안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

E Coli RP 4 37은 정의된 공간 농도에 노출되는 화학주성 장치에 도입됩니다. 챔버로 유입되는 gradients cell은 농도 gradient의 중간점을 만나게 됩니다. 신호가 유인물질로 인식되는지 아니면 기피제로 인식되는지에 따라 박테리아는 농도 구배를 빠르게 위아래로 움직입니다.

안녕하세요, 저는 텍사스 A 및 M 대학의 분자 시스템 생명 공학 연구소와 화학 공학과의 Derek Engler입니다. 오늘은 미세유체 장치에서 세균성 화학세를 조사하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 대장균 RP 4 37이 황산니켈의 농도 구배에서 어떻게 이동하는지 연구합니다.

시작하겠습니다. 유체층과 제어층은 SU eight 마스터의 폴리메틸 수복산 또는 PDMS의 복제 성형으로 만들어집니다. 이 절차를 시작하려면 PDMS 프리 폴리머와 가교제를 10:1 중량 비율로 혼합합니다.

기포가 제거될 때까지 1시간 동안 건조제에서 혼합물의 가스를 제거합니다. PDMS 혼합물이 준비되면 SU eight master를 페트리 접시에 넣고 혼합물을 SU eight master 위에 원하는 두께의 Heat까지 조심스럽게 붓습니다. PDMS를 경화시키기 위해 섭씨 80도에서 2시간 동안 PDMS와 SU 8 마스터 몰드를 포함하는 페트리 접시.

2시간 후 핫 플레이트에서 경화된 PDMS 덮개 SSU 8 마스터를 제거하고 SU 8 마스터에서 PDMS 금형을 벗겨냅니다. 원하는 구조는 그래디언트 생성기, 셀 입구 및 셀 배출구에 대한 튜브를 위해 PDMS 금형에 20게이지 무딘 끝 바늘 펀치 4개의 구멍을 사용하여 PDMS 금형에 내장됩니다. 이제 PDMS 장치를 조립하여 PDMS 장치를 결합할 준비가 되었습니다.

먼저 이소프로판올로 유리 현미경 슬라이드를 청소하고 Airstream으로 사용해 보십시오. 다음으로, PDMS 몰드와 유리 슬라이드를 플라즈마 에칭기의 산소 플라즈마에 약 30초 동안 노출시킵니다. PDMS 금형을 유리 슬라이드와 접촉시키고, 접촉된 슬라이드와 PDMS 금형을 핫 플레이트에서 15분 동안 섭씨 65도로 가열합니다.

PDMS 장치를 조립하려면 면도날을 사용하여 현미경 설정에 따라 필요한 올바른 길이로 튜브를 45도 각도로 절단합니다. 그런 다음 집게를 사용합니다. 튜브의 한쪽 끝을 장치에 뚫린 4개의 구멍 중 하나에 삽입합니다.

뭉툭한 30 게이지 니들 허브를 튜브의 다른 쪽 끝에 삽입합니다. 나머지 모든 구멍에 대해 튜브와 니들 허브를 반복적으로 삽입합니다. 3밀리리터 주사기에 1밀리리터의 화학세, 완충액 또는 CB를 로드합니다.

주사기에서 공기를 제거하도록 주의하십시오. 피펫을 사용하여 배출구 바늘 허브에 CB를 추가하고 바늘 허브를 두드려 기포를 제거합니다. 3밀리리터 주사기 끝에서 CB를 약간 밀어내고 주사기를 바늘 허브에 연결합니다.공기를 가두지 않습니다.

남아 있는 모든 바늘 허브가 cb로 채워질 때까지 장치를 통해 CB를 밀어 넣습니다. 이렇게 하면 대부분의 기포가 제거됩니다. 다음으로, 테스트 중인 화학 효과기의 적절한 농도를 포함하는 CB로 2개의 500마이크로리터 주사기를 채웁니다.

주사기 내용물의 작은 방울을 밀어내고 바늘 허브에 있는 액체의 방울을 만지고 주사기를 부착하여 기포 형성을 제거하여 운동성이 높은 박테리아를 준비합니다. 화학주성 실험의 경우, GFP 발현으로 대장균 RP 4 37을 하룻밤 동안 배양하고, 트립톤 브로스 또는 TB에 플라스미드를 넣고, 다음날 흔들면서 섭씨 32도에서 배양합니다. 하룻밤 배양을 사용하여 250ml 삼각 플라스크에 20ml의 TB 배양물을 600나노미터의 광학 밀도로 약 0.05의 광학 밀도를 접종합니다.

세포가 약 0.35 내지 0.45의 OD 600에 있을 때 흔들면서 섭씨 32도에서 배양액을 성장시킵니다. 저속 원심분리, resus 현탁 세포를 통해 채널 중간에서 예상되는 농도로 화학 효과기를 함유하는 CB에서 약 0.35의 OD 600으로 이들을 수확합니다. 마지막으로, 약 0.35의 no D 600에서 RFP 표지된 죽은 세포를 살아있는 세포를 발현하는 GFP에 추가합니다.

