 수 있습니다 <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> 이전 PDMS의 복제, 마스터에서 PDMS의 쉬운 버전을 촉진하기 위하여 진공 소스에 연결된 건조기에 플루오로 실란 수증기에 SU - 8 마스터를 노출. 종이 타월로 플루오로 실란의 드롭을 추가 한 분 진공을 적용합니다. 진공을 제거하고 플루오로 실란의 증착을위한 30 분 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 닫힌 용기에 SU - 8 마스터 보관하십시오. </li></ol> 2. SU - 8 마스터에서 PDMS의 복제 성형 : 유체 층과 제어 계층은 SU - 8 마스터에서 PDMS의 복제 성형에 의해 만들어집니다. <ol><li> 10시 1분 WT에서 PDMS 사전 폴리머와 가교제를 섞습니다. 1 시간 (또는 기포가 PDMS 혼합물에서 제거되기 전까지)에 대한 dessicator의 비율과 데가스. </li><li> 배양 접시에있는 SU - 8 마스터를 놓고 조심스럽게 원하는 두께에 SU - 8 마스터 위에 PDMS 혼합물을 따라줘. </li><li> PDMS와 ° 두 시간 동안 C는 PDMS 치료 80에서 SU - 8 마스터 금형을 포함하고있는 배양 접시를 가열. </li><li> 제거 치료 PDMS - 다루는 열판에서 SU - 8 마스터와 SU - 8 마스터에서 PDMS 금형 껍질. 원하는 구조는 PDMS 금형에 포함됩니다. </li><li> 20 게이지 날이 엔드 바늘을 사용하여 그라데이션 생성기 및 세포 입구에 튜브에 대한 PDMS 금형의 펀치 구멍. </li></ol> 3. PDMS 장치의 결합 : <ol><li> 이소프로판올 및 질소 또는 공기 흐름과 건조와 유리 현미경 슬라이드를 청소합니다. </li><li> PDMS와 플라즈마 애셔에 산소 플라즈마에 유리 슬라이드를 쉽게받을 수 있습니다. </li><li> 유리 슬라이드 접촉에 PDMS 금형 가져와. 65 연락을 슬라이드 및 PDMS 금형을 가열 ° C 15 분. </li></ol> 4. PDMS 장치를 조립 <ol><li> 면도날을 사용하여 45에서 튜브를 잘라 ° 장치에 필요한 올바른 길이 각도. </li><li> 포셉를 사용하는 장치 (예, 콘센트)에 펀치 구멍에 튜브의 한쪽 끝을 넣습니다. </li><li> 포셉 사용하여 튜브의 다른 쪽 끝을에 뭉툭한 30 게이지 바늘을 삽입합니다. </li><li> 모든 나머지 구멍에 대해 단계 4.2를 반복합니다. </li><li> 주사기에서 공기 방울을 제거하기 위해 간병, 3mL 주사기에 chemotaxis 버퍼 (CB)의 1mL를 수집합니다. </li><li> 아울렛 튜브의 한쪽 끝을 바늘로 허브를 수정. </li><li> 바늘 허브에 CB를 추가하고 기포를 제거하기 위해 바늘 허브를 누릅니다. </li><li> 주사기의 끝을 약간 CB 출력을 밀어 공기를 트래핑하지 않고 바늘 허브에 3mL 주사기를 연결합니다. </li><li> 남아있는 모든 바늘 허브가 CB로 가득 때까지 장치를 통해 CB를 밀어. 이것은 기포의 과반수를 제거합니다. </li><li> chemoeffector 테스트되는 적절한 농도를 포함하는 CB 두 500μL 주사기를 입력합니다. 주사기 내용의 작은 방울을 밀어와 바늘 허브에있는 액체에있는 드롭을 감동 첨부하여 공기 방울 형성​​을 제거합니다. </li><li> 마찬가지로 세균의 입구에 CB를 포함한 주사기를 연결합니다. 세균이 장치에 도입하는 경우이 제거됩니다. </li></ol> 5. 높은 운동성이있는 E.의 성장 대장균 <ol><li> E.의 야간 문화를 성장 대장균 잡고 32 ° C에서 tryptone 국물 (TB) 20 ML에 플라스미드 GFP 표현과 RP437. 플라스미드를 유지하기 위해 항생제의 적절한 농도를 추가합니다. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 장치의 형광을 기반으로 박테리아를 검출 낮은 사본 플라스미드 pCM182을 사용합니다. E. 들어 대장균, 32에서 성장 문화 ° 운동성 높은 온도에서 낮은이므로 C가 높은 운동성 권장합니다. </li><li> ~ 0.05의 600nm에서 광학 밀도 250 ML Erlenmeyer 플라스크에 TB의 20 ML 문화를 예방하기 위해 야간 문화를 사용합니다. 32에서 흔들림과 문화를 성장 ° C.를 </li><li> 5 분 400 XG에서 저속 원심 분리하여 0.35 ~ 0.45의 OD 600에서 세포를 수확. </li><li> 채널의 중간에 예상되는 농도에서 chemoeffector를 포함하는 CB의 ~ 0.35의 OD 600 세포를 Resuspend. </li><li> GFP - 표현 살 세포 ~ 0.35의 OD 600에서 RFP - 라벨 죽은 세포를 추가합니다. 죽은 (적색) 세포는 모든 마이 그 레이션 흐름 효과로 인해 아니라는 것을 보장하기 위해 내부 통제으로 사용됩니다. </li></ol> 6. 모니터링 chemotaxis <ol><li> 세포 유입 바늘에서 CB의 일부를 제거허브. 세포 현탁액과 리필. </li><li> 부드럽게 resuspended 세포로 50μL 주사기를 입력합니다. 이 단계는 flagella가 가지각색 수로 천천히해야 할 필요와 운동성을 줄일 수 있습니다. </li><li> 으로 단계 단계 4.10에서 설명한 입구 - 바늘 허브에 50μL 주사기를 연결합니다. </li><li> 이미지 수집을위한 고속 카메라가 장착된 형광 현미경의 무대 장치를 놓습니다. 주사기 펌프에 유입 주사기를 (모두 500 μL 그라데이션 주사기와 50 μL 세포 주사기) 장소 및 기울기가 형성되고 세포가 튜브를 통해 흐르는 것을 이러한 흐름을 시작합니다. </li><li> 일단 세포 chemotaxis 챔버를 입력하기 전에 영상 안정화 시스템 ~ 20 분 기다립니다. </li><li> 챔버의 길이를 따라 다른 위치 (다른 노출 시간에 해당)에서 녹색 (라이브)과 빨간색 (죽은) 형광 이미지를 수집합니다. 일반적으로, 우리는 3 초 간격으로 각 지역 100 이미지를 수집합니다. </li></ol> 7. 데이터 분석 : 다음 단계는 모든 상용 이미지 분석 프로그램 (예, ImageJ, Metamorph)를 사용하여 또는 Matlab로 작성된 간단한 코드를 사용하여 수행할 수 있습니다. <ol><li> 이미지 (즉, 설정된 임계값 픽셀 강도 이하 임계값 이상의 강도를 모든 픽셀을 제거)의 배경 픽셀을 제거합니다. 분석이 최소화 소음. </li><li> 이미지의 중심을 결정하는 죽은 세포 (적색 형광)의 위치를​​ 사용합니다. 죽은 세포가 더 chemotaxis를 보여 없기 때문에,이 세포 chemotaxis 챔버를 입력하고 마이 그 레이션의 부재에서 검색된 될 위치를 나타냅니다. </li><li> 이미지에 살고있는 세포를 (녹색 형광) 찾습니다. </li><li> 채널로 이미지를 분할하고 각 채널에 살고있는 세포의 수를 결정합니다. 우리의 이전 작업 3에서 1,050 μm의 넓은 chemotaxis 챔버는 각 ~ 16 μm의 넓은 아르 64 개의 채널로 나뉘어되었다. </li><li> 단계를 모든 이미지에 대해 7.1 7.3를 반복하여 모든 이미지에 걸쳐 각 채널에 대한 전체 셀 개수 합계. 이것은 실험 기간 동안 각 채널에서 검색 전체 셀 개수를 제공합니다. </li><li> 고농도 (오른쪽)과 낮은 농도 (왼쪽)는 죽은 세포의 양쪽에있는 각 셀에가 +1과 -1의 배율을 할당 다음과 같이 마이 그 레이션의 방향을 나타내는 chemotaxis 파티션 계수 (CPC)를 계산 각각. 즉, 그라디언트를 아래로 이동 세포 -1 곱한하는 동안 구배가 1 곱한 것입니다 최대 마이 그 레이션 세포이다. 모든 곱한 값은 최대 추가하고 감지 세포의 총 숫자로 정상화됩니다. 