이러한 죽은 세포는 모든 이동이 흐름 효과로 인한 것이 아닌지 확인하기 위한 내부 통제가 될 것입니다. 이제 세포 현탁액을 화학주성 실험을 위해 미세유체 장치에 로드할 준비가 되었습니다. 화학주성 실험을 시작하려면 세포 주입구 니들 허브 리필에서 세포 현탁액으로 CB의 일부를 제거합니다.

50마이크로리터 주사기에 재현탁된 세포를 부드럽게 채웁니다. 편모는 깎일 수 있으므로 천천히 진행하면 운동성이 감소할 수 있습니다. 앞과 같이 50마이크로리터 주사기를 주입식 바늘 허브에 부착하여 주사기 내용물을 작은 방울 떨어뜨려 바늘 허브의 액체에 떨어뜨린 후 주사기를 부착한 후 이미지 획득을 위한 고속 카메라가 장착된 형광 현미경의 스테이지에 장치를 배치합니다.

두 주사기를 모두 주사기 펌프에 넣고 그래디언트가 형성되고 세포가 튜브를 통해 흐르도록 흐름을 시작합니다. 세포가 화학요법 과세실에 들어가면 시스템이 안정화될 때까지 약 20분 동안 기다립니다. 이미징 전에 챔버 길이를 따라 다양한 위치에서 살아있는 녹색 및 죽은 빨간색 형광 이미지를 수집합니다.

일반적으로 각 위치에서 3초 간격으로 100개의 이미지를 수집합니다. 획득한 형광 이미지는 Image J 또는 metamorph와 같은 상용 이미지 분석 프로그램을 사용하거나 matlab으로 작성된 간단한 코드를 사용하여 분석할 수 있습니다. 이 예제에서는 MATLAB 코드를 사용하겠습니다.

먼저 이 설정된 임계값 픽셀 강도를 통해 이미지의 배경 픽셀을 제거하고 임계값보다 강도가 낮은 모든 픽셀을 제거합니다. 이것은 소음을 최소화합니다. 분석에서 죽은 세포의 위치를 사용하여 이미지의 중심을 결정합니다.

이것은 세포가 화학주성 챔버로 들어간 위치와 이동이 없을 때 세포가 검출되는 위치를 나타냅니다. 다음으로, 이미지에서 살아있는 세포를 찾고, 이미지를 채널로 나누고, 각 채널의 살아있는 세포의 수를 결정합니다. 이전 연구에서는 10,50마이크로미터 너비의 화학요법 세금 챔버를 각각 약 16마이크로미터 너비의 64개 채널로 나눴습니다.

모든 이미지에 대해 이러한 단계를 반복한 후 모든 이미지에서 각 채널에 대한 전체 셀 중 일부가 계산됩니다. 이를 통해 실험 기간 동안 각 채널에서 검출된 총 세포 수를 알 수 있습니다. 화학 세금, 분배 계수 또는 CPC를 계산하며, 이는 마이그레이션 방향을 나타냅니다.

다음 단계를 수행하여 사체 세포의 고농도 또는 우농도 및 저농도 또는 왼쪽에 각각 위치한 각 세포에 플러스 1과 마이너스 1의 승수를 할당합니다. 곱한 값을 모두 더하고 감지된 셀의 총 수로 정규화합니다. 화학요법 세금, 이동 계수 또는 CMC를 계산하며, 이는 이동한 거리에 따라 세포의 이동에 가중치를 부여합니다.

가장 먼 고농도 위치 채널(64)로 이동하는 세포에는 플러스 1의 가중치 계수가 부여되는 반면, 더 높은 농도 쪽으로 중간으로 이동하는 세포에는 플러스 0.5의 가중치 계수와 세포가 부여됩니다. 가장 먼 저농도 위치로 이동하면 마이너스 1의 가중치가 부여됩니다. 모든 가중 셀 중 일부는 CMC를 생성하기 위해 세포 수로 정규화됩니다.

이 그래프는 플루오레세인 이소티오시아네이트를 사용하여 미세유체 장치에서 형성된 선형 농도 구배 또는 프로파일을 보여줍니다. 농도 구배의 형성은 파란색과 노란색 염료를 사용하여 이 그림에서 입증됩니다. 셀 유입구는 CA로 하여 유류가 없었으며, 파란색과 노란색 사이의 다양한 색상이 형성되는 것을 볼 수 있습니다.

다음은 대장균 RP 4 37이 장치에서 0 - 100 마이크로몰 L 아스파르테이트 또는 0 - 225 마이크로몰 니켈 설페이트의 구배에 노출된 대표적인 화학주성 실험의 유사색 이미지입니다. 살아있는 녹색 박테리아가 알 아스파르테이트로 또는 니켈에서 멀어지는 이동을 30분 동안 2.5초마다 이미지화했습니다. 빨간색으로 표시된 죽은 박테리아는 장치의 흐름 효과를 제어하는 역할을 했습니다.

구배가 없는 상태에서 미세유체 장치에서 RP 4 37의 공간 분포는 아스파르테이트 구배와 황산니켈 구배에 대한 응답과 비교하여 이 그래프에 나와 있습니다. 방금 황산니켈 그라데이션에서 대장균 RP 4 37의 화학세를 모니터링하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 높은 운동성 하위 집단을 사용할 수 있도록 세포의 와류를 최소화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.