예를 들어, 0.40의 클릭당 비용 (CPC) 값은 전체 세균의 40 % 이상 낮은 농도 측면 (즉, 더 많은 박테리아가 경사도를 이동 감지 것처럼 chemoeffector은 유인이다)보다 높은 농도쪽으로 이동했음을 나타냅니다. </li><li> 세포가 마이 그 레이션하는 거리에 비례 계수에 의해 각 채널에 무게 셀 개수를 다음과 같이 거리에 의해 세포의 마이 그 레이션, 여행 무게 chemotaxis 마이 그 레이션 계수 (CMC)를 계산합니다. 멀리 높은 농도 위치 (채널 64)로 이동 세포가 높은 농도 측면에 중간 이동 하나가 0.5의 가중치를 부여이지만, 하나의 가중치를 부여하고, 세포가 멀리로 이동합니다 낮은 농도의 위치는 -1에 의해 가중치입니다. 모든 가중 셀 카운트를 합계하여 CMC를 생성하는 세포의 숫자를 정상화. </li></ol> 대표 결과 3,4 : 우리가 사용한 microfluidic 장치 (그림 1A)은 E.의 chemotaxis를 조사하기 위해 여기에서 설명한 attractants (아스파르트산, autoinducer - 2)와 repellents (NiSO 4 인돌) 3,4의 그라디언트에서 대장균. prototypical chemotaxis 변형 5 E. 대장균 RP437 표현 GFP는 kanamycin - 살해 E.와 함께 사용했습니다 흐름 효과를 모니터링하는 빨간색 형광 단백질을 표현하는 대장균 TG1 세포. μFlow 장치를 형성 농도 기울기는 그림 1B에 표시됩니다. 셀 입구는 그것을 통해 어떤 흐름과 fluoresscein의 NG / ML이 장치에 설립되었습니다 0 100 안정적인 그라디언트가 있다고하지 않도록 뒤덮인했다. 장치를 통해 픽셀 강도는 플루오레신의 농도 프로파일을 결정하는 데 사용되었다. 데이터들은 chemotaxis 챔버를 입력하면 박테리아가 선형 그라디언트가 발생하는 것을 보여줍니다. 그림 2A와 B는 E.의 형광 이미지를 보여줍니다 아스파르트산 (0 100 μm의)와 NiSO 4 (0 225 μm의)의 기울기에 대한 응답으로 대장균 RP437 마이 그 레이션. 관찰된 이러한 표준 유인에 반응하고 구충제는 것을 예측할 수 있습니다. 그림 3A는 E.의 계량 분포를 보여줍니다 대장균 RP437 농도 기울기의 부재 (즉, 아스파르트산의 NULL 그라데이션)에, 동안그림 3B와 C는 아스파르트산 및 NiSO 4 그라디언트의 분포를 보여줍니다. 이러한 반응의 특이성 (즉, 마이 그 레이션의 편견)은 E.으로 분명하다 대장균 RP437 Δ 타르 변형 (즉, 아스파르트산 및 니켈을 감지 E. 대장균에서 사용되는 타르 chemoreceptor을 부족 변형)은 아스파르트산 또는 NiSO 4 농도 기울기의 존재에 마이 그 레이션에 편견을 설명하지 않습니다. 공간적 분포의 프로필에 확연히 경향도 계산 클릭당 비용 (CPC) 및 CMC의 가치와 일​​치하고 있습니다. E. 마이 그 레이션에 대한 클릭당 비용 (Max) 아스파르트산 또는 NiSO 4 그라디언트에서 대장균 RP437는 각각 0.33와 -0.33입니다. 해당 CMC 값은 각각 0.13와 -0.14입니다. E.과는 대조적으로, 클릭당 비용 (CPC) 및 CMC는 값 아스파르트산 또는 NiSO 4 그라디언트에서 대장균 RP437 Δ 타르 변형은 무시할 수 있습니다. 또한, 아스파르트산의 NULL 그라데이션의 클릭당 비용 (CPC) 및 CMC는 각각 0.03과 0.02,, 그리고 그라디언트의 부재에서 마이 그 레이션에 편견의 부족을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="그림 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1A"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="그림 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1B"> 그림 1. 장치의 약도와 농도 기울기. microfluidic chemotaxis 장치 (A) 도식 표현. 이 장치는 그라디언트 - 혼합 모듈 (20 X 100 X 18750 μm의)와 chemotaxis 관찰 모듈 (20 X 1050 X 11500 μm의)로 구성되어 있습니다. 장치를 입력 두 그라디언트 채널의 폭은 500 μm의 및 세균의 입구의 넓이가 50 μm의집니다. 삽입된 페이지는 신호 분자 (회색)과 그것에 대한 응답으로 마이 그 레이션 박테리아의 그라디언트를 묘사. 죽은 박테리아가 오픈 타원으로 표시됩니다 반면 라이브 세균은 탄탄한 타원으로 그려져있다. (B) 0과 100 NG / ML 플루오레신 사이의 농도 기울기는 장치에 생성하고 형광 현미경을 사용하여 몇 군데했다. 형광 이미지는 30 분 후 인수 및 이미지 분석에 의해 계량되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. E.의 Chemotaxis microfluidic 장치의 대장균 RP437. E. 대장균 RP437은의 구배에 노출되었다 (A) 000-100 μm의 L - aspartate 또는 (B) 0-225 장치 μm의 NiSO 4 사는 박테리아의 마이 그 레이션 (녹색) L - aspartate 방향이나 거리에서 니켈 30 분마다 2.5 초 몇 군데. 죽은 박테리아 (적색)은 장치의 흐름 효과에 대한 컨트롤을 역임했습니다. 이미지 분석 program3을 개발 자체를 사용하여 계량되었습니다. 표시된 데이터는 세 독립적인 실험의 대표 의사 색의 이미지입니다. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="그림 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3A"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="그림 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3B"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="그림 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3C"> 그림 3 : 표준 유인과 혐오감으로 마이 그 레이션 프로필 부량. 에 대한 응답으로 microfluidic 장치에 RP437의 공간적 분포 (A) 유니폼을 100 μm의 L - aspartate (예, 아니 그라데이션), aspartate의 (B) 0 100 μm의 기울기, 그리고 NiSO 4 (C) 0 225 μm의 기울기 . 죽은 세포의 분포는 실선으로 표시됩니다, RP437 세포의 분포는 점선으로 표시되며, RP437 EDA + Δ 타르 세포의 분포는 점선으로 표시됩니다. 표시된 데이터는 세 독립적인 실험을 위해 평균입니다.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

마오 외 5에서 설명한대로 chemotaxis 파티션 계수 (CPC) 및 chemotaxis 마이 그 레이션 계수 (CMC)을 계산하실 수 있습니다. 세포가 높은 농도 측면에서 감지되는 경우 낮은 농도 측면에서 감지 세포가 -1의 값을 주어진 반면, 그것은, 하나의 값을 주어집니다. 값이 최대 표현하고 클릭당 비용 (CPC)을 생성하는 세포의 총수로 나누어집니다. CPC (긍정적이거나 부정적인)의 신호는 마이 그 레이션의 방향을 (신호에서 방향 또는 거리) 제공합니다. 클릭당 비용 (CPC)은 세포가 유인 또는 혐오감을, 그것이 chemotaxis의 범위를 계량하지 않는 등 화학 물질에 반응하는지 여부를 나타냅니다 있지만. 이를 위해, 우리는의 거리에 따라 64 섹션 (세포 입구의 양쪽에 32)에 장치의 던졌다 박테리아의 공간적 분포 프로필을 나누어, 각 섹션에서 세포에 가중치를 지정하여 CMC를 계산 마이 그 레이션. 센터 (섹션 1과 64)에서 멀리 떨어져 섹션들은 최대 거리를 마이 그...

안정적인 농도 기울기에 박테리아 chemotaxis을 quantifying위한 microfluidic 장치

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis은 박테리아가 유인 화학 물질의 소스를 접근하거나 혐오감을 화학 물질의 소스를 피할 수 있습니다. 박테리아는 지속적으로 집중하는 현재의 농도를 비교하여 특정 chemoeffectors의 농도를 모니터 앞에서 몇 초를 발견했습니다. 이 비교는 운동의 순 방향을 결정합니다. 여러 경쟁 그라디언트는 종종 자연 속에서 공존하지만, 박테리아 chemotaxis를 조사하는 기존 방법은 attractants과 repellents의 농도 기울기에 대한 응답으로 마이 그 레이션을 quantifying위한 suboptimal 있습니다. 여기, 우리는 박테리아에 chemoeffectors의 정확하고 안정적​​인 농도 기울기를 제시하고 양적 적용된 그라디언트들의 반응을 조사하는 microfluidic chemotaxis 모델의 개발을 설명합니다. 이 장치는 원하는 절대 농도와 기울기 강도의 농도 기울기에 다양한는 쉽게 잘 퍼지는 혼합에 의해 생성하실 수 있습니다. 장치는 응답을 사용하여 증명<em&gt; 대장균</em&gt; RP437 아미노산과 니켈 이온의 그라디언트 수 있습니다.

이 프로토콜은 chemoeffectors의 안정적인 농도 기울기에 박테리아 chemotaxis 조사를위한 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

화학성(chemotaxis)을 통해 박테리아는 유인 화학 물질의 공급원으로 접근하거나 기피 화학 물질의 공급원을 피할 수 있습니다. 박테리아는 끊임없이 ...을 모니터링합니다.

E Coli RP 4 37을 정의된 공간적 농도 구배에 노출되는 화학주성 장치에 도입합니다. 챔버로 진입하는 세포들은 농도 구배의 중간 지점에 도달하게 됩니다. 신호가 유인 물질로 인식되는지 또는 기피 물질로 인식되는지에 따라, 박테리아는 농도 구배를 따라 빠르게 위 또는 아래로 이동합니다.안녕하세요, Texas A&M University의 분자 시스템 생명공학 연구실 및 화학공학과에서 온 Derek Engler입니다. 오늘은 미세유체 장치를 이용해 박테리아의 화학성(chemotaxis)을 조사하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 E. coli RP437이 황산니켈의 농도 구배에서 어떻게 이동하는지 연구합니다.그럼 시작해 보겠습니다. 유체층과 제어층은 SU-8 마스터로부터 Polymethyl SUBOXANE 또는 PDMS를 복제 성형하여 제작합니다. 이 절차를 시작하려면, PDMS 프리폴리머와 가교제를 10:1의 중량비로 혼합하십시오.기포가 제거될 때까지 데시케이터에서 혼합물을 1시간 동안 탈기합니다. PDMS 혼합물이 준비되면, 페트리 접시에 SU8 마스터를 놓고 그 위에 혼합물을 원하는 두께로 조심스럽게 붓습니다. PDMS와 SU8 마스터 몰드가 담긴 페트리 접시를 80 °C에서 2시간 동안 가열하여 PDMS를 경화시킵니다.2시간 후, 핫플레이트에서 경화된 PDMS로 덮인 SU-8 마스터를 제거하고 SU-8 마스터에서 PDMS 몰드를 떼어냅니다. 원하는 구조가 PDMS 몰드 내에 형성되어 있을 것입니다. 20게이지 뭉툭한 끝바늘(blunt end needle)을 사용하여 PDMS 몰드에 구멍을 4개 뚫어 구배 발생기(gradient generator), 세포 주입구 및 세포 배출구로 연결될 튜브를 삽입합니다. 이제 PDMS 장치를 결합하여 본딩할 준비가 되었습니다.먼저, 유리 현미경 슬라이드를 이소프로판올로 세척하고 Airstream으로 건조합니다. 다음으로, PDMS 몰드와 유리 슬라이드를 플라즈마 식각기(plasma etcher)에서 약 30초 동안 산소 플라즈마에 노출시킵니다. PDMS 몰드를 유리 슬라이드에 접촉시킵니다. 접촉된 슬라이드와 PDMS 몰드를 핫플레이트 위에서 65 °C로 15분 동안 가열합니다.PDMS 장치를 조립하려면, 면도날을 사용하여 현미경 설정에 따라 필요한 적절한 길이로 튜브를 45도 각도로 절단하십시오. 그런 다음 포셉을 사용하여 튜브의 한쪽 끝을 장치에 뚫린 4개의 구멍 중 하나에 삽입하십시오.둔탁한 30 gauge 바늘 허브를 튜브의 반대쪽 끝에 삽입합니다. 나머지 모든 구멍에 대해 튜브와 바늘 허브 삽입 과정을 반복합니다. 3 mL 주사기에 1 mL의 chemo taxes, 완충액 또는 CB를 채웁니다.주사기에서 공기를 제거하는 데 주의하십시오. 피펫을 사용하여 출구 바늘 허브에 CB를 추가하고, 바늘 허브를 가볍게 두드려 기포를 제거합니다. 3 mL 주사기 팁에서 CB를 소량 밀어낸 후, 공기가 유입되지 않도록 주사기를 바늘 허브에 연결하십시오.모든 남은 니들 허브가 CB로 채워질 때까지 장치에 CB를 밀어 넣습니다. 이렇게 하면 대부분의 기포가 제거됩니다. 다음으로, 테스트하려는 화학 효능제(chemo effector)가 적절한 농도로 포함된 CB를 500 µL 시린지 두 개에 채웁니다.시린지 내용물을 소량 밀어내어 바늘 허브에 맺힌 액체 방울에 접촉시켜 공기 방울 형성을 제거하고 시린지를 장착하여 운동성이 높은 박테리아를 준비합니다. 화학성(chemotaxis) 실험을 위해, 다음 날 32 °C에서 진탕 배양하며 GFP 발현 플라스미드가 포함된 e coli RP 4 37을 트립톤 브로스(tripton broth) 또는 TB에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 하룻밤 배양액을 사용하여 250 mL 삼각 플라스크에 담긴 20 mL TB 배지에 접종하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)가 약 0.05가 되도록 합니다.세포의 OD 600이 약 0.35에서 0.45가 되었을 때, 32 °C에서 진탕 배양하십시오. 저속 원심분리를 통해 세포를 수확한 후, 채널 중앙에서 예상되는 농도의 화학 유인 물질(chemo effector)이 포함된 CB에 세포를 재현탁하여 OD 600이 약 0.35가 되도록 맞춥니다. 마지막으로, GFP를 발현하는 살아있는 세포에 OD 600이 약 0.35인 RFP 표지 사멸 세포를 추가합니다.이 사멸 세포들은 이동이 유동 효과로 인한 것이 아님을 확인하기 위한 내부 대조군으로 사용됩니다. 이제 세포 현탁액을 화학주성 실험을 위해 미세유체 장치에 주입할 준비가 되었습니다. 화학주성 실험을 시작하려면, 세포 주입구 바늘 허브에서 CB의 일부를 제거하고 세포 현탁액으로 채우십시오.부유시킨 세포를 50 µL 시린지에 조심스럽게 채웁니다. 편모가 전단되어 운동성이 감소할 수 있으므로 이 과정은 천천히 수행하십시오. 시린지 내용물을 소량 밀어내어 그 방울을 니들 허브의 액체에 접촉시킨 후 시린지를 연결하는 방식으로, 앞서 보여드린 것과 같이 50 µL 시린지를 입구 니들 허브에 부착합니다. 그 다음 이미지 획득을 위한 고속 카메라가 장착된 형광 현미경의 스테이지 위에 장치를 배치합니다.두 개의 입구 시린지를 시린지 펌프에 장착하고, 그래디언트가 형성되어 세포가 튜브를 통해 흐르도록 유량을 시작합니다. 세포가 화학주성 챔버에 진입하면 시스템이 안정화될 때까지 약 20분 동안 기다립니다. 이미징을 수행하기 전, 챔버 길이를 따라 서로 다른 위치에서 생존 세포(녹색)와 사멸 세포(적색)의 형광 이미지를 수집합니다.일반적으로 각 위치에서 3초 간격으로 100장의 이미지를 수집합니다. 획득한 형광 이미지는 Image J 또는 metamorph와 같이 상업적으로 이용 가능한 이미지 분석 프로그램이나 MATLAB으로 작성된 간단한 코드를 사용하여 분석할 수 있습니다. 본 예시에서는 MATLAB 코드를 사용하겠습니다.설정된 임계값 픽셀 강도를 통해 이미지의 배경 픽셀을 제거하고, 임계값보다 강도가 낮은 모든 픽셀을 제거하는 것으로 시작하십시오. 이는 노이즈를 최소화합니다. 분석 시에는 사멸한 세포의 위치를 사용하여 이미지의 중심을 결정하십시오.이는 세포가 화학주성 챔버로 진입한 위치이자, 이동이 없을 때 세포가 검출될 위치를 나타냅니다. 다음으로, 이미지에서 살아있는 세포를 찾아 이미지를 채널로 나누고 각 채널 내의 살아있는 세포 수를 결정합니다. 이전 연구에서 10 50 µm 너비의 화학주성 챔버를 각각 약 16 µm 너비의 64개 채널로 나누었습니다.모든 이미지에 대해 이 단계들을 반복한 후, 모든 이미지에 걸쳐 각 채널의 전체 세포 수를 합산합니다. 이를 통해 실험 기간 동안 각 채널에서 검출된 총 세포 수를 구할 수 있습니다. 이동 방향을 나타내는 화학주성 분배 계수(chemo taxes partition coefficient) 또는 CPC를 계산하십시오.다음 단계들을 수행하여, 사멸된 세포의 고농도(우측) 영역에 위치한 각 세포에는 +1의 곱셈 인자를, 저농도(좌측) 영역에 위치한 각 세포에는 -1의 곱셈 인자를 각각 할당합니다. 모든 곱해진 값들을 합산한 후, 검출된 전체 세포 수로 나누어 정규화합니다. 이를 통해 세포가 이동한 거리에 따라 세포 이동 가중치를 산출하는 화학주성 이동 계수(chemo taxes, migration coefficient 또는 CMC)를 계산합니다.가장 높은 농도 위치인 채널 64로 이동하는 세포에는 가중치 계수 +1을 부여하고, 고농도 쪽으로 절반 정도 이동한 세포에는 가중치 계수 +0.5를 부여하며, 가장 낮은 농도 위치로 이동하는 세포에는 가중치 -1을 부여합니다. 모든 가중 세포 수의 합계를 구한 후 이를 세포 수로 정규화하여 CMC를 산출합니다.이 그래프는 플루오레세인 이소티오시아네이트를 사용하여 미세유체 장치 내에 형성된 선형 농도 구배 또는 프로파일을 보여줍니다. 이 그림에서는 청색과 황색 색소를 사용하여 농도 구배의 형성을 입증하였습니다. 세포 입구는 CA로 설정하여 흐름이 없도록 하였으며, 그 결과 청색과 황색 사이의 다양한 색상 범위가 형성된 것을 확인할 수 있습니다.여기 e coli RP 4 37을 장치 내의 0에서 100 µM L aspartate 또는 0에서 225 µM nickel sulfate 농도 구배에 노출시킨 대표적인 화학성 분석 실험의 가색 이미지들이 있습니다. L aspartate를 향해 또는 nickel로부터 멀어지는 살아있는 녹색 박테리아의 이동을 30분 동안 2.5초 간격으로 촬영하였습니다. 빨간색으로 표시된 죽은 박테리아는 장치 내 유동 효과에 대한 대조군으로 사용되었습니다.구배가 없는 상태에서 마이크로유체 장치 내 RP 4 37의 공간적 분포를 아스파르테이트 구배 및 황산니켈 구배에 대한 반응과 비교하여 이 그래프에 나타내었습니다. 지금까지 황산니켈 구배에서 e coli RP 4 37의 화학성(chemotaxis)을 모니터링하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 높은 운동성을 가진 하위 집단을 활용할 수 있도록 세포의 볼텍싱(vortexing)을 최소화하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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Biology

생물학